Медицинская микробиология

Гены, необходимые для жизнедеятельности и определяющие видовую специфичность, расположены у бактерий чаще всего в единственной ковалентно замкнутой молекуле ДНК - хромосоме . Область, где локализована хромосома, называется нуклеоид и не окружена мембраной. В связи с этим новосинтезированная мРНК сразу доступна для связывания с рибосомами, а транскрипция и трансляция сопряжены.

Плазмиды -- внехромосомные (дополнительные по отношению к хромосоме) генетические структуры бактерий, способные автономно размножаться и существовать в цитоплазме бактериальной клетки. Некоторые плазмиды могут с определенной частотой включаться (интегрироваться) в бактериальный геном и размножаться (копироваться) затем вместе с ним как его составная часть

В зависимости от способности или неспособности передаваться из одной бактериальной клетки в другую в процессе конъюгации различают конъюгативные (трансмиссивные) и неконъюгативные (нетрансмиссивные) плазмиды. При передаче некоторых конъюгативных R-плазмид в клетки отдельных видов бактерий наблюдается распад (диссоциация) этих плазмид с образованием «чистого» полового фактора и неконъюгативной плазмиды, несущей гены лекарственной устойчивости.

Плазмиды представляют собой молекулы ДНК с молекулярной массой от 1Ч106 до 200Ч106. Эти молекулы, как правило, замкнуты в кольцо и находятся в клетке в сверхспирализованной форме. Неконъюгативные плазмиды, имеют относительно простую генетическую организацию. Конъюгативные плазмиды имеют более крупные размеры и наряду с генетической областью, контролирующей их репликацию, содержат также так называемую tra-область (англ. transfer перенос). Эта область определяет способность клетки, содержащей плазмиды , быть генетическим донором, т.е. вступать в конъюгацию с другой клеткой (реципиентом) и передавать ей свой генетический материал (плазмидную либо хромосомную ДНК). Неконъюгативные плазмиды обычно не содержат tra-области и поэтому не могут самостоятельно передаваться из одной клетки в другую. Однако передача неконъюгативной П. возможна за счет продуктов (белков) tra-генов конъюгативной П. , находящейся вместе с неконъюгативной П. в одной и той же клетке.

F-плазмиды. F-плазмиды контролируют синтез F-пилей, способствующих спариванию бактерий-доноров (F+) c бактериями-реципиентами (F-).

R-плазмиды (от англ. resistance, устойчивость) кодируют устойчивость к лекарственным препаратам.

Плазмиды патогенности контролируют вирулентные свойства бактерий и токсинообразование (плазмиды включают tox+-гены).

Плазмиды бактериоциногении кодируют синтез бактериоцинов - белковых продуктов, вызывающих гибель бактерий того же или близких видов.

Существует несколько систем классификации плазмид, базирующихся на:

топологии (линейные или кольцевые),

механизмах репликации (см. выше),

маркерных генов, содержащихся на плазмидах (например: устойчивость к антибиотикам, гены биодеградации ксенобиотиков, системы рестрикции -- модификации, гены синтеза бактериоцинов и т. д. -- или полному отсутствию оных -- криптические плазмиды),

круге хозяев,

копийности,

совместимости,

конъюгативные (способные к переносу в другие клетки)/неконъюгативные.

17.Строение генома бактерий. Понятие о генотипе и фенотипе. Виды наследуемой изменчивости. Механизмы передачи генетического материала у бактерий

Бактериальный геном состоит из генетических элементов, способных к самостоятельной репликации, т. е. репликонов. Репликонами являются бактериальная хромосома и плазмиды.

Наследственная информация хранится у бактерий в форме последовательности нуклеотидов ДНК, Бактериальная хромосома представлена одной двухцепочечной молекулой ДНК кольцевой формы. Бактериальная хромосома формирует компактный нуклеоид бактериальной клетки. Бактериальная хромосома имеет гаплоидный набор генов. Она кодирует жизненно важные для бактериальной клетки функции.

Плазмиды бактерий представляют собой двухцепочечные молекулы ДНК. Они кодируют не основные для жизнедеятельности бактериальной клетки функции, но придающие бактерии преимущества при попадании в неблагоприятные условия существования.

Свойства микроорганизмов, как и любых других организмов, определяются их генотипом, т.е. совокупностью генов данной особи. Термин «геном» в отношении микроорганизмов -- почти синоним понятия «генотип».

Фенотип представляет собой результат взаимодействия между генотипом и окружающей средой, т. е. проявление генотипа в конкретных условиях обитания. Фенотип микроорганизмов хотя и зависит от окружающей среды, но контролируется генотипом.

В основе изменчивости лежит либо изменение реакции генотипа на факторы окружающей среды, либо изменение самого генотипа в результате мутации генов или их рекомбинации. В связи с этим фенотипическую изменчивость подразделяют на на­следственную и ненаследственную.

Ненаследственная (средовая, модификационная) изменчивость обусловлена влиянием внутри- и внеклеточных факторов на проявление генотипа. При устранении фактора, вызвавшего модификацию, данные изменения исчезают.

Наследственная (генотипическая) изменчивость, связанная с мутациями, -- мутационная изменчивость. Основу мутации составляют изменения последовательности нуклеотидов в ДНК, полная или частичная их утрата. Наследственная изменчивость, связанная с рекомбинациями, называется рекомбинационной изменчивостью.

Механизмы передачи генетического материала у бактерий.

Конъюгация бактерий состоит в переходе генетического материала (ДНК) из клетки-донора («мужской») в клетку-реципиент («женскую») при контакте клеток между собой.

«Мужская» клетка содержит F-фактор, или половой фактор, который контролирует синтез так называемых половых пилей, или F-пилей. Клетки, не содержащие F-фактора, являются «женскими»; при получении F-фактора они превращаются в «мужские» и сами становятся донорами. F-фактор располагается в цитоплазме в виде кольцевой двунитчатой молекулы ДНК, т. е. является плазмидой.

Трансдукция -- передача ДНК от бактерии-донора к бактерии-реципиенту при участии бактериофага. Различают неспецифическую (общую) трансдукцию, при которой возможен перенос любого фрагмента ДНК донора, и специфическую -- перенос определенного фрагмента ДНК донора только в определенные участки ДНК реципиента. Неспецифическая трансдукция обусловлена включением ДНК донора в головку фага дополнительно к геному фага или вместо генома фага (дефектные фаги). Специфическая трансдукция обусловлена замещением некоторых генов фага генами хромосомы клетки-донора.

Трансформация заключается в том, что ДНК, выделенная из бактерий в свободной растворимой форме, передается бактерии-реципиенту. При трансформации рекомбинация происходит, если ДНК бактерий родственны друг другу. В этом случае возможен обмен гомологичных участков собственной и проникшей извне ДНК.

Транспозоны-- это сегменты ДНК, обладающие теми же свойствами, что и IS-элементы, но имеющие структурные гены, т. е. гены, обеспечивающие синтез молекул, обладающих специфическим биологическим свойством, например токсичностью, или обеспечивающих устойчивость к антибиотикам.



18.Механизмы изменчивости. Мутации, их особенности, типы мутантов у бактерий

Различают два вида изменчивости - фенотипическую и генотипическую

Фенотипическая изменчивость - модификации - не затрагивает генотип. Модификации затрагивают большинство особей в популяции. Они не передаются по наследству и с течением времени затухают, т. е. возвращаются к исходному фенотипу.

Генотипическая изменчивость затрагивает генотип. В основе ее лежат мутации и рекомбинации.

Мутации - изменение генотипа, сохраняющееся в ряду поколений и сопровождающееся изменением фенотипа. Особенностями мутаций у бактерий является относительная легкость их выявления.

По локализации различают мутации:

1) генные (точечные);

2) хромосомные;

3) плазмидные.

По происхождению мутации могут быть:

1) спонтанными (мутаген неизвестен);

2) индуцированными (мутаген неизвестен).

Рекомбинации - это обмен генетическим материалом между двумя особями с появлением рекомбинантных особей с измененным генотипом.

У бактерий существует несколько механизмов рекомбинации:

Конъюгация - обмен генетической информацией при непосредственном контакте донора и реципиента. Наиболее высокая частота передачи у плазмид, при этом плазмиды могут иметь разных хозяев. После образования между донором и реципиентом конъюгационного мостика одна нить ДНК-донора поступает по нему в клетку-реципиент. Чем дольше этот контакт, тем большая часть донорской ДНК может быть передана реципиенту.

Слияние протопластов - механизм обмена генетической информацией при непосредственном контакте участков цитоплазматической мембраны у бактерий, лишенных клеточной стенки.

Трансформация - передача генетической информации в виде изолированных фрагментов ДНК при нахождении реципиентной клетки в среде, содержащей ДНК-донора. Для трансдукции необходимо особое физиологическое состояние клетки-реципиента - компетентность. Это состояние присуще активно делящимся клеткам, в которых идут процессы репликации собственных нуклеиновых кислот. В таких клетках действует фактор компетенции - это белок, который вызывает повышение проницаемости клеточной стенки и цитоплазматической мембраны, поэтому фрагмент ДНК может проникать в такую клетку.

Трансдукция - это передача генетической информации между бактериальными клетками с помощью умеренных трансдуцирующих фагов. Трансдуцирующие фаги могут переносить один ген или более.

Трансдукция бывает:

1) специфической (переносится всегда один и тот же ген, трансдуцирующий фаг всегда располагается в одном и том же месте);2) неспецифической (передаются разные гены, локализация трансдуцирующего фага непостоянна).

Разные виды бактерий можно различать по фенотипическим признакам, таким как форма, цвет и другие характерные подробности их колоний. Но большой прогресс в генетике бактерий был достигнут в ходе исследований мутантов одного вида, преимущественно Е. coli, отличающихся от обычных представителей незначительными чертами. Некоторые из наиболее полезных мутантов имеют фенотип, зависящий от условий, и это значит, что в так называемых пермиссивных (разрешительных) условиях они демонстрируют дикие признаки, но в других, рестриктивных (ограничивающих, или неблагоприятных) условиях у них регистрируется иной фенотип. Например, мутанты, чувствительные к температуре, обычно растут при низких температурах (например, при 28°С), но не могут расти при высокой (42°С) температуре. Мутанты, чувствительные к холоду, напротив, не растут при низкой температуре. Так, регулируя температуру, мы можем способствовать росту одних штаммов и замедлять рост других. Другим штаммам необходима питательная среда с особыми компонентами., клетки дикого типа, называемые прототрофами, могут сами производить необходимые компоненты из простых питательных веществ, таких как сахар, а мутанты ауксотрофы не могут расти без добавления в среду некоторых сложных веществ. Например, мутанты trp не могут производить одну из аминокислот -- триптофан, и поэтому растут только при наличии в питательной среде триптофана. Другие штаммы устойчивы к антибиотикам, убивающим дикие бактерии; дикие клетки strs чувствительны к стрептомицину, а мутанты strr устойчивы к нему.

19.Модификации у бактерий: кратковременные и длительные. Механизм модификаций. Отличие мутационной изменчивости от длительных модификаций

Фенотипическая изменчивость -- модификация -- не затрагивает генотип, но затрагивает большинство особей популяции. Модификации не передаются по наследству и с течением времени затухают, т. е. возвращаются к исходному фенотипу через большее (длительные модификации) или меньшее (кратковре­менные модификации) число поколений.

Морфологические модификации. В зависимости от состава и качества питательной среды, температуры и времени выращивания у бактерий могут изменяться форма, размеры клеток, способность образовывать капсулы и споры. Молодые клетки, только что помещенные в питательную среду, меньше, чем более старые. При старении культуры бактерий возникает полиморфизм клеток, в них появляются гранулы. При добавлении к среде пенициллина клетки удлиняются, иногда очень значительно. Образование спор у бактерий зависит от характера среды (плотная или жидкая), ее состава, температуры выращивания. При добавлении к среде 0,1% пептона 100% спор возникают через 48 ч, а при добавлений 2% его наблюдаются только вегетативные формы.

Культуральные модификации. Многие бактерии и грибы при росте на различных питательных средах и при разных температурах изменяют интенсивность образования пигмента. Так, чудесная палочка при комнатной температуре образует ярко-красный пигмент на питательных средах, а при 37°С он отсутствует. У бактерий наблюдаются также изменения типа колоний, которые они образуют при росте на плотных питательных средах. Одни колонии гладкие, округлой формы, с ровными краями, блестящие, однородные, небольших размеров. Это S-формы колоний (от smooth -- гладкий). Другие -- шероховатые, тусклые, часто непрозрачные, с неровными краями, неправильных очертаний, сухие. Это R-формы колоний (от rooth -- шероховатый). Гладкие S-формы могут переходить в шероховатые R-формы и обратно. Существуют и другие переходные формы колоний: слизистые (М-формы), карликовые (G-формы). Образование различных форм колоний у одного и того же вида бактерий называется диссоциациец (расщепление). Диссоциацию колоний можно получить при изменении состава питательной среды, под действием дезинфицирующих веществ, некоторых солей и т. д.

Модификации физиологических и биохимических свойств. Известно, что устойчивость к физическим и химическим агентам зависит от возраста культуры. Например, молодые клетки более чувствительны к дезинфицирующим веществам, чем старые. Типичные физиологические свойства данного вида выявляются у культур бактерий, которые находятся в стационарной фазе роста. Одним из наиболее ярких примеров изменения биохимических свойств микробов является образование ими адаптивных ферментов. Обычно культура бактерий, размножаясь на питательных средах, вырабатывает определенные ферменты, позволяющие ей усваивать питательные вещества. Каждый вид бактерий характеризуется выработкой набора ферментов, предопределенного их генотипом. Но «работают» обычно не все гены, определяющие этот набор. Выработка отдельных ферментов из всего набора обусловливается наличием определенных питательных веществ в среде. Если вещество находится в питательной среде, то появляется и фермент. При отсутствии этого вещества прекращается выработка фермента. Такие адаптивные ферменты позволяют бактериям приспособиться, адаптироваться, к определенным условиям внешней среды. Следовательно, фенотипическая изменчивость зависит от условий среды, в которых существует данный вид микроорганизмов. Приспосабливаясь к конкретным жизненным условиям, микроб реализует ту информацию, которая имеется в геноме клетки. Это позволяет ему расти и размножаться на различных питательных средах. Однако широта изменений микробов имеет определенные пределы. Вариабельность различных свойств микроорганизмов возможна в основном лишь в пределах границ, характерных для каждого вида.

20.Типы и механизмы питания бактерий. Классификация бактерий по источникам углерода и азота

По типу питания живые существа делятся на две группы: голозойные и голофитные. Голозойный тип питания характерен для животных (от высших до простейших). Микробы относятся к голофитному типу питания. Они не имеют органов для принятия пищи, и питательные вещества у них проникают через всю поверхность тела.

Различают несколько механизмов питания микробных клеток. Питательные вещества могут поступать из внешней среды в микробную клетку через клеточную стенку, капсулу, слизистые слои и цитоплазматическую мембрану. Через эти же структуры выделяются и продукты обмена, т. е. ненужные и вредные для микроорганизмов вещества. В основе механизма такого питания лежит осмотическое явление, основанное на разнице концентрации питательных веществ в теле микроба и питательном растворе. Таким образом вода и растворенные в ней питательные вещества поступают в микробную клетку. В результате биосинтеза в ней накапливается пластический материал коллоидной структуры (белки, углеводы и др. вещества), обусловливающий рост и размножение микроорганизма.

Проникновение питательных веществ в клетку может осуществляться с помощью диффузии и стереохимического специфического переноса питательных веществ. Каждый из этих процессов может протекать как активно, так и пассивно. При пассивной диффузии питательные вещества проникают с током жидкости в клетку и только тогда, когда проникаемое вещество способно растворяться в клеточной стенке бактериальной клетки. При активной диффузии наблюдается проникновение питательных веществ в бактериальную клетку нерастворенными в клеточной стенке.При стереохимическом переносе питательных веществ (из внешней среды в клетку) роль переносчика выполняет пермеаза -- белковый компонент. В этот период питательные вещества среды активно транспортируются в клетку, осуществляя конструктивный и энергетический обмены.

По типу углеродного питания микроорганизмы принято делить на аутотрофы и гетеротрофы. Аутотрофы (прототрофы) - микроорганизмы, способные воспринимать углерод из углекислоты воздуха. К ним относятся нитрифицирующие бактерии, железобактерии, серобактерии. Аутотрофы способны использовать воспринятую углекислоту для синтеза сложных органических соединений. Таким образом, аутотрофы обладают способностью синтезировать сложные органические соединения из неорганических. Поскольку такие микробы не нуждаются в готовых органических соединениях, среди них нет болезнетворных. Однако среди аутотрофов встречаются микроорганизмы, обладающие способностью усваивать углерод из углекислоты воздуха и из органических соединений. Такие микроорганизмы, имеющие смешанный тип питания определены как миксотрофы.Гетеротрофы в противоположность аутотрофам используют углерод из любых готовых органических соединений (чаще всего это углерод спиртов, сахаров, органических кислот, многоатомных спиртов). К гетеротрофам принадлежат возбудители различного рода брожений, гнилостные микробы и микроорганизмы - возбудители различных заболеваний. Однако деление микроорганизмов на аутотрофы и гетеротрофы достаточно условно, так как при изменении условий среды обмен веществ у микроорганизмов может меняться.Гетеротрофы включают в себя две подгруппы: метатрофы (сапрофиты) - живут за счет использования мертвых субстратов (гнилостные микроорганизмы) и паратрофы - паразитические микроорганизмы, живущие на поверхности или внутри организма хозяина и питающиеся за его счет.

II. По способу усвоения азотистых веществ микроорганизмы подразделяют на четыре группы:

·Протеолитические, способные расщеплять нативные белки, пептиды, аминокислоты.

·Дезаминирующие, способные отщеплять аминогруппы только у свободных аминокислот.

·Нитритно-нитратные, усваивающие окисленные формы азота.

·Азотфиксирующие, обладающие свойством усваивать атмосферный азот.



21. Питательные среды, их классификация. Требования, предъявляемые к питательным средам. Рост и размножение бактерий. Фазы роста на жидких питательных средах

классификации питательных сред по консистенции питательные среды разделяют на плотные (твёрдые), полужидкие и жидкие. При классификации питательных сред по составу выделяют белковые, безбелковые и минеральные среды. При классификации питательных сред по происхождению среды разделяют на искусственные и естественные (природные).

Искусственные среды разделяют на животные [например, мясопептонный агар (МПА) или мясопептонный бульон (МПБ)] и растительные (например, настои сена и соломы, отвары злаков, дрожжей или фруктов, пивное сусло и др.).

Естественные питательные среды могут содержать компоненты животного (например, кровь, сыворотка, жёлчь) или растительного (например, кусочки овощей и фруктов) происхождения.По назначению выделяют консервирующие среды (для первичного посева и транспортировки), среды обогащения (для накопления определённой группы бактерий), среды для культивирования {универсальные простые, сложные специальные и для токсинообразования), среды для выделения и накопления (консервирующие, обогащения и элективные) и среды для идентификации (дифференциальные и элективно-дифференциальные).

Требования к питательным средам:

Среды должны быть питательными, т.е. содержать все необходимые для жизнедеятельности вещества: Среды должны быть изотоничными, т.е. осмотическое давление в среде должно быть таким же как и внутри клетки, для чего в среду добавляют 0,5 %

Среды должны быть стерильными для обеспечения возможности выделения чистой культуры

Среды должны содержать достаточное количество доступной воды т.к. бактерии питаются по законам осмоса и диффузии.

Среды должны обладать определенным ОВП, т.е. соотношением вещевст, отдающих и принимающих е

Среды должны быть прозрачными - удобнее следить за ростом культур

Среды должны быть по возможности унифицированными по содержанию основных компонентов: содержание аминного азота, общего азота, содержание хлоридов, пептона.

Бактерии размножаются путем бинарного деления пополам, реже путем почкования. Актиномицеты, как и грибы, могут размножаться спорами. Актиномицеты, являясь ветвящимися бактериями, размножаются путем фрагментации нитевидных клеток. Грамположительные бактерии делятся путем врастания синтези­рующихся перегородок деления внутрь клетки, а грамотрицательные -- путем перетяжки, в результате образования гантелевид-ных фигур, из которых образуются две одинаковые клетки.

Размножение бактерий в жидкой питательной среде. Бактерии, засеянные в определенный, не изменяющийся объем питательной среды, размножаясь, потребляют питательные элементы, что приводит в дальнейшем к истощению питательной среды и прекращению роста бактерий.

При выращивании бактерий на жидкой питательной среде наблюдается придонный, диффузный или поверхностный (в виде пленки) рост культуры. Рост периодической культуры бактерий, выращиваемых на жидкой питательной среде, подразделяют на несколько фаз, или периодов:1. лаг-фаза;2. фаза логарифмического роста; 3. фаза стационарного роста, или максимальной концентрациибактерий; 4. фаза гибели бактерий.

Лаг-фаза -- период между посевом бактерий и началом размножения. Фаза логарифмического (экспоненциального) роста является периодом интенсивного деления бактерий. Затем наступает фаза стационарного роста, при которой количество жизнеспособных клеток остается без изменений, составляя максимальный уровень Завершает процесс роста бактерий фаза гибели, характеризующаяся отмиранием бактерий в условиях истощения источников питательной среды и накопления в ней продуктов метаболизма бактерий. Размножение бактерий на плотной питательной среде. Бактерии, растущие на плотных питательных средах, образуют изолированные колонии округлой формы с ровными или неровными краями (S- и R-формы), различной консистенции и цвета, зависящего от пигмента бактерий.

22. Принципы и методы выделения чистых культур микроорганизмов. Культивирование бактерий

Принципы и методы выделения чистых культур бактерий.

Чистой культурой называется популяция бактерий одного вида или одной разновидности, выращенная на питательной среде. Многие виды бактерий подразделяют по одному признаку на биологические варианты -- биовары. Биовары, различающиеся по биохимическим свойствам, называют хемоварами, по антигенным свойствам -- сероварами, по чувствительности к фагу -- фаговарами. Культуры микроорганизмов одного и того же вида, или биовара, выделенные из различных источников или в разное время из одного и того же источника, называют штаммами, которые обычно обозначаются номерами или какими-либо символами. Чистые культуры бактерий в диагностических бактериологических лабораториях получают из изолированных колоний, пересевая их петлей в пробирки с твердыми или, реже, жидкими питательными средами.

Колония представляет собой видимое изолированное скопление особей одного вида микроорганизмов, образующееся в результате размножения одной бактериальной клетки на плотной питательной среде (на поверхности или в глубине ее).

Чистую культуру бактерий получают для проведения диагностических исследований -- идентификации, которая достигается путем определения морфологических, культуральных, биохимических и других признаков микроорганизма.

форму колоний - округлая, амёбовидная, неправильная, ризоидная и т.д.;

поверхность колонии - гладкая, шероховатая, бороздчатая, складчатая, морщинистая, радиально исчерченная, с концентрическими кругами;

профиль колонии - плоский, выпуклый, кратерообразный, конусовидный, выпуклый в центре с валиком по краю, вдавленный в центре, с валиком по краю и др.;

блеск и прозрачность - блестящая, матовая, тусклая, мучнистая, прозрачная;

цвет колонии - бесцветная (грязно-белые колонии относят к бесцветным) или пигментированная - белая, жёлтая, золотистая, оранжевая, сиреневая, красная, чёрная. Особо отмечают выделение пигмента в субстрат;

край колонии - ровный, волнистый, зубчатый, бахромчатый, корневидный и др.;

структуру колонии - однородная, мелко- и крупнозернистая, струйчатая (край и структуру колонии определяют с помощью лупы или при малом увеличении микроскопа);

консистенцию колонии - её определяют, прикасаясь к колонии петлей.

Методы выделения чистых культур бактерий.

Универсальным инструментом для производства посевов является бактериальная петля. Кроме нее, для посева уколом применяют специальную бактериальную иглу, а для посевов на чашках Петри -- металлические или стеклянные шпатели. Для посевов жидких материалов наряду с петлей используют пастеровские и градуированные пипетки. При пересеве бактериальной