Медицинская микробиология, вирусология и иммунология

ДНК-содержащие (ДНК --> иРНК -->белок):

1. Репродукция происходит в ядре: аденовирусы, герпес, паповавирусы. Используют ДНК-зависимую РНК - полимеразу клетки.

2. Репродукция происходит в цитоплазме: вирусы имеют свою ДНК-зависимую РНК полимеразу.

РНК-содержащие вирусы:

1. Рибовирусы с позитивным геномом (плюс-нитиевые): пикорна-, тога-, коронавирусы. Транскрипции нет.

РНК -->белок

2. Рибовирусы с негативным геномом (минус- нитевые): грипп, корь, паротит, орто-, парамиксовирусы.

(-)РНК --> иРНК --> белок (иРНК комплементарная (-)РНК). Этот процесс идет при участии специального вирусного фермента - вирионная РНК-зависимая PHK-полимераза ( в клетке такого фермента быть не может).

3. Ретровирусы

(-)РНК -> ДНК --> иРНК -->белок (и РНК гомологична РНК). В этом случае процесс образования ДНК на базе (-)РНК возможен при участии фермента - РНК-зависимой ДНК-полимеразы (обратной транскриптазы или ревертазы)

- Четвертая фаза - синтез компонентов вириона. Нуклеиновая кислота вируса образуется путем репликации. На рибосомы клетки транслируется информация вирусной иРНК, и в них синтезируется вирус-специфический белок.

- Пятая фаза - сборка вириона. Путем самосборки образуются нуклеокапсиды.

- Шестая фаза - выход вирионов из клетки. Простые вирусы, например, вирус полиомиелита, при выходе из клетки разрушают ее. Сложноорганизованные вирусы, например, вирус гриппа, выходят из клетки путем почкования. Внешняя оболочка вируса (суперкапсид) формируется в процессе выхода вируса из клетки. Клетка при таком процессе на какое-то время остается живой.

Описанные типы взаимодействия вируса с клеткой называются продуктивными, так как приводят к продукции зрелых вирионов.

Иной путь - интегративный - заключается в том, что после проникновения вируса в клетку и "раздевания" вирусная нуклеиновая кислота интегрирует в клеточный геном, то есть встраивается в определенном месте в хромосому клетки и затем в виде так называемого прови-руса реплицируется вместе с ней. Для ДНК- и РНК-содержащих вирусов этот процесс совершается по-разному. В первом случае вирусная ДНК интегрирует в клеточный геном. В случае РНК-содержащих вирусов вначале происходит обратная транскрипция: на матрице вирусной РНК при участии фермента "обратной транскриптазы" образуется ДНК, которая встраивается в клеточный геном. Провирус несет дополнительную генетическую информацию, поэтому клетка приобретает новые свойства. Вирусы, способные осуществить такой тип взаимодействия с клеткой, называются интегративными. К интегративным вирусам относятся некоторые онкогенные вирусы, вирус гепатита В, вирус герпеса, вирус иммунодефицита человека, умеренные бактериофаги.

Кроме обычных вирусов, существуют прионы - белковые инфекционные частицы, не содержащие нуклеиновую кислоту. Они имеют вид фибрилл, размером до 200 нм. Вызывают у человека и у животных медленные инфекции с поражением мозга: болезнь Крейтцфельда-Якоба, куру, скрепи и другие.

17. Фаги (вирусы микробов): морфология и ультраструктура. Фазы взаимодействия вирулентного и умеренного фагов с бактериальной клеткой. Определение активности (титра) бактериальной клетки. Профаг. Фаготипирование микроорганизмов, значение. Практическое использование фагов

Явление бактериофагии открыл и изучил французский микробиолог д'Эррель. В 1917 г. он наблюдал лизис культуры бактерий дизентерии после внесения в нее фильтрата испражнений больного, выздоравливающего от дизентерии. При многократных пассажах, то есть переносе из одной культуры в другую, фильтраты сохраняли свою лизирующую активность и даже усиливали ее. Ученый сделал из этого правильный вывод о том, что лизирующий агент - живой и при пассажах размножается в бактериях. Д'Эррель назвал этот агент бактериофагом (лат. phagos -пожирающий), а само явление лизиса - бактериофагией.

Позже было подтверждено, что бактериофаг - живой. Это вирус бактерий, он размножается в бактериях, вызывая их лизис. Добавление бактериофага в культуру бактерий на жидкой питательной среде вызывает просветление среды. На плотных питательных средах при посеве смеси бактерий и бактериофага на фоне сплошного роста бактерий появляются стерильные пятна или негативные колонии фагов.

Бактериофаги специфичны, то есть лизируют определенные виды бактерий. Отсюда их названия: дизентерийный бактериофаг, стафилококковый бактериофаг. Обнаружены фаги не только бактерий, но и актиномицетов.

В практической медицине бактериофаги нашли применение как лечебные и профилактические средства,

Важное значение имеет то, что на примере бактериофагии были открыты и изучены многие проблемы общей вирусологиии и молекулярной генетики.

Структура бактериофагов

Размеры бактериофагов колеблются от 20 нм до 200 нм. Как все вирусы, содержат ДНК, или РНК, и белковый капсид. Чаще всего встречаются и лучше изучены бактериофаги, имеющие форму сперматозоида или головастика. Состоят они из головки, хвостового отростка, батальной пластинки с короткими шинами и хвостовыми нитями. Внутри головки располагается спирально скрученная пить ДНК, покрытая белковым капсидом. Хвостовой отросток - что полый цилиндрический стержень, окруженный сократительным чехлом. Базальная пластинка и нити осуществляют процесс адсорбции бактериофага на бактериальной клетке. Существуют бактериофаги, имеющие другое строение: с короткими отростком, с отростком без сократительного чехла, без отростка, нитевидной формы.

Взаимодействие бактериофага с бактериальной клеткой

Как все вирусы, бактериофаги не размножаются на питательных средах. Их размножение происходит только в чувствительных к ним бактериальных клетках, в процессе взаимодействия, в котором наблюдаются те же фазы, что при взаимодействии других вирусов с клеткой.

Адсорбция бактериофага. Как все вирусы, фаги неподвижны, и столкновение с бактерией происходит случайно, затем адсорбция становится прочной, если у клетки имеются на поверхности фагоспецифические рецепторы. Фаги, имеющие сократительный чехол, адсорбируются с помощью хвостового отростка.

Внедрение фага внутрь клетки. Под действием фермента лизоцима, который находится в хвостовом сегменте, в клеточной стенке бактерии образуется отверстие. Через это отверстие в результате сокращения хвостового чехла внутрь бактериальной клетки переходит ДНК фага. Белковый капсид остается снаружи.

Синтез ДНК и белка бактериофага. В клетке прекращается синтез бактериальных белков. Образуются фаговые ДНК, а на рибосомах бактерий синтезируются молекулы фагового белка.

Формирование фага. Сборка зрелых фагов из ДНК и капсида происходит в цитоплазме клетки. Выход зрелых фагов из клетки происходит при разрушении бактерий с помощью лизоцима, а затем зрелые фаги внедряются в новые клетки.

"Урожай" фага, в зависимости от его вида, составляет от 20 до 200 частиц. Весь цикл взаимодействия, занимающий от 10 минут до нескольких часов, называется литическим циклом, а фаг при таком взаимодействии - вирулентным.

В отличие от вирулентных, умеренные фаги не лизируют бактерии. Их геном, проникнув в клетку, встраивается в хромосому бактерии и в дальнейшем остается в хромосоме в виде профага и реплицируется вместе с ней. Бактерии, несущие профаг, называются лизогенными, а само явление - лизогенией. Лизогенные бактерии встречаются очень часто. Профаг, находясь в геноме бактерии, придает ей какие-либо новые свойства. Так, например, продукция экзотоксина у палочек дифтерии и ботулизма связана с наличием профага.

В определенных условиях (воздействия температуры, химических веществ и др.) профаги могут превратиться в вирулентные бактериофаги. Размножаясь, они лизируют бактерии и могут переходить в другие бактериальные клетки. При выходе из хромосомы профаг может захватить соседние гены бактериальной хромосомы и при заражении другой бактерии, встроившись в ее хромосому, передать эти гены. Передача генетического материала от одной бактерии к другой с помощью умеренного бактериофага называется трансдукцией. Таким образом, могут передаваться такие признаки, как устойчивость к антибиотикам, способность продуцировать какие-либо ферменты. Умеренные бактериофаги применяются в генетической инженерии в качестве вектора - переносчика генов.

Практическое значение бактериофагов

Препараты бактериофагов применяются для диагностики, профилактики и лечения. Фагодиагностика основана на специфичности бактериофагов: видоспецифические бактериофаги лизируют только определенные виды бактерий. Более того, бактерии одного и того же вида различаются по чувствительности к разным типовым бактериофагам, Таким образом можно с помощью набора типовых бактериофагов определять фаговары стафилококков, сальмонелл, вибрионов. Фаготипирование помогает установить источник инфекции и пути передачи.

Лечебно-профилактическое действие фагов основано на их литической активности.

Для получения препарата бактериофага культуру бактерий заражают бактериофагом. На следующий день лишрованную культуру фильтруют через бактериальный фильтр. К фильтрату в качестве консерванта добавляют хинозол.

Для количественной характеристики бактериофагов используют такой критерий, как титр бактериофага. Титр фага можно выразить двумя показателями:

1) наибольшее разведение препарата, при котором бактериофаг лизирует соответствующие бактерии:

2) количество активных корпускул бактериофага в 1 мл препарата. Методы титрования бактериофага:

1) метод серийных разведении в пробирках с жидкой питательной средой по Аппсльману;

2) двуслойный агаровый метод, при котором подсчитывают число негативных колоний фага на фоне сплошного роста бактерий - метод Грациа.

Готовый жидкий препарат бактериофага должен быть совершенно прозрачным. При кишечных инфекциях препарат применяют вместе с раствором питьевой соды, так как кислое содержимое желудка разрушает бактериофаг. Препараты некоторых бактериофагов для инъекций и местного применения выпускают в ампулах. Для приема внутрь препараты бактериофагов выпускаются также в виде таблеток с кислотоустойчивым покрытием, которое в щелочной среде тонкого кишечника растворяется. В качестве покрытия применяется пектин или ацетилфталилцеллюлоза (ЛФП).

В нашей стране выпускаются препараты дизентерийного, сальмонеллезного, коли-протейного, стафилококкового и других бактериофагов, а также наборы типовых фагов для фаготипирования стафилококков, брюшнотифозных и других бактерий.

18. Питание бактерий. Типы питания. Механизмы переноса веществ в клетку. Факторы роста микроорганизмов

Как у всего живого, метаболизм микроорганизмов состоит из двух взаимосвязанных, одновременно протекающих, но противоположных процессов - анаболизма, или конструктивного метаболизма, и катаболизма, или энергетического метаболизма.

Обмен веществ у микроорганизмов имеет свои особенности.

1) Быстрота и интенсивность обменных процессов. За сутки микробная клетка может переработать такое количество питательных веществ, которое превышает ее собственный вес в 30-40 раз.

2) Выраженная приспособляемость к изменяющимся условиям внешней среды.

3) Питание осуществляется через всю поверхность клетки. Прокариоты не проглатывают питательные вещества, не переваривают их внутри клетки, а расщепляют их вне клетки с помощью экзоферментов до более простых соединений, которые транспортируются в клетку.

Для роста и жизнедеятельности микроорганизмов обязательно наличие в среде обитания питательных материалов для построения компонентов клетки и источники энергии. Для микробов необходимы вода, источники углерода, кислорода, азота, водорода, фосфора, калия, натрия и других элементов. Требуются также микроэлементы: железо, марганец, цинк, медь для синтеза ферментов. Различные виды микробов нуждаются в тех или иных факторах роста, таких, как витамины, аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания.

В зависимости от способности усваивать органические или неорганические источники углерода и азота микроорганизмы делятся на две группы - аутотрофов и гетеротрофов.

Аутотрофы (греч. autos - сам, trophic - питающийся) получают углерод из углекислоты (СО₂) или ее солей. Из простых неорганических соединений они синтезируют белки, жиры, углеводы, ферменты.

