Медицинская микробиология, вирусология и иммунология

Для экспресс-метода определения ферментативной активности микроорганизмов применяются микротестсистемы и система индикаторных бумажек (СИБ). Микротестсистема представляет собой контейнер из прозрачного полистирола, состоящий из нескольких ячеек. Ячейки содержат высушенные пит среды с углеводами и индикаторами рн. В каждую ячейку засевают взвесь культуры бактерий определенной густоты. В контрольные ячейки наливают физ. раствор. Результат учитывают после 3-4-часовой инкубации в термостате по изменению цвета индикатора.

Системы индикаторных бумажек (СИБ) для идентификации семейства энтеробактерии представляют собой диски или полоски хроматографической бумаги, покрытой защитной пленкой из поливинилового спирта и содержащей определенный субстрат и индикатор. В пробирке с физиологическим или буферным раствором вносят полную петлю исследуемой культуры или каплю густой микробной взвеси, затем обожженным пинцетом помещают в диски. В контрольные пробирки культуру бактерий не вносят. Результат учитывают по изменению цвета индикатора. Для определения сероводорода диск помещают в пробирку на поверхность МПА, засеянного уколом, что позволяет одновременно определить подвижность. Во всех пробирках учитывают предварительный результат в тот же день и окончательный -- через восемнадцать -- двадцать четыре часа. Оксидазная активность определяется путем растирания культуры на индикаторной бумажке через 30-60 секунд.

микробиология бактерия вирус инфекция

27. Выделение чистых культур аэробных и анаэробных бактерий. Перечислите принципы и методы получения изолированных колоний аэробов. Методы выделения чистых культур анаэробов. Описать по дням метод Вейнберга

Культивирование и выделение чистых культур аэробных бактерий

Для культивирования микроорганизмов необходимы определенные условия: температура, аэробные или анаэробные условия.

Температура должна быть оптимальной для данного вида. Большинство патогенных бактерий размножаются при 37°С. Однако для некоторых видов оптимальной является более низкая температура, что связано с особенностями их экологии. Так, для палочки чумы, естественным местом обитания которой являются грызуны в период зимней спячки, оптимум температуры составляет 28°С, как и для лептоспир, для палочки ботулизма - 28°С-35°С.

Кроме оптимальной температуры, для культивирования микроорганизмов, в зависимости от вида, необходима аэробность или анаэробность среды.

Для того, чтобы изучить морфологию, Культуральные, биохимические и другие свойства микробов, необходимо получить чистую культуру. Обычно культурой микробов называют скопление их на питательной среде в виде помутнения, придонного (пристеночного) роста или пленки на поверхности жидкой среды или колоний на плотной среде. Отдельная колония образуется из одной микробной клетки. Чистая культура - это культура микробов одного вида, полученная из одной колонии.

В лабораториях для различных исследований применяют определенные известные штаммы микробов. Штамм - это чистая культура микробов, полученная из определенного источника, в определенное время, обладающая известными свойствами. Как правило, штаммы микробов обозначают определенным номером. Например, штамм Staphylococcus aureus 209P применяется для определения активности пенициллина.

Выделение чистых культур аэробов занимает, как правило, три дня и производится по следующей схеме:

1-й день - микроскопия мазка из исследуемого материала, окрашенного (обычно по Граму) - для предварительного ознакомления с микрофлорой, что может быть полезным в выборе питательной среды для посева. Затем посев материала на поверхность застывшего питательного агара для получения изолированных колоний. Рассев можно произвести по методу Дригальского на три чашки Петри с питательной средой. Каплю материала наносят на первую чашку и распределяют шпателем по всей чашке. Затем этим же шпателем распределяют оставшуюся на нем культуру на второй чашке и таким же образом - на третьей. Наибольшее количество колоний вырастет на первой чашке, наименьшее - на третьей. В зависимости от того, сколько было микробных клеток в исследуемом материале, на одной из чашек вырастут изолированные колонии.

Такого же результата можно достигнуть, произведя рассев на одной чашке. Для этого делят чашку на четыре сектора. Исследуемый материал засевают бактериологической петлей штрихами на первом секторе, затем, прокалив и остудив петлю, распределяют посев из первого сектора во второй и таким же образом последовательно в третий и четвертый сектор. Из отдельных микробных клеток после суточного инкубирования в термостате образуются изолированные колонии.

2-й день - изучение колоний, выросших на чашках, описание их. Колонии могут быть прозрачными, полупрозрачными или непрозрачными, они имеют различные размеры, округлые правильные или неправильные очертания, выпуклую или плоскую форму, гладкую или шероховатую поверхность, ровные или волнистые, изрезанные края. Они могут быть бесцветными или иметь белый, золотистый, красный, желтый цвет. На основании изучения этих характеристик выросшие колонии разделяются на группы. Затем из исследуемой группы отбирают изолированную колонию, готовят мазок для микроскопического исследования с целью проверки однородности микробов в колонии. Из этой же колонии производят посев в пробирку со скошенным питательным агаром.

3-й день - проверка чистоты культуры, выросшей на скошенном агаре путем микроскопии мазка. При однородности исследуемых бактерий выделение чистой культуры можно считать законченным.

Для идентификации выделенных бактерий изучаются культураль-ные признаки, то есть характер роста на жидких и плотных питательных средах. Например, стрептококки на сахарном бульоне образуют придонный и пристеночный осадок, на кровяном агаре - мелкие, точечные колонии; холерный вибрион образует пленку на поверхности щелочной пептонной воды, а на щелочном агаре - прозрачные колонии; палочка чумы на питательном агаре образует колонии в виде «кружевных платочков» с плотным центром и тонкими волнистыми краями, а в жидкой питательной среде - пленку на поверхности, а затем -нити, отходящие от нее в виде «сталактитов».

Культивирование и выделение чистых культур анаэробных бактерий

Для культивирования анаэробов необходимо понизить окислительно-восстановительный потенциал среды, создать анаэробиоз путем удаления кислорода физическими, химическими или биологическими методами.

К физическим методам можно отнести:

1) механическое удаление воздуха с помощью насоса из анаэ-ростата, в котором помещают чашки с посевами. Одновременно можно заменить воздух индифферентным газом: азотом, водородом, углекислым газом.

2) выращивание в среде, содержащей редуцирующие вещества. Среда Китта-Тароцци - это сахарный бульон с кусочками печени или мяса. Глюкоза и кусочки органов обладают редуцирующей способностью. Среду заливают сверху слоем вазелинового масла, чтобы преградить доступ кислорода воздуха.

3) Наиболее простой, но менее надежный способ - выращивание в глубине высокого столбика сахарного агара.

Химические методы заключаются в том, что чашки с посевами анаэробов ставят в герметически закрытый эксикатор, куда помещают химические вещества, например, пирогаллол и щелочь, реакция между которыми идет с поглощением кислорода.

Биологический метод основан на одновременном выращивании анаэробов и аэробов на плотных питательных средах в чашках Петри, герметически закрытых после посева. Вначале кислород поглощается растущими аэробами, а затем начинается рост анаэробов.

Выделение чистой культуры анаэробов начинают с накопления анаэробных бактерий путем посева на среду Китта-Тароцци. В дальнейшем получают изолированные колонии одним из двух способов:

1) посев материала производят путем смешивания с расплавленным теплым сахарным агаром в стеклянных трубках. После застывания агара в глубине его вырастают изолированные колонии, которые извлекают путем распила трубки и пересевают на среду Китта-Тароцци (способ Вейнберга);

2) посев материала производят на чашки с питательной средой и инкубируют в анаэростате. Выросшие на чашке изолированные колонии пересевают на среду Китта-Тароцци (способ Цейсслера).

28. Влияние внешней среды на микроорганизмы. Влияние физических факторов: температуры, лучистой энергии, высушивания. Метод лиофильного высушивания

1. Находясь во взаимосвязи с различными объектами окружающей среды, микробы постоянно подвергаются ее воздействию.

2. На микроорганизмы оказывают влияние факторы внешней среды:

3. 1) физические (температура, высушивание, излучения, ультразвук, осмотическое давление);

4. 2) химические (различные вещества):

3) биологические (другие виды микробов и вирусы).

Температура. Следует различать 1) температурные условия, при которых микроорганизмы растут и размножаются и 2) температурные границы, при которых микроорганизмы остаются живыми. Понятно, что во втором случае диапазон температур шире.

1) В зависимости от температурных условий, которые требуют микроорганизмы для своего роста и размножения, различают три группы: психрофилы, растущие при низкой температуре, мезофилы - при средней, и термофилы - при высокой температуре

Для психрофилов оптимальная температура для роста 10-15°С. минимальная 0-5°С, максимальная 25-30°С. Большинство из них свободноживущие и паразиты холоднокровных животных, по есть и патогенные для человека, например, иерсинии, псевдомонады. Они размножаются при температуре бытового холодильника и более вирулентны при низких температурах.

Мезофилы размножаются преимущественно в организме теплокровных животных и человека. Оптимальная температура для их роста 30-37°С, максимальная 43-45°С, минимальная 15-20°С. Большинство патогенных микроорганизмов относятся к мезофилам. В окружающей среде они обычно не размножаются, но могут сохраняться живыми.

Для термофилов оптимальная температура для роста 50-60°С, минимальная равна 45°С максимальная 90°С. Термофильные бактерии живут в юрячей воде гейзеров. Они не размножаются в организме человека.

2) Температурные зоны гибели микроорганизмов шире, чем температуры, при которых они могут расти.

Микроорганизмы более чувствительны к высоким температурам, при которых наступает их гибель вследствие свертывания белков и повреждения ферментов. Вегетативные формы бактерии погибают при 60-80°С в течение часа, при 100°С - через 1 минуту. Споры бактерий устойчивы к 100°С, например, споры палочек столбняка и ботулизма выдерживают кипячение в течение нескольких часов. Для того, чтобы убить споры, создают температуру сухого жара 160-170°С, пара под давлением 120-134°С. Высокие температуры применяют при стерилизации - обеспложивании различных материалов.

К низким температурам микроорганизмы более устойчивы. Многие из них переносят замораживание. Холерный вибрион, сальмонеллы, кишечная палочка могут сохраняться во льду. Особенно устойчивы к низким температурам споры бактерий и вирусы. В то же время есть виды микробов, не переносящих температуры ниже 20°С: менингококки, гонококки, возбудители коклюша, сифилиса.

Высушивание. Вода необходима для нормальной жизнедеятельности микробов, так как питательные вещества поступают в клетку в растворенном виде. При недостатке воды рост микробов прекращается, хотя некоторые их них остаются живыми в течение какого-то времени. Чувствительны к высушиванию менингококки, гонококки, возбудители сифилиса, коклюша, гриппа; устойчивы стафилококки, возбудитель туберкулеза. Наиболее устойчивы споры бактерий, так как вода в них находится в связанном состоянии. Для сохранения живых микроорганизмов применяют метод лиофилизации - высушивание под вакуумом из замороженного состояния. Лиофилизированные живые культуры микроорганизмов, вакцины, биопрепараты в течение ряда лет сохраняются, не изменяя своих свойств.

Действие излучений. Ионизирующая радиация - гамма-излучение радиоактивных веществ и электроны высоких энергий - губительно действуют на микроорганизмы, хотя смертельные дозы для них выше, чем для животных и растений. Ионизирующие излучения применяют для стерилизации одноразовых пластиковых шприцев и посуды, питательных сред, лекарственных препаратов.

Неионизирующие излучения - ультрафиолетовые лучи - повреждают микроорганизмы в большей степени, чем животных и растения. УФ-лучи повреждают геном микробных клеток, что приводит их к гибели. Для обеззараживания воздуха в лечебных учреждениях и в микробиологических лабораториях применяются бактерицидные лампы ультрафиолетового излучения.

Ультразвук при определенной частоте вызывает разрушение структуры микробных клеток вследствие образования кавитационных полостей и может применяться как метод обработки пищевых продуктов.

Осмотическое давление, его постоянство, имеет большое значение для жизни микробов. При повышении или понижении осмотического давления происходит разрыв клеточной мембраны и гибель клеток. Повышенные концентрации солей задерживают развитие микроорганизмов, особенно гнилостных, что используется для сохранения впрок пищевых продуктов: овощей, грибов, рыбы, мяса. На том же принципе основано применение концентрированных растворов сахара в варенье, сиропах. Концентрированные растворы лекарственных средств растительного происхождения являются более стойкими сравнительно с разведенными растворами.

Высокое атмосферное давление не оказывает значительного действия на микроорганизмы.

Влияние химических факторов

Химические вещества, оказывающие антимикробное действие, применяются для дезинфекции - от des (французской приставки, означающей отрицание) и inficere (лат. - заражать). С помощью дезинфекции производится уничтожение возбудителей инфекционных болезней на зараженных объектах внешней среды.

Дезинфицирующие вещества являются общетоксическими ядами, в отличие от химеотерапевтическнх средств и антибиотиков, оказыва-ющих избирательное действие на микроорганизмы. Механизм действия дезинфицирующих веществ в основном заключастся в нарушении физико-химической структуры микробной клетки

Окислители (хлор и его соединения, вещества, содержащие йод, перекись водорода) обладают повышенной способностью окислять органические соединения в микробной клетке, что приводит к ее гибели.

Вещества, свертывающие белок (фенол, крезол, гексахлорофен, лизол, спирты, соли тяжелых металлов, например, сулема), проникая в микробную клетку, вступают в соединение с ее белками, денатурируют их и таким образом нарушают жизненные функции микроорганизма.

Детергенты (поверхностно-активные вещества (ПАВ)) - вещества, обладающие высокой поверхностной активностью, моющим, а многие из них и антимикробным действием - мыла, моющие средства. Высокой активностью обладают четвертичные аммониевые основания (ЧАО), вызывающие повреждение клеточной стенки бактерий, не проникая внутрь клетки. Некоторые металлы в незначительных количествах обладают выраженным антимикробным действием (серебро, медь, золото и другие). Объясняется это тем, что они выделяют в воду ноны Такое явление называют олигодинамическим действием (греч. oligos - малый). Достаточно ничтожною количества ионов в жидкости, чтобы они концентрировались на поверхности микробов и, изменив ее заряд с "-" на "+", оказывали антимикробное действие.

Выбор способа дезинфекции зависит от биологичсских свойств микроба и от той среды, в которой он находится. Например, сулема мало пригодна для дезинфекции белковых субстратов, таких как гной. кровь, мокрота. Под влиянием сулемы происходит свертывание белков, и свернувшийся белок предохраняет микробов от действия дезин-фектанта. Этиловый спирт используют для обеззараживания рук, различных предметов, для консервации биологических объектом. Наиболее выражено бактерицидное действие 70%-ного спирта, поскольку чистый спирт вызывает свертывание поверхностных белков бактерий и не проникает внутрь клетки.

Значительным бактерицидным действием обладает гексахлорофен, причем грамположительные кокки более чувствительны к нему, чем грамотрицательнве палочки. Гексахлорофен применяется для обеззараживания кожи в виде мыла, содержащею 2-5% этого вещества; для санации полости носа в виде мази, содержащей 1%, для санации носоглотки путем орошения с целью борьбы со стафилококковым носитель-cibom - 0,1%-ный раствор.

Влияние биологических факторов

Микроорганизмы в природе являются составной частью биоценоза, развиваясь совместно с растениями, животными, другими видами бактерий, грибов, вирусов. Взаимоотношения различных микроорганизмов между собой могут быть взаимовыгодными, например, при совместном культивировании дрожжей к молочнокислых бактерий они развиваются лучше, чем каждый в отдельности. Возможна стимуляция размножения одного микроорганизма другим. Например, размножение палочки чумы усиливается в присутствии сарцин. Во многих случаях один вид микробов в результате своей жизнедеятельности создает благоприятные условия для развития другого вида. Например, развитие анаэробов в почве невозможно без аэробов, которые поглощают кислород почвы.

В процессе эволюции у микробов выработались также антагонистические отношения. Молочнокислые бактерии являются антагонистами гнилостных микробов, бактерий дизентерии. Некоторые микроорганизмы вырабатывают вещества, угнетающие и убивающие микробов других видов, так называемые бактериоцины.

Явления антагонизма используются в медицине с целью получения антибиотков и создания препаратов для бактериотерапии.

29. Понятие о стерилизации, дезинфекции, асептике, антисептике. Методы стерилизации и их характеристика: аппараы, действующее начало, режим стерилизации, стерилизуемые объекты

Асептика - комплекс мероприятий, направленных на предупреждение попадания микробов в рану, или в пробирку с питательной средой, в ампулу с лекарственным средством и т.д.

Антисептика - способ обеззараживания ран, операционного поля, рук хирурга, а также воздействие на инфекцию в организме пациента с помощью химических веществ - антисептиков.

Дезинфекция - уничтожение патогенных микробов в окружающей среде и различных объектах с целью прервать путь передачи и распространения инфекционного заболевания. Для дезинфекции используют химические вещества, лучевые и другие воздействия.

Стерилизация - процесс, направленный на полное уничтожение всех микроорганизмов в каком-либо объекте. Для стерилизации используют физические, химические методы и их сочетание.

К физическим способам относятся: стерилизация высокой температурой, УФ-облучением, ионизирующим излучением, ультразвуком, фильтрованием через бактериальные фильтры.

Наиболее часто применяют следующие методы:

Стерилизация высокой температурой

Прокаливание на огне. Это надежный метод стерилизации, но он имеет ограниченное применение из-за порчи предметов. Таким способом стерилизуются бактериологические петли.

Стерилизация сухим жаром. Проводится в печи Пастера (сухожаровый шкаф) при температуре 160-170°С в течение 1-го часа. Этим способом стерилизуют лабораторную стеклянную посуду, пипетки, завернутые в бумагу, пробирки, закрытые ватными пробками. При температуре выше 170°С начинается обугливание бумаги, ваты, марли.

Стерилизация паром под давлением (автоклавирование). Наиболее универсальный метод стерилизации. Проводится в автоклаве - водо-паровом стерилизаторе. Принцип действия автоклава основан на зависимости температуры кипения воды от давления.

Автоклав представляет собой двустенный металлический котел с герметически закрывающейся крышкой. На дно автоклава наливают воду, в рабочую камеру помещают стерилизуемые предметы, закрывают крышку, сначала не завинчивая ее герметически. Включают нагревание и доводят воду до кипения. Образующийся при этом пар вытесняет из рабочей камеры воздух, который выходит наружу через открытый выпускной кран. Когда весь воздух будет вытеснен, и из крана пойдет непрерывной струей пар, кран закрывают, крышку закрывают герметически. Доводят пар до нужного давления под контролем манометра. Температура пара зависит от давления: при нормальном атмосферном давлении стрелка манометра стоит на 0 атм. - температура пара 100°С, при 0,5 атм. - 112°С, при 1 атм. -121°С, при 1,5 атм. - 127°С, при 2 атм. - 134°С. По окончании стерилизации автоклав отключают, ждут, пока давление не снизится, выпускают постепенно пар и открывают крышку. Обычно при давлении 1 атм. в течение 20-40 минут стерилизуют простые питательные среды и растворы, не содержащие белков и углеводов, перевязочный материал, белье. Стерилизуемые материалы должны быть проницаемы для пара. При стерилизации материалов в больших объемах (хирургические материалы) время увеличивают до 2 часов. При давлении 2 атм. производят обеззараживание патологического материала и отработанных культур микробов.

Питательные среды, содержащие сахара, нельзя стерилизовать при 1 атм., так как они карамелизуются, поэтому их подвергают дробной стерилизации текучим паром, или автоклавированнию при 0,5 атм.

Для контроля режима стерилизации применяются биологический и физический методы. Биологичесжй метод основан на том, что одновременно со стерилизуемым материалом помещают споры Bacillus stearothermophilus, которые погибают при 121°С за 15 минут. После проведения стерилизации споры не должны дать рост на питательной среде. Физический метод основан на применении веществ, имеющих определенную точку плавления, например, серу (119°С), бензойную кислоту (120°С). Запаянные трубки, содержащие вещество в смеси с сухим красителем (фуксин) помещают в автоклав вместе со стерилизуемым материалом. Если температура в автоклаве достаточна, вещество расплавится и окрасится в цвет красителя.

Стерилизация текучим паром_проводится в аппарате Коха или в автоклаве при незавинченной крышке и открытом выпускном кране. Воду в аппарате нагревают до 100°С. Образующийся пар проходит через заложенный материал и стерилизует его. Однократная обработка при 100°С не убивает споры. Поэтому применяют дробный метод стерилизации - 3 дня подряд по 30 минут, в промежутках оставляя на сутки при комнатной температуре. Прогревание при 100°С вызывает тепловую активацию спор, вследствие чего они прорастают до следующего дня в вегетативные формы и погибают при втором и третьем прогревании. Вследствие этого стерилизация текучим паром могут подвергаться только питательные среды, т.к. для прорастания спор необходимо наличие питательных веществ.

Для материалов, разрушающихся при 100°С (например, сыворотки, питательные среды, содержащие белок) применяют другой вид дробной стерилизации - тиндализацию. Стерилизуемый материал прогревают на водяной бане при 56-60°С в течение 5-6 дней подряд - в первый день в течение 2 часов, в остальные дни по 1 часу.

Стерилизация облучением

УФ-лучи. Лампы ультрафиолетового излучения используют для обеззараживания воздуха лечебных учреждений, бактериологических боксов и лабораторий, а также для стерилизации жидкостей с помощью особых аппаратов.

Стерилизации ионизирующим излучением подвергаются в медицинской и микробиологической промышленности разнообразные объекты: лекарственные средства, перевязочные материалы, шелк, хирургические перчатки, одноразовые шприцы, пластмассовые трубки для внутривенного введения и многие другие материалы.

Применение ионизирующей радиации имеет ряд преимуществ перед тепловой стерилизацией. При стерилизации с помощью ионизирующего излучения температура стерилизуемого объекта поднимается незначительно, в связи с чем такие методы называют холодной стерилизацией. При стерилизации в больших масштабах может быть создан конвейер. Материалы стерилизуют в упакованном виде. Имеется два вида оборудования для облучения - гамма-установки с кобальтом-60 и ускорители электронов.

Химическая и физико-химическая стерилизация

Химическую стерилизацию применяют для обработки рук хирурга, операционного поля пациента, хирургических инструментов и перчаток, анестезирующих масок. Применяют некоторые дезинфицирующие средства, хлоргексидин и многие другие вещества.

Газовую стерилизацию проводят с помощью таких веществ, как окись этилена, метилбромид, окись пропилена, формальдегид, глютаральдегид, бета-пропиолактан, озон и другие. Такие вещества вводят в небольшое замкнутое пространство (автоклав, специальный контейнер), куда предварительно помещают стерилизуемые объекты. Газовая стерилизация - более сложный процесс, чем стерилизация с помощью высокой температуры и требует более строгого контроля.

Для упаковки объектов применяют материал, через который легко проходят газ и влага, но не проходят мелкая пыль и микроорганизмы. Лучше всего применять прозрачные полимерные пленки, через которые можно видеть предметы, не нарушая целостности упаковки. При проведении биологического контроля газовой стерилизации применяются материалы, содержащие лиофилизированные живые культуры золотистого стафилококка, кишечной палочки и споры сенной палочки.

После стерилизации для удаления газа камеры продувают стерильным воздухом, а затем выдерживают стерилизованный материал в течение нескольких суток. Проводится контроль остаточной концентрации газа в материале, так как газы токсичны,

Физико-химические методы - это сочетание физических и химических воздействий на микроорганизмы, например, действие дезинфицирующего вещества и нагревания.

Методы частичного обеспложивания

Кипячение - применяется для обработки шприцев, игл, инструментов. Стерилизацию проводят в течение 30 минут в специальных стерилизаторах для инструментов, в воду для устранения ее жесткости и повышения температуры кипения рекомендуется добавить 1-2% бикарбоната натрия. При кипячении споры бактерий не погибают, поэтому для стерилизации питательных сред этот способ не применяется. Подлежащие кипячению инструменты подвергаются обработке специальными мющими растворами для удаления крови и т.п.

Пастеризация._Метод был предложен Пастером для частичного обеспложивания жидкостей, теряющих свои качества под действием высокой температуры. Применяется для обработки вина, молока, других пищевых продуктов. При прогревании жидкости при 50-60°С в течение 30 минут, 70-80°С 5-10 минут и 90°С 2 минуты погибает большинство бесспоровых микробов. Споры остаются живыми. Поэтому во избежание их прорастания пастеризованный продукт необходимо хранить в холодильнике.

Холодная стерилизация

Фильтрование - освобождение жидкостей от микробов, применяется в тех случаях, когда материал не может быть подвергнут нагреванию. Фильтры должны быть настолько мелкопористыми, чтобы задерживать микробы. Бактериальные фильтры изготавливаются из мелкопористых веществ в виде фарфоровых свечей, асбестовых пластинок Зейтца или мембранных фильтров. Фильтрование производят, создавая с помощью насоса разрежение в приемнике. Перед употреблением фильтрующее устройство должно быть простерилизовано. Вирусы проходят через бактериальные фильтры, поэтому метод фильтрования можно отнести к методам частичного обеспложивания. Этот метод используют не только для стерилизации питательных сред и растворов, но и для того, чтобы освободить от микробов токсины, антибиотики, бактериофаги,вирусы.

30. Действие дезинфецирующих веществ на микробы. Перечислить группы дезинфецирующих веществ по механизму действию, назвать основные вещества каждой группы

Дезинфицирующие вещества являются общетоксическими ядами, в отличие от химеотерапевтическнх средств и антибиотиков, оказыва-ющих избирательное действие на микроорганизмы. Механизм действия дезинфицирующих веществ в основном заключастся в нарушении физико-химической структуры микробной клетки

Окислители (хлор и его соединения, вещества, содержащие йод, перекись водорода) обладают повышенной способностью окислять органические соединения в микробной клетке, что приводит к ее гибели.

Вещества, свертывающие белок (фенол, крезол, гексахлорофен, лизол, спирты, соли тяжелых металлов, например, сулема), проникая в микробную клетку, вступают в соединение с ее белками, денатурируют их и таким образом нарушают жизненные функции микроорганизма.

Детергенты (поверхностно-активные вещества (ПАВ)) - вещества, обладающие высокой поверхностной активностью, моющим, а многие из них и антимикробным действием - мыла, моющие средства. Высокой активностью обладают четвертичные аммониевые основания (ЧАО), вызывающие повреждение клеточной стенки бактерий, не проникая внутрь клетки.

Некоторые металлы в незначительных количествах обладают выраженным антимикробным действием (серебро, медь, золото и другие). Объясняется это тем, что они выделяют в воду ионы. Такое явление называют олигодинамическим действием (греч. oligos - малый). Достаточно ничтожною количества ионов в жидкости, чтобы они концентрировались на поверхности микробов и, изменив ее заряд с "-" на "+", оказывали антимикробное действие.

Выбор способа дезинфекции зависит от биологичсских свойств микроба и от той среды, в которой он находится. Например, сулема мало пригодна для дезинфекции белковых субстратов, таких как гной, кровь, мокрота. Под влиянием сулемы происходит свертывание белков, и свернувшийся белок предохраняет микробов от действия дезин-фектанта. Этиловый спирт используют для обеззараживания рук, различных предметов, для консервации биологических объектом. Наиболее выражено бактерицидное действие 70%-ного спирта, поскольку чистый спирт вызывает свертывание поверхностных белков бактерий и не проникает внутрь клетки.

Значительным бактерицидным действием обладает гексахлорофен, причем грамположительные кокки более чувствительны к нему, чем грамотрицательнве палочки. Гексахлорофен применяется для обеззараживания кожи в виде мыла, содержащею 2-5% этого вещества; для санации полости носа в виде мази, содержащей 1%, для санации носоглотки путем орошения с целью борьбы со стафилококковым носитель-cibom - 0,1%-ный раствор.

31. Микрофлора воды, почвы, воздуха. Санитарно-показательные микроорганизмы. Выживаемость патогенных микробов во внешней среде. Некультивируемые формы бактерий. Значение для медицинской практики

Характеризуя микрофлору почвы, воды и воздуха, целесообразно придерживаться определенного плана:

1) постоянная микрофлора данной среды;

2) значение данной среды как фактора передачи возбудителей заболеваний;

3) определение микробной флоры.

При исследовании объектов внешней среды методами санитарной микробиологии определяются количественные показатели - общее количество микроорганизмов в определенном объеме. Важной задачей исследования является обнаружение патогенных микробов и их токсинов. Однако непосредственное их выявление представляет значительные трудности. Причина в том, что патогенные микроорганизмы встречаются во внешней среде непостоянно, обычно в небольших количествах, их трудно культивировать на питательных средах, некоторые из них вообще не культивируются на искусственных средах. Поэтому возможное загрязнение внешней среды патогенными микробами определяют по косвенному показателю - обнаружению санитарно-показательного микроорганизма.

В качестве санитарно-показательных выбирают те микробы, которые постоянно и в больших количествах содержатся в тех выделениях человека, которые для данной среды наиболее опасны. Сроки их выживания во внешней среде должны совпадать примерно со сроками выживания патогенных микробов. Санитарно-показательные микроорганизмы не должны интенсивно размножаться во внешней среде и должны легко обнаруживаться при лабораторном исследовании.

Микрофлора почвы

Почва является основной средой обитания многих микроорганизмов, которые вместе с растениями и животными составляют разнообразные биогеоценозы. Состав микробиоценозов почвы зависит от многих внешних факторов, в том числе от агротехнических мероприятий, таких как вспашка, внесение удобрений, ядохимикатов.

Самый поверхностный тонкий слой почвы содержит мало микроорганизмов, так как они погибают под влиянием солнечных лучей и высушивания. Наиболее обильна микрофлора почвы на глубине 10-20 см, а в более глубоких слоях количество микробов уменьшается.

Видовой состав почвенной микрофлоры весьма разнообразен: анаэробные и аэробные бактерии, грибы, простейшие, вирусы.

Значение микрофлоры почвы велико для круговорота веществ в природе. Микробы осуществляют разложение и минерализацию органических животных и растительных остатков, попадающих в почву, процесс очищения ее от нечистот и отбросов.

Среди патогенных микробов имеются такие, для которых почва является постоянным местом обитания. Это возбудители ботулизма, ак-тиномицеты и грибы - возбудители микозов. Вторая группа - это спо-рообразующие бациллы и клостридии, которые попадают в почву с выделениями человека и животных и могут длительно здесь сохраняться в виде спор. Это бациллы сибирской язвы, клостридии столбняка и газовой анаэробной инфекции.

К третьей группе относятся неспорообразующие бактерии и вирусы, которые попадают в почву с выделениями человека и животных, сохраняются здесь в течение нескольких дней и месяцев. Это бактерии - возбудители брюшного тифа и дизентерии, палочки туберкулеза, лептоспиры, вирусы. Значение почвы как фактора передачи при этих инфекциях относительно невелико.

Микробиологическое исследование почвы имеет значение при строительстве жилищ, детских учреждений, водохранилищ. Пробы почвы берут из глубины. Определяют микробное число - общее количество микроорганизмов в 1 г почвы и наличие санитарно-показательных микроорганизмов. Присутствие в почве Escherichia coli и Streptococcus faecalis указывает на свежее фекальное загрязнение, бактерий рода

Citrobacter и Enterobacter - на несвежее, a Clostridium perfringens - на давнее.

Микрофлора воды

Вода открытых водоемов, подобно почве, является естественной средой обитания многих видов бактерий, грибов, вирусов, простейших. В воде обитают также различные виды микробов, принимающих участие в круговороте веществ в природе и способствующих самоочищению воды благодаря разложению органических соединений. Характер микрофлоры воды зависит от многих причин, и в особенности от загрязнения стоками ливневых, фекальных и промышленных нечистот. По мере удаления от населенных пунктов число микробов постепенно уменьшается. Наиболее чистыми являются воды глубоких артезианских скважин и родников.

Вода имеет эпидемиологическое значение как фактор передачи инфекций. Наблюдались водные эпидемии холеры, брюшного тифа, леп-тоспирозов и других инфекционных болезней.

Санитарно-показательными микроорганизмами для воды являются бактерии группы кишечной палочки (БГКП), принадлежащие к разным родам семейства энтеробактерий. Санитарно-микробиологическое состояние воды оценивается по следующим показателям:

1) микробное число - общее количество бактерий в 1 мл воды;

2) коли-титр - наименьший объем воды в миллилитрах, в котором обнаруживаются БГКП;

3) коли-индекс - количество БГКП в 1 литре воды;

4) кроме того, в воде определяют наличие патогенных и условнопатогенных микроорганизмов: энтерококков, сальмонелл, холерного вибриона, энтеровирусов.

В соответствии с ГОСТом на питьевую водопроводную воду, микробное число ее должно быть не более 100, коли-титр должен быть не ниже 300, коли-индекс - не более 3.

Микрофлора воздуха

В воздух микробы попадают из почвы с поверхностей растений и животных, а также с промышленными отходами некоторых предприятий. В отличие от воды и почвы, где микробы могут размножаться, в воздухе они только сохраняются в течение некоторого времени, а затем гибнут вследствие высыхания и влияния солнечных лучей. Устойчивые к таким воздействиям микроорганизмы могут долго сохраняться в воздухе. Это споры грибов, споры бактерий, сарцины и другие кокки, образующие пигменты. Больше всего микробов в воздухе промышленных городов, меньше всего - в воздухе лесов и гор. В открытом воздухе количество микробов летом больше, чем зимой, в воздухе закрытых помещений - наоборот.

Воздух может служить фактором передачи патогенных микробов: стафилококков, стрептококков, палочек дифтерии, коклюша, туберкулеза, а также вирусов кори, гриппа. Передача воздушно-капельным и воздушно-пылевым путем почти всегда происходит в закрытых помещениях и редко - на открытом воздухе.

Показатели санитарно-микробиологического состояния воздуха

закрытых помещений:

- микробное число - количество микробов, обнаруженных в 1 м3

воздуха;

- наличие санитарно-показательных бактерий: Streptococcus haeraolyticus и Staphylococcus aureus.

Чистота воздуха зависит от своевременного проветривания помещения и влажной уборки. Применяется обработка воздуха бактерицидными УФ-лампами. Для уменьшения контаминации воздуха применяют марлевые и ватно-марлевые маски.

32. Бактериологическое исследование воды: показатели, методы их определения и оценка

Санитарно-гюказательными микроорганизмами для воды являются бактерии группы кишечной палочки (БГКП), принадлежащие к разным родам семейства энтеробактерий. Санитарно-микробиологическое состояние воды оценивается по следующим показателям:

1) микробное число - общее количество бактерий в 1 мл воды;

2) коли-титр - наименьший объем воды в миллилитрах, в котором обнаруживаются БГКП;

3) коли-индекс - количество БГКП в 1 литре воды;

4) кроме того, в воде определяют наличие патогенных и условнопатогенных микроорганизмов: энтерококков, сальмонелл, холерного вибриона, энтеровирусов.

В соответствии с ГОСТом на питьевую водопроводную воду, микробное число ее должно быть не более 100, коли-титр должен быть не ниже 300, коли-индекс - не более 3.

Определение микробного числа воды

Водопроводную воду засевают в объеме 1 мл, воду открытых водоемов --в объемах 1,0; 0,1; 0,01 мл. Все пробы вносят в стерильные чашки Петри, после чего их заливают 10--12 мл расплавленным и остуженным до 45--50° С питательным агаром, который тщательно перемешивают с водой. Посевы инкубируют при 37°С в течение 24--48 ч. Воду из открытых водоемов засевают параллельно на две серии чашек, одну из которых инкубируют при 37°С в течение суток, а другую --2 сут при 20° С. Затем подсчитывают количество выросших на поверхности и в глубине среды колоний и вычисляют микробное число воды -- количество микробов в 1 мл.

Определение коли-титра и коли-индекса воды

Коли-титр воды измеряется минимальным количеством воды (в мл), в котором обнаруживаются БГКП, кол и - индеке-- количеством БГКП, содержащихся в 1 л исследуемой воды. Коли-титр воды определяют бродильным методом и методом мембранных фильтров.

Бродильный метод. Воду открытых водоемов в объемах 100; 10; 1 и 0,1 мл засевают в глюкозопептонную среду, причем для посевов больших количеств воды (100 и 10 мл) используют концентрированную среду, содержащую десятикратные количества указанных веществ.

Состав глюкозопептонной среды: 1% пептонная вода, 0,5% глюкозы, 0,5% хлорида натрия, индикатор Андреде и поплавок.

Для исследования водопроводной воды делают посев 4 проб по 100 мл и Ю проб по 10 мл или 3 проб по 100 мл и 3 проб по 10 мл в концентрированную среду и 3 проб по 1 мл в обычную глюкозопептонную среду. Посевы инкубируют в течение суток при 37° С. О брожении судят по наличию пузырьков газа в поплавке. Из забродивших или помутневших проб производят посевы на среду Эндо. Из выросших колоний делают мазки, окрашивают по Граму и ставят оксидазный тест, позволяющий дифференцировать бактерии родов Esherichia, Citrobacter и Enterobacter от грамотрицательных бактерий семейства Pseudomonadacae и других оксидазаположительных бактерий, обитающих в воде, С этой целью стеклянной палочкой снимают 2--3 изолированные колонии с поверхности среды и наносят штрихом на фильтровальную бумагу, смоченную диметил-п-фенилендиамином. При отрицательном оксидазном тесте цвет бумаги не изменяется, при положительном -- она окрашивается в синий цвет в течение 1 мин.

Грамотрицательные палочки, не образующие оксидазу, вновь исследуют в бродильном тесте -- вносят в полужидкий питательный агар с 0,5% глюкозы и инкубируют при 37°С в течение суток. При положительном результате определяют коли-титр и коли-индекс по таблицам ГОСТа 18963-73.

Метод мембранных фильтров. Мембранный фильтр № 3 помещают в воронку Зейтца, вмонтированную в колбу Бунзена, которая присоединяется к вакуум-насосу. Мембранные фильтры предварительно стерилизуют кипячением в дистиллированной воде. Воду из водопроводной сети Москвы и Ленинграда и воду артезианских скважин фильтруют в объеме 500 мл, воду других городов -- в объеме 333 мл. Чистую воду открытого водоема фильтруют в объеме 100; 10; 1 и 0,1 мл, более загрязненную перед фильтрацией разводят стерильной водой. Затем фильтры помешают на поверхность среды Эндо в чашку Петри и после инкубации при 37°С в течение суток подсчитывают количество выросших колоний, типичных для БГКП. Из 2--3 колоний красного цвета готовят мазки, окрашивают по Граму и ставят оксидазный тест. Для этого фильтр с выросшими на нем колониями бактерий переносят пинцетом, не переворачивая, на кружок фильтровальной бумаги, смоченной диметил-п-фенилендиамином. При наличии оксидазы индикатор окрашивает колонию в синий цвет. Две --три колонии, не изменившие первоначальную окраску, засевают в полужидкую среду с 0,5% глюкозы. Посевы инкубируют в течение суток при 37°С. При наличии газообразования подсчитывают количество красных колоний на фильтре и определяют коли-индекс, из значения которого вычисляют коли-титр. Например, если коли-индекс равен 5. то коли-титр составит 200 (1000:5 =200).

Общее количество бактерий в 1 мл неразделенной волы, не более 100.

Количество БГКП 3.

При использовании жидких сред накопления коли - титр, не менее 333.

Для определения титра Staph. faecalis готовят десятикратные разведения воды. Цельную воду и ее разведения в объеме 1 мл засевают в одну из жидких элективных сред (КФ, полимик-синовая и др.), инкубируют при 37°С в течение 2 сут, а затем через 24 и 48 ч производят высевы на чашки с плотными элективно-дифференциальными средами: агар КФ, агар ТТХ (среда с трифенилтетразолхлоридом), полимиксинотеллуритный агар. Идентифицируют фекальные стрептококки по виду коло-ний, морфологии клеток и окраске по Граму. На среде с ТТХ Staph. faecalis образует колонии темно-красного цвета, на агаре с теллуритом -- черного цвета.

Состав cред. Среда КФ: 2% питательный агар с 1% дрожжевого экстракта, 2% мальтоны, 0.1% лактозы, 0,4% анида натрия, 0,06% кацбоната натрия, индикатор бромкрезоловый красный. Полимиксиновая среда: питательный агар, 1% дрожжевого экстракта, 1% глюкозы, полимнксин М 200 ЕД/мл, индикатор бромтимоловый синий. Полимиксинотеллуритный агар: питательный агар, дрожжевой экстракт, 1% глюкозы, кристаллический фиолетовый 1:800 000, полимиксин М 200 ЕД/мл, 0.01% теллурита калия, агар ТТХ: питательный агар, 1% дрожжевого экстракта, 1% глюкозы, кристаллический фиолетовый 1 : 800000, 0,01% ТТХ.

При определении индекса Staph. faecalis пользуются статистическими таблицами, применяемыми при установлении коли-индекса. Кроме того, с этой целью используют метод мембранных фильтров.

Для обнаружения патогенных бактерий максимальные объемы воды пропускают через мембранные фильтры, которые затем помещают в жидкие элективные среды или на поверхность плотных дифференциально-диагностических сред.

33. Генетический аппарат бактерий и его особенности у вирусов. Понятие о генотипе и фенотипе микроорганизмов. Символические обозначения генотипических и фенотиических признаков

Материальной основой наследственности бактерий является ДНК. По сравнению с геном ом эукариотов геном бактерий устроен более просто - это молекула ДНК, замкнутая в кольцо, которое прикреплено к одной из мезосом. В отличие от парных хромосом эукариотов, у бактерий одна хромосома, то есть гаплоидный набор генов, поэтому у них нет явления доминантности.

Кроме хромосомы, у бактерий имеются внехромосомные генетические элементы - плазмиды. Это молекулы ДНК, которые или находятся вне хромосомы, в автономном состоянии, в виде колец, прикрепленных к мезосомам, или встроены в хромосому (интегрированное состояние). Плазмиды придают бактерии дополнительные наследственные признаки, но не являются обязательными для нее. Плазмида может быть элиминирована (удалена) из бактерии, что не влияет на ее жизнеспособность.

В настоящее время известно свыше 20 типов плазмид у бактерий. Назовем некоторые из них :

F-плазмида, фактор фертильности (лат. fertilis - плодовитый), или половой фактор, определяет способность бактерий к образованию половых ворсинок и к конъюгации.

R-плазмиды определяют резистентность бактерий к лекарственным средствам. Передача R-плазмид от одних бактерий к другим приводит к быстрому распространению лекарственноустойчивых бактерий.

Col-плазмиды кодируют синтез бактериоцинов - антибактериальных веществ, вызывающих гибель других бактерий того же илиродственных видов. Впервые они были обнаружены у Escherichia со Н, отсюда и их название - колицины. Известны бактериоцины стафилококков (стафилоцины), палочек чумы (пестицины) и других бактерий. Наличие плазмиды бактериоциногенности придает бактериям селективные преимущества в биоценозах. Это может иметь для организма человека положительное значение, если колицины кишечной палочки губительно действуют на патогенные энтеробактерии, и отрицательное, если бактериоцины продуцируются патогенными микробами.

Ent-плазмиды определяют продукцию энтеротоксина. Н1у-плаз-мида - гемолитическую активность.

Дополнительными генетическими элементами являются также профаги - геномы умеренных фагов, которые, встраиваясь в хромосому бактерии, могут придавать ей определенные свойства. Например, tox-гены, кодирующие образование экзотоксинов коринебактерий дифтерии, клостридий ботулизма и др.

Особенности вирусов, отличающие их от всех других живых существ

1) наличие только одного типа нуклеиновой кислоты - ДНК или РНК, в то время как клетки всех остальных живых существ содержат ДНК и РНК, взаимодействие которых необходимо для биосинтеза белков,

2) отсутствие собственных белоксинтезирующих систем и клеточного строения;

3) внутриклеточный паразитизм на молекулярном (генетическом) уровне.

Внеклеточная форма вируса - вириои и вирус, находящийся внутри клетки хозяина - это две разные формы вируса.

Вирионы разных вирусов имеют размеры от 15 до 400 нанометров. Нанометр - это 10-9 метра. Наиболее мелкие вирусы - вирусы полиомиелита - имеют вирион размером 17-25 им, средние - вирус гриппа - 80-120 нм, крупные - вирус оспы - 300-400 им.

В центре вириона располагается его геном. Это нуклеиновая кислота - ДНК или РНК (однонитевая или двунитевая). Плюс-однонитевая РНК несет две функции: наследственную и информационную, например у вируса полиомиелита. Минус-однонитевая РНК, как, например, у вируса гриппа, несет только наследственную функцию, и только в процессе репродукции вируса к ней достраивается плюс-нить иРНК.

Вокруг нуклеиновой кислоты симметрично располагаются белковые молекулы - капсомеры, составляющие капсид (лат. capsa - коробка). Различают спиральный тип симметрии, когда капсомеры уложены по всей длине молекулы нуклеиновой кислоты, и кубический, когда капсомеры располагаются в виде двадцатигранника (икосаэдра). Вирионы, содержащие только нуклеиновую кислоту и белок, составляют нуклеокапсид. Это простые вирусы, например, ВТМ, вирус полиомиелита.

У вирионов сложноорга-низованных вирусов имеется еще поверхностная оболочка - суперкапсид, содержащий, кроме белков, также углеводы, липиды, компоненты клетки хозяина. Строение вириона лежит в основе классификации вирусов. По типу нуклеиновой кислоты их делят на: рибовирусы и дезоксири-бовирусы, далее по структуре вирионов, по месту размножения и по другим признакам проводится деление на семейства и роды.

Генотип - это общая сумма генов микроба. В отношении микроорганизмов "генотип" означает то же, что "геном".

Фенотип - это весь комплекс свойств микроба, проявление генотипа в определенных, конкретных условиях существования.

Генотип - это возможные способности клетки, а фенотип - видимое их проявление.

Гены, ответственные за синтез какого-то соединения, обозначают строчными буквами латинского алфавита по названию соединения, например, при наличии гена, кодирующего синтез лейцина, - ieu+, при отсутствии - leu-. Гены, ответственные за резистентность к лекарственным средствам, бактериофагам, ядам, обозначают буквой г (лат. resistentia), а чувствительные - буквой s (лат. sensitiv - чувствительный). Например, чувствительность к стрептомицину обозначают str5, резистентность strr. Фенотип бактерий обозначается теми же знаками, но с прописной буквы: соотвественно Leu+, Leir, Str1, Str8.

34. Виды изменчивости (наследственная и ненаследственная). Начертить схему. Мутации, их разновидности. Мутагены физические, химические и биологические

Наследственность - способность сохранения постоянства специфических свойств организма на протяжении ряда поколений, то есть способность воспроизводить себе подобных.

Изменчивость - различие в свойствах между особями одного вида. Различают изменчивость наследственную и ненаследственную.

Ненаследственная или фенотипическая изменчивость (модификации) не затрагивает геном микроба, не передается по наследству. Модификации возникают в ответ на изменяющиеся условия окружающей среды. При устранении фактора, вызвавшего модификацию, изменение исчезает. Например, кишечная палочка только в присутствии лактозы продуцирует ферменты, разлагающие этот углевод. Стафилококки образуют фермент, разрушающий пенициллин, только в присутствии этого антибиотика. Примером модификаций является также образование L-форм бактерий под действием пенициллина и возврат к исходной форме после прекращения его действия.

Наследственная или генотипическая изменчивость возникает в результате изменения самого генома. Изменение генома может наступить в результате мутаций или рекомбинаций.

Мутации (лат. mutatio - изменение) - изменение последовательности нуклеотидов в молекуле ДНК, в результате которого происходит появление или потеря признака. Таким признаком может быть способность синтезировать какую-либо аминокислоту или резистентность к антибиотику.

По происхождению мутации могут быть спонтанными или индуцированными. Индуцированные мутации получают в эксперименте под влиянием мутагенов: радиации, некоторых химических веществ. Спонтанные мутации возникают под влиянием естественных факторов. Частота спонтанных мутаций невелика, в среднем 1 на 10 млн. Образовавшиеся микробы называют мутантами. Если возникшая мутация выгодна для микроба и создает для него преимущества в определенных условиях среды, то мутанты выживают и дают многочисленное потомство. Если же мутация не создает преимуществ, мутанты погибают.

Мутации микроорганизмов могут иметь важное практическое значение. Получены штаммы-мутанты грибов и актиномицетов, являющиеся продуцентами антибиотиков во много раз более активных, чем исходные культуры. Из мутантов с ослабленной вирулентностью могут быть получены вакцинные штаммы для получения живых вакцин.

Диссоциация бактерий (лат. dissociatio - расщепление) - одно из проявлений мутаций. В популяции микроорганизмов появляются особи, вырастающие при посеве на плотную питательную среду в виде гладких S-форм и шероховатых R-форм колоний (англ, smooth - гладкий, rough - шероховатый). S-формы колоний - круглые, влажные, с гладкой блестящей поверхностью, с ровными краями. R-формы колоний неправильной формы, сухие, с изрезанными краями и шероховатой поверхностью.