Гетеротрофы (греч. heteros - другой, trophic - питающийся) используют сложные органические соединения, такие как углеводы, спирты, аминокислоты, органические кислоты. Среди гетеротрофных микроорганизмов различают сапрофитов (греч. sapros - гнилой, phyton - растение) и паразитов. Сапрофиты используют мертвые органические соединения. Они широко распространены в природе, разлагают органические вещества, отбросы, участвуя таким образом в санитарной очистке окружающей среды. Паразиты живут и размножаются в тканях человека, животных, растений.

Микробы могут изменять свой тип питания с паразитического на сапрофитный. Их можно культивировать вне организма, на питательных средах. Среди прокариотов исключение составляют риккетсии и хламидии, которые могут жить только в живых клетках хозяина. Их называют строгими, или облигатными паразитами (лат. obligatus - обязательный). Облигатными паразитами являются также все вирусы.

В зависимости от источников энергии и природы доноров микроорганизмы подразделяют на фототрофы (фотосинтезирующие), способные использовать солнечную энергию, и хемотрофы (хемосинтезирующие), получающие энергию за счет окислительно - восстановительных реакций. К фототрофам относятся исключительно сапрофитные микроорганизмы. В патологии человека ведущую роль играют хемосинтезирующие микроорганизмы.

В зависимости от природы доноров электронов хемотрофы подразделяются на хемолитотрофы (хемоавтотрофы) и хемоорганотрофы (хемогетеротрофы).

В зависимости от источников азота - прототрофы - микроорганизмы, способные синтезировать все необходимые им органические соединения (углеводы, АК и др.) из глюкозы и солей аммония. Ауксотрофы - микроорганизмы, не способные синтезировать какое - либо из указанных соединений. Они ассимилируют эти соединения и другие факторы роста в готовом виде из окружающей среды или организма хозяина.

Транспорт питательных веществ

Через клеточную стенку и цитоплазматическую мембрану внутрь клетки прокариотов проникают только небольшие молекулы, поэтому белки, полисахариды и другие биополимеры вначале расщепляются экзоферементами до более простых соединений, которые транспортируются внутрь клетки.

Проникновение питательных веществ в клетку происходит с помощью различных механизмов.

Пассивная диффузия - вещества поступают в клетку за счет диффузии по градиенту концентрации, то есть вследствие того, что концентрация вне клетки выше, чем внутри.

Облегченная диффузия - также совершается по градиенту концентрации, но с участием ферментов-переносчиков, так называемых пермеаз. Этот фермент присоединяет к себе молекулы вещества на внешней стороне цитоплазматической мембраны и отдает его на внутренней стороне в неизмененном виде. Затем свободный переносчик перемещается снова к наружной стороне мембраны, где связывает новые молекулы вещества. При этом каждая пермеаза переносит какое-то определенное вещество.

Эти два механизма переноса не требуют энергетических затрат.

Активный перенос происходит также с участием пермеаз, причем осуществляется против градиента концентрации. Микробная клетка может накопить вещество в концентрации, в тысячи раз превышающих ее во внешней среде. Такой процесс требует затрат энергии, то есть расходуется АТФ.

Транслокация радикалов - это четвертый механизм передачи веществ. Это активный перенос химически измененных молекул, с участием пермеаз. Например, такое простое вещество, как глюкоза, переносится в фосфорилированном виде.

Выход веществ из бактериальной клетки происходит путем пассивной диффузии или путем облегченной диффузии с участием пермеаз.

Факторы роста микроорганизмов:

К факторам роста относят аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания, липиды, витамины, железопорфирины (гем) и другие соединениями. Некоторые микроорганизмы самостоятельно синтезируют необходимые им ростовые факторы, другие получают их в готовом виде из окружающей среды. Потребность того или другого микроорганизма в определенных ростовых факторах является стабильным признаком, который используется для дифференциации и идентификации бактерий, а также при изготовлении питательных сред для лабораторных и биотехнологических целей.

Аминокислоты. Многие микроорганизмы, особенно бактерии, нуждаются в тех или других аминокислотах (одной или нескольких), поскольку они не могут их самостоятельно синтезировать, например клостридии -- в лейцине, тирозине, стрептококки -- в лейцине, аргинине и др. Такого рода микроорганизмы называются ауксотрофными по тем аминокислотам или другим соединениям, которые они не способны синтезировать.

Пуриновые и пиримидиновые основания и их производные (аденин, гуанин, цитозин, урацил, тимин и др.) являются факторами роста для разных видов стрептококков, некоторые азотистые основания нужны для роста стафилококков и других бактерий. В нуклеотидах нуждаются некоторые виды микоплазм.

Липиды, в частности компоненты фосфолипидов -- жирные кислоты, нужны для роста некоторых стрептококков, микоплазм. Все виды микоплазм ауксотрофны по холестерину и другим сте-ринам, что отличает их от других прокариот. Эти соединения входят в состав их цитоплазматической мембраны.

Витамины, главным образом группы В, входят в состав ко-ферментов или их простетических групп. Многие бактерии ауксотрофны по определенным витаминам. Например, коринебактерии дифтерии, шигеллы нуждаются в никотиновой кислоте или ее амиде, который входит в состав НАД и НАДФ, золотистый стафилококк, пневмококк, бруцеллы -- тиамине (ВО, входящем в состав пирофосфата, некоторые виды стрептококков, бациллы столбняка -- в пантотеновой кислоте, являющейся составной частью кофермента КоА и т. д. Кроме того, факторами роста для многих бактерий являются фолиевая кислота, биотин, а также темы -- компоненты цитохромов. Последние необходимы гемофильным бактериям, микобактериям туберкулеза и др.

Биологическое окисление (энергетический метаболизм)

Процесс биологического окисления дает энергию, необходимую для жизни клетки. Сущность процесса заключается в последовательном окислении субстратов с постепенным освобождением энергии. Энергия запасается в молекулах АТФ.

Окислению подвергаются углеводы, спирты, органические кислоты, жиры и другие вещества. Но для большинства микроорганизмов источником энергии служат гексозы, в частности, глюкоза.

У микроорганизмов существует два типа биологического окисления: аэробный и анаэробный. При аэробном типе участвует кислород, и этот процесс называется дыханием в строгом смысле слова. При анаэробном типе биологического окисления освобождение энергии из органических молекул происходит без участия кислорода и называется брожением.

Начальный этап анаэробного расщепления глюкозы с образованием пировиноградной кислоты (ПВК) происходит одинаково. Эта

кислота является тем центральным пунктом, от которого расходятся пути дыхания и многих видов брожений.

При аэробном типе дыхания пировиноградная кислота вступает в цикл трикарбоновых кислот. Водород ПВК поступает в дыхательную цепь. Это цепь окислительных ферментов (цитохромы и цитохромоксидаза). По цепи цитохромов передается водород и присоединяется к активированному под действием цитохромоксидазы кислороду с образованием воды. Конечные продукты аэробного окисления глюкозы - диоксид углерода (углекислота) и вода. В процессе дыхания на одну молекулу глюкозы образуется 38 молекул АТФ.

При анаэробном типе биологического окисления энергия образуется в результате брожений. При спиртовом брожении ПВК превращается в конечном итоге в спирт и углекислоту. Конечным продуктом молочнокислого брожения является молочная кислота, маслянокислого брожения - масляная кислота. При процессах брожения на одну молекулу глюкозы образуется только 2 молекулы АТФ.

Микробную природу брожений впервые открыл и доказал Пастер. Изучая маслянокислое брожение, Пастер впервые столкнулся с возможностью жизни без кислорода, то есть с анаэробиозом. Он также установил явление, которое впоследствии было названо "эффектом Пастера": прекращение процесса брожения при широком доступе кислорода.

Анаэробиоз существует только среди прокариотов. Все микроорганизмы по типу дыхания делятся на следующие группы: облигатные аэробы, облигатные анаэробы, факультативные анаэробы, микроаэрофилы.

Облигатные аэробы размножаются только при наличии свободного кислорода. К ним можно отнести микобактерии туберкулеза, холерный вибрион, чудесную палочку. ,

Облигатные или строгие анаэробы получают энергию при отсутствии доступа кислорода. Они имеют неполный набор окислительно-восстановительных ферментов, у них нет цитохромной системы, поэтому у них не происходит полного окисления субстрата (глюкозы) до конечных продуктов - СО₂ и Н₂О. Более того, в присутствии свободного кислорода образуются токсические соединения: перекись водорода Н₂О₂ и свободный перекисный радикал кислорода О₂. Аэробы при этом не погибают, так как продуцируют ферменты, разрушающие эти токсические соединения (супероксиддисмутазу и каталазу). Спорообразующие анаэробы в этих условиях прекращают размножение и превращаются в споры. Неспорообразующие анаэробы погибают даже при кратковременном контакте с кислородом.

К облигатным спорообразующим анаэробам относятся клостридии столбняка, ботулизма, анаэробной раневой инфекции; к неспорообразующим анаэробам - бактероиды, пептобактерии, бифидумбактерии.

Большинство патогенных бактерий - факультативные (условные) анаэробы, например, энтеробактерии. Они имеют полный набор ферментов и при широком доступе кислорода окисляют глюкозу до конечных продуктов; при низком содержании кислорода они вызывают брожение.

Микроаэрофилы размножаются в присутствии небольших количеств кислорода. Например, кампилобактеры могут размножаться при 3-6% кислорода.

Рост и размножение микроорганизмов

Термином "рост" обозначают увеличение размеров отдельной особи, а "размножение" - увеличение числа особей в популяции.

Бактерии размножаются путем бинарного деления пополам, реже путем почкования. У грамположительных бактерий из клеточной стенки и цитоплазматической мембраны образуется перегородка, врастающая внутрь. У грамотрицательных бактерий образуется перетяжка, и затем происходит разделение клетки на две особи.

Делению клеток предшествует репликация бактериальной хромосомы по полуконсервативному типу. При этом двуспиральная цепь ДНК раскручивается, каждая нить достраивается комплиментарной нитью и в результате каждая дочерняя клетка получает одну материнскую нить и одну вновь образованную.

Быстрота размножения разных видов бактерий различна. Большинство бактерий делятся каждые 15-30 минут. Микобактерии туберкулеза делятся медленно - одно деление за 18 часов, спирохеты - одно деление за 10 часов.

Если посеять бактерии в жидкую питательную среду определенного объема и затем каждый час брать пробу и определять количество живых бактерий в такой замкнутой среде и составить график, на котором по оси абсцисс откладывать время в часах, а по оси ординат логарифм количества живых бактерий, то получим кривую роста бактерий. Рост бактерий подразделяют на несколько фаз:

1) латентная фаза (лаг-фаза) - бактерии адаптируются к питательной среде, количество их не увеличивается;

2) фаза логарифмического роста - количество бактерий увеличивается в геометрической прогрессии;

3) фаза стационарного роста, во время которой число вновь образованных бактерий уравнивается числом погибших, и количество живых бактерий остается постоянным, достигая максимального уровня. Это М-концентрация - величина, характерная для каждого вида бактерий;

4) фаза отмирания, когда число отмирающих клеток начинает преобладать над числом жизнеспособных бактерий вследствие накопления продуктов метаболизма и истощения среды.

Культура бактерий в такой замкнутой несменяющейся среде называется периодической. Если же в засеянный объем непрерывно подают свежую питательную среду и удаляют такое же количество жидкости, то такую культуру называют непрерывной. Количество живых бактерий в такой культуре будет постоянно в М-концентрации. Непрерывное культивирование применяют в микробиологической промышленности.

19. Питательные среды. Классификация их по назначению, происхождению, составу. Основные требования к питательным средам. Приготовление МПБ и МПА

По составу и происхождению питательные среды бывают естественные, искусственные и синтетические. Естественные питательные среды - это натуральный продукт, например, картофель, другие овощи. Искусственные питательные среды готовят по определенной прописи из продуктов с добавлением органических и неорганических соединений. Синтетические среды содержат определенные химические соединения в известных концентрациях.

По консистенции питательные среды бывают жидкие, полужидкие, плотные. В качестве уплотнителя обычно применяют агар-агар - полисахарид, выделенный из морских водорослей. Агар-агар не используется микроорганизмами в качестве питательного вещества, образует в воде гель, плавящийся при 100°С и застывающий при 45°С.

Для получения плотной питательной среды агар-агар добавляют в концентрации 1,5-2%, для полужидкой - 0,5%.

По целевому назначению питательные среды могут быть разделены на обычные (простые), специальные, элективные, дифференциально-диагностические.

Питательные среды должны соответствовать определенным требованиям. Они должны содержать все питательные вещества, необходимые для размножения данного вида микробов. Одни патогенные микроорганизмы растут на простых питательных средах, другие для своего размножения нуждаются в добавлении крови, сыворотки крови, витаминов.

В питательных средах должны быть созданы определенные условия путем добавления хлорида натрия или буферных растворов. Для большинства бактерий благоприятной является питательная среда, содержащая 0,5% хлорида натрия. Реакция питательной среды, благоприятная для большей части патогенных бактерий - слабощелочная, что соответствует рН=7,2-7,4. Холерный вибрион растет при рН=7,8-8,5, грибы - при рН=5-5,5. Питательные среды должны быть влажными, то есть содержать достаточное количество воды, быть по возможности прозрачными и стерильными, то есть до посева не содержать микробов.

Простые питательные среды применяют для культивирования большинства микроорганизмов, это мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА).

Культивирование, то есть выращивание микроорганизмов в лаборатории, применяется для изучения их свойств и для получения биомассы. Бактерии, грибы, актиномицеты, спирохеты и некоторые простейшие культивируются на питательных средах. Хламидии, риккетсии, вирусы и некоторые простейшие способны размножаться только в организме животного или в живых клетках.

Культуральные свойства данного вида микроорганизмов - это: 1) условия, необходимые для размножения, и 2) характер роста на питательных средах. Культуральные свойства - это одна из характеристик, которые учитываются при идентификации (определения вида) микроорганизмов.

Питательные среды

Питательные среды должны соответствовать определенным требованиям. Они должны содержать все питательные вещества, необходимые для размножения данного вида микробов. Одни патогенные микроорганизмы растут на простых питательных средах, другие для своего размножения нуждаются в добавлении крови, сыворотки крови, витаминов.

В питательных средах должны быть созданы определенные условия путем добавления хлорида натрия или буферных растворов. Для большинства бактерий благоприятной является питательная среда, содержащая 0,5% хлорида натрия. Реакция питательной среды, благоприятная для большей части патогенных бактерий - слабощелочная, что соответствует рН=7,2-7,4. Холерный вибрион растет при рН=7,8-8,5, грибы - при рН=5-5,5. Питательные среды должны быть влажными, то есть содержать достаточное количество воды, быть по возможности прозрачными и стерильными, то есть до посева не содержать микробов.

По составу и происхождению питательные среды бывают естественные, искусственные и синтетические. Естественные питательные среды - это натуральный продукт, например, картофель, другие овощи. Искусственные питательные среды готовят по определенной прописи из продуктов с добавлением органических и неорганических соединений. Синтетические среды содержат определенные химические соединения в известных концентрациях.

По консистенции питательные среды бывают жидкие, полужидкие, плотные. В качестве уплотнителя обычно применяют агар-агар -полисахарид, выделенный из морских водорослей. Агар-агар не используется микроорганизмами в качестве питательного вещества, образует в воде гель, плавящийся при 100°С и застывающий при 45°С.

Для получения плотной питательной среды агар-агар добавляют в концентрации 1,5-2%, для полужидкой - 0,5%.

По целевому назначению питательные среды могут быть разделены на обычные (простые), специальные, элективные, дифференциально-диагностические.

Обычные (простые) питательные среды применяют для культивирования большинства микроорганизмов, это мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА).

Специальные питательные среды применяют для культивирования микроорганизмов, которые не растут на простых средах. Например, кровяной агар и сахарный бульон для стрептококка, сывороточный агар для менингококка и гонококка.

Элективные питательные среды используют для выделения одного какого-либо вида из смеси различных бактерий. Данный вид бактерий растет на этой среде быстрее и лучше других, опережая их в своем росте; рост других бактерий задерживается на этой среде. Например, свернутая сыворотка для палочки дифтерии, щелочная пептонная вода для холерного вибриона, желчный бульон для палочки брюшного тифа, солевые среды для стафилококка.

Дифференциально-диагностические питательные среды применяются для отличия одних видов бактерий от других по их ферментативной активности (см. соответствующий раздел).

20. Рост и размножение микробов. Определение понятия: фазы размножения, причины отмирания микробов. Условия культивирования

Рост и размножение микроорганизмов

Термином "рост" обозначают увеличение размеров отдельной особи, а "размножение" - увеличение числа особей в популяции.

Бактерии размножаются путем бинарного деления пополам, реже путем почкования. У грамположительных бактерий из клеточной стенки и цитоплазматической мембраны образуется перегородка, врастающая внутрь. У грамотрицательных бактерий образуется перетяжка, и затем происходит разделение клетки на две особи.

Делению клеток предшествует репликация бактериальной хромосомы по полуконсервативному типу. При этом двуспиральная цепь ДНК раскручивается, каждая нить достраивается комплиментарной нитью и в результате каждая дочерняя клетка получает одну материнскую нить и одну вновь образованную.

Быстрота размножения разных видов бактерий различна. Большинство бактерий делятся каждые 15-30 минут. Микобактерии туберкулеза делятся медленно - одно деление за 18 часов, спирохеты - одно деление за 10 часов.

Если посеять бактерии в жидкую питательную среду определенного объема и затем каждый час брать пробу и определять количество живых бактерий в такой замкнутой среде и составить график, на котором по оси абсцисс откладывать время в часах, а по оси ординат логарифм количества живых бактерий, то получим кривую роста бактерий. Рост бактерий подразделяют на несколько фаз:

1) латентная фаза (лаг-фаза) - бактерии адаптируются к питательной среде, количество их не увеличивается;

2) фаза логарифмического роста - количество бактерий увеличивается в геометрической прогрессии;

3) фаза стационарного роста, во время которой число вновь образованных бактерий уравнивается числом погибших, и количество живых бактерий остается постоянным, достигая максимального уровня. Это М-концентрация - величина, характерная для каждого вида бактерий;

4) фаза отмирания, когда число отмирающих клеток начинает преобладать над числом жизнеспособных бактерий вследствие накопления продуктов метаболизма и истощения среды.

Культура бактерий в такой замкнутой несменяющейся среде называется периодической. Если же в засеянный объем непрерывно подают свежую питательную среду и удаляют такое же количество жидкости, то такую культуру называют непрерывной. Количество живых бактерий в такой культуре будет постоянно в М-концентрации. Непрерывное культивирование применяют в микробиологической промышленности.

Обычно причиной гибели микроорганизмов, при их поддержании на плотных питательных средах, является их обезвоживание. Применение в качестве среды для поддержания культуры полужидкого питательного агара и засев микроорганизмов "уколом" внутрь агара уменьшают риск обезвоживания. Преследуя ту же цель, покрывают растущие на скошенном агаре или столбиках агара культуры слоем жидкого стерильного минерального масла вазелинового или парафинового) толщиной 2см.

Условия культивирования: температура, аэробные или анаэробные условия.

Температура должна быть оптимальной для данного вида. Большинство патогенных бактерий размножаются при 37°С. Однако для некоторых видов оптимальной является более низкая температура, что связано с особенностями их экологии. Так, для палочки чумы, естественным местом обитания которой являются грызуны в период зимней спячки, оптимум температуры составляет 28°С, как и для лептоспир, для палочки ботулизма - 28°С-35°С.

Кроме оптимальной температуры, для культивирования микроорганизмов, в зависимости от вида, необходима аэробность или анаэробность среды.

21. Процесс дыхания микроорганизмов. Классификация микроорганизмов по способу дыхания. Схемы биологического окисления у аэробов и анаэробов

Процесс биологического окисления дает энергию, необходимую для жизни клетки. Сущность процесса заключается в последовательном окислении субстратов с постепенным освобождением энергии. Энергия запасается в молекулах АТФ.

Окислению подвергаются углеводы, спирты, органические кислоты, жиры и другие вещества. Но для большинства микроорганизмов источником энергии служат гексозы, в частности, глюкоза.

У микроорганизмов существует два типа биологического окисления: аэробный и анаэробный. При аэробном типе участвует кислород, и этот процесс называется дыханием в строгом смысле слова. При анаэробном типе биологического окисления освобождение энергии из органических молекул происходит без участия кислорода и называется брожением.

Начальный этап анаэробного расщепления глюкозы с образованием пировиноградной кислоты (ПВК) происходит одинаково. Эта кислота является тем центральным пунктом, от которого расходятся пути дыхания и многих видов брожений.

При аэробном типе дыхания пировиноградная кислота вступает в цикл трикарбоновых кислот. Водород ПВК поступает в дыхательную цепь. Это цепь окислительных ферментов (цитохромы и цитохромоксидаза). По цепи цитохромов передается водород и присоединяется к активированному под действием цитохромоксидазы кислороду с образованием воды. Конечные продукты аэробного окисления глюкозы - диоксид углерода (углекислота) и вода. В процессе дыхания на одну молекулу глюкозы образуется 38 молекул АТФ.

При анаэробном типе биологического окисления энергия образуется в результате брожений. При спиртовом брожении ПВК превращается в конечном итоге в спирт и углекислоту. Конечным продуктом молочнокислого брожения является молочная кислота, маслянокислого брожения - масляная кислота. При процессах брожения на одну молекулу глюкозы образуется только 2 молекулы АТФ.

Все микроорганизмы по типу дыхания делятся на следующие группы: облигатные аэробы, облигатные анаэробы, факультативные анаэробы, микроаэрофилы.

Облигатные аэробы размножаются только при наличии свободного кислорода. К ним можно отнести микобактерии туберкулеза, холерный вибрион, чудесную палочку.

Облигатные или строгие анаэробы получают энергию при отсутствии доступа кислорода. Они имеют неполный набор окислительно-восстановительных ферментов, у них нет цитохромной системы, поэтому у них не происходит полного окисления субстрата (глюкозы) до конечных продуктов - СО2 и Н2О. Более того, в присутствии свободного кислорода образуются токсические соединения: перекись водорода Н2О2 и свободный перекисный радикал кислорода О2. Аэробы при этом не погибают, так как продуцируют ферменты, разрушающие эти токсические соединения (супероксиддисмутазу и каталазу). Спорообразующие анаэробы в этих условиях прекращают размножение и превращаются в споры. Неспорообразующие анаэробы погибают даже при кратковременном контакте с кислородом.

К облигатным спорообразующим анаэробам относятся клостридии столбняка, ботулизма, анаэробной раневой инфекции; к неспорообразующим анаэробам - бактероиды, пептобактерии, бифидумбактерии.

Большинство патогенных бактерий - факультативные (условные) анаэробы, например, энтеробактерии. Они имеют полный набор ферментов и при широком доступе кислорода окисляют глюкозу до конечных продуктов; при низком содержании кислорода они вызывают брожение.

Микроаэрофилы размножаются в присутствии небольших количеств кислорода. Например, кампилобактеры могут размножаться при 3-6% кислорода.

22. Методы культивирования облигатных анаэробов: принципы, аппаратура

Для культивирования анаэробов необходимо понизить окислительно-восстановительный потенциал среды, создать анаэробиоз путем удаления кислорода физическими, химическими или биологическими методами.

К физическим методам можно отнести:

1) механическое удаление воздуха с помощью насоса из анаэростата, в котором помещают чашки с посевами. Одновременно можно заменить воздух индифферентным газом: азотом, водородом, углекислым газом.

2) выращивание в среде, содержащей редуцирующие вещества. Среда Китта-Тароцци - это сахарный бульон с кусочками печени или мяса. Глюкоза и кусочки органов обладают редуцирующей способностью. Среду заливают сверху слоем вазелинового масла, чтобы преградить доступ кислорода воздуха.

3) Наиболее простой, но менее надежный способ - выращивание в глубине высокого столбика сахарного агара.

Химические методы заключаются в том, что чашки с посевами анаэробов ставят в герметически закрытый эксикатор, куда помещают химические вещества, например, пирогаллол и щелочь, реакция между которыми идет с поглощением кислорода.

Биологический метод основан на одновременном выращивании анаэробов и аэробов на плотных питательных средах в чашках Петри, герметически закрытых после посева. Вначале кислород поглощается растущими аэробами, а затем начинается рост анаэробов.

Выделение чистой культуры анаэробов начинают с накопления анаэробных бактерий путем посева на среду Китта-Тароцци. В дальнейшем получают изолированные колонии одним из двух способов:

1) посев материала производят путем смешивания с расплавленным теплым сахарным агаром в стеклянных трубках. После застывания агара в глубине его вырастают изолированные колонии, которые извлекают путем распила трубки и пересевают на среду Китта-Тароцци (способ Вейнберга);

2) посев материала производят на чашки с питательной средой и инкубируют в анаэростате. Выросшие на чашке изолированные колонии пересевают на среду Китта-Тароцци (способ Цейсснера).

23. Значение определения морфологических и культуральных свойств микробов в микробиологической диагностике (привести конкретные примеры)

Культивирование, то есть выращивание микроорганизмов в лаборатории, применяется для изучения их свойств и для получения биомассы. Бактерии, грибы, актиномицеты, спирохеты и некоторые простейшие культивируются на питательных средах. Хламидии, риккетсии, вирусы и некоторые простейшие способны размножаться только в организме животного или в живых клетках.

Культуральные свойства данного вида микроорганизмов - это: 1) условия, необходимые для размножения, и 2) характер роста на питательных средах. Культуральные свойства - это одна из характеристик, которые учитываются при идентификации (определения вида) микроорганизмов.

24. Ферменты микробов. Классификация по биологической роли и субстратной специфичности; использование для идентификации микробов

Ферменты - катализаторы биологических процессов. Характерным свойством ферментов является их специфичность. Каждый фермент участвует только в определенной реакции с определенным химическим соединением.

Ферменты, которые выделяются бактериальной клеткой в окружающую среду и осуществляют внеклеточное переваривание, называются экзоферментами. К экзоферментам относится также беталактамаза, которая разрушает пенициллин и другие бета-лактамные антибиотики, защищая бактерии от их действия.

Эндоферменты участвуют в процессах метаболизма внутри клетки.

Для бактерий, в силу их малых размеров, характерна высокая степень саморегуляции продукции ферментов. В этом отношении ферменты можно разделить на конститутивные и адаптивные. Конститутивные ферменты продуцируются клеткой постоянно. Адаптивные ферменты, в свою очередь, подразделяются на индуцируемые и ингибируемые. Продукция индуцируемых ферментов происходит в присутствии субстрата. Например, ферменты, расщепляющие лактозу, образуются в клетке в только присутствии этого углевода. Продукция ингибируемых ферментов, напротив, подавляется присутствием в среде конечного субстрата в достаточно большой концентрации (например, триптофана).

Многие патогенные бактерии, кроме ферментов обмена, выделяют ферменты, являющиеся факторами вирулентности. Например, такие ферменты, как гиалуронидаза, коллагеназа, дезоксирибонуклеаза, нейраминидаза способствуют проникновению и распространению патогенного микроба в организме.

Способность бактерий продуцировать определенные ферменты - признак настолько постоянный, что его используют для идентификации, то есть определения вида бактерий. Определяют сахаролитические свойства (ферментацию углеводов) и протеолитические свойства (ферментацию белков и пептона).

Для микробов характерна высокая ферментативная активность. Это используется в промышленности. В медицине находят применение такие лечебные средства, как стрептокиназа (фибринолизин стрептококков), террилитин (протеаза Aspergillus terricola). Ферменты микробного происхождения - липазы и протеазы, входящие в состав моющих средств и стиральных порошков, расщепляют белковые и жировые загрязнения до воднорастворимых веществ, которые легко смываются водой.

25. Методы определения протеолитической и сахаролитической способности микробов: питательные среды, продукты расщепления и способы их выявления

В микробиологической практике изучение ферментативной активности используют для идентификации микроорганизмов, поскольку каждый микробный вид обладает определенным набором ферментов.

Для определения протеолитической активности микробы засевают уколом в столбик желатина и после 3-5 суток инкубирования при комнатной температуре отмечают характер разжижения желатина: в виде воронки, гвоздя, чулка или в виде опрокинутой елки. Протеолитическую активность определяют также по образованию продуктов разложения белка: индола, сероводорода, аммиака. Для их определения засевают микроорганизмы в мясо-пептонный бульон, и между горлышком пробирки и ватной пробкой помещают индикаторные бумажки, исключая их контакт со средой. При образовании индола бумага, пропитанная насыщенным раствором щавелевой кислоты, приобретает розовый цвет; в присутствии сероводорода бумага, пропитанная ацетатом свинца, чернеет; при образовании аммиака красная лакмусовая бумажка синеет.

Для определения сахаролитических свойств микробов применяют дифференциально-диагностические среды такие, как среды Гисса, среда Олькеницкого, среда Эндо, среда Левина, среда Плоскирева.

Среды Эндо, Левина, Плоскирева в чашках Петри применяются для дифференцировки бактерий кишечной группы по их способности сбраживать лактозу. Эти среды содержат питательный агар, лактозу и индикатор, изменяющий свой цвет в кислой среде - индикатор рН. Если посеять на такую среду бактерии, которые сбраживают лактозу, например кишечную палочку, то в результате сбраживания лактозы образуется кислота, и индикатор изменит свой цвет в кислой среде. Поэтому колонии кишечной палочки на таких средах будут окрашенными соответственно цвету индикатора: на среде Эндо и среде Плоскирева - в красный цвет, на среде Левина - в черно-синий. Колонии бактерий, не сбраживающих лактозу, таких как и палочки дизентерии, будут бесцветными.

Среды Гисса (среды "пестрого ряда") готовятся на основе пептонной воды или полужидкого мясо-пептонного агара. Содержат какой-либо один углевод или многоатомный спирт и индикатор. При росте на среде Гисса микроба, сбраживающего данный субстрат с образованием кислоты и газа, среда изменит цвет, в полужидкой среде появятся пузырьки и разрывы в толще агара, в жидкой среде - пузырек газа в стеклянном поплавке. При сбраживании субстрата только до кислоты происходит лишь изменение цвета среды.

Применяются также комбинированные среды, содержащие не один углевод, а два или три, например, среда Олькеницкого. Одна пробирка этой среды заменяет скошенный агар и среды Гисса с лактозой, глюкозой и сахарозой. После стерилизации в расплавленном виде среду в пробирке скашивают так, чтобы получился столбик и скошенная часть. Посев производится штрихом по скошенной части и уколом в столбик. При сбраживании лактозы или сахарозы изменяется цвет всей среды, при сбраживании одной глюкозы изменяется цвет только столбика. Образование газа определяется по наличию пузырьков в столбике агара. При выделении микробами аммиака цвет среды не меняется. Образование сероводорода проявляется почернением в столбике агара.

Для экспресс-метода определения ферментативной активности бактерий применяются микротестсистемы и система индикаторная бумажная (СИБ)

Микротестсистема представляет собой контейнер из прозрачного полистирола, состоящий из нескольких ячеек Ячейки содержат высушенные питательные среды с углеводами и индикаторами рН В каждую ячейку засевают взвесь культуры бактерий определенной густоты В контрольные ячейки наливают физ. раствор Результат учитывают после 3 - 4-хчасовой инкубации в термостате по изменению цвета индикатора

Системы индикаторные бумажные (СИБ) для идентификации семейства энтеробактерий представляет собой диски или полоски хроматографической бумаги, покрытые защитной пленкой и содержащие определенный субстрат и индикатор В пробирки с физиологическим или буферным раствором вносят исследуемую культуру, затем помещают диски В контрольные пробирки культуру бактерий не вносят Результат учитывают по изменению цвета индикатора Для определения сероводорода диск помещают на поверхность МПА, засеянного уколом, что позволяет одновременно определить подвижность

Во всех пробирках учитывают предварительный результат в тот же день и окончательный - на следующий день

Оксидазная активность определяется путем растирания культуры на индикаторной бумажке Результат учитывается через минуту.

26. Дифференциально-диагностические среды: перечислить основные виды, принципиальный состав, назначение и использование в практике

Для отличия одних видов бактерий от других на основании их ферментативной активности применяются дифференциально-диагностические среды. Например, среды Гисса, среда Эндо, среда Левина, среда Плоскирева, среда Олькеницкого. Среды Эндо, Левина, Плоскирева в чашках Петри применяются для дифференцировки бактерий кишечной группы по способности сбраживать лактозу. Эти среды содержат питательный агар, лактозу и индикатор, изменяющий свой цвет в кислой среде (индикатор рН). Если посеять на такую среду бактерии, которые сбраживают лактозу, например, кишечную палочку, то в результате сбраживания лактозы образуется кислота, и индикатор изменит свой цвет в кислой среде. Поэтому колонии кишечной палочки на таких средах будут окрашены соответственно цвету индикатора: на среде Эндо и среде Плоскирева -- в красный цвет, на среде Левина -- в черно-синий.

Если же на эти среды посеять бактерии, которые не сбраживают лактозу, например, палочки брюшного тифа или палочки дизентерии, то кислота не образуется, реакция среды останется слабощелочной и цвет индикатора не изменится. Поэтому колонии бактерий, не сбраживающих лактозу, на этих средах будут бесцветными. Среду Плоскирева можно отнести также и к элективным средам для выделения палочек дизентерии, так как эта среда содержит соли желчных кислот, задерживающих рост кишечной палочки, и краситель бриллиантовый зеленый, задерживающий рост воздушной кокковой микрофлоры.

Висмут-сульфит агар -- это дифференциально-диагностическая среда, применяемая главным образом при диагностике сальмонеллезов. При росте сальмонелл происходит восстановление висмута из его солей и колонии сальмонелл окрашиваются в черный цвет. Дифференциально-диагностические среды Гисса («пестрого» ряда) готовятся на основе жидкой среды (пептонной воды) или полужидкого мясо-пептонного агара. Содержат какой либо углевод или многоатомный спирт (лактозу, глюкозу, маннит, сахарозу) и индикатор, который меняет свой цвет в кислой среде.

В пробирку с жидкой средой Гисса помещен стеклянный поплавок. Если на среду Гисса посеять микроб, который сбраживает данный углевод с образованием кислоты и газа, то есть до конечных продуктов, то среда изменит свой цвет, в полужидкой среде появятся пузырьки и разрывы в толще агара, в жидкой среде -- пузырек газа в поплавке. При сбраживании углевода только до промежуточных продуктов (до кислоты) происходит только изменение цвета среды, Применяются также комбинированные среды, содержащие не один углевод, а два или три, например, среда Олькеницкого -- трехсахарный агар с мочевиной. Одна пробирка среды Олькеницкого заменяет скошенный агар и среды Гисса с лактозой, сахарозой и глюкозой.

Среда готовится на основе не очень плотного МПА. Содержит лактозу (1%), сахарозу (1%), глюкозу (0,1 %), мочевину, соль Мора (сульфат железа), гипосульфит натрия и индикатор. Среду после стерилизации в расправленном виде наливают в пробирку так, чтобы получился столбик и скошенная часть. Посев производится штрихом по скошенной части и уколом в столбик. При сбраживании углеводов, которые содержатся в большем количестве (лактозы, сахарозы или обоих сахаров), изменяется цвет всей среды; при сбраживании только глюкозы изменяется цвет столбика, а скошенная часть остается без изменений. Образование газа определяется по наличию пузырьков в столбике агара. Культуры, расщепляющие мочевину с образованием аммиака, дают щелочную реакцию.

При этом происходит нейтрализация кислоты, образующейся при сбраживании углеводов, и цвет среды не изменяется. Расщепление мочевины свойственно протеям и некоторым кишечным палочкам. Патогенные энтеробактерии не разлагают мочевину. Добавление соли Мора и гипосульфита позволяет также изучить способность бактерий к образованию сероводорода по почернению в столбике агара в результате превращения сульфата железа в сульфид черного цвета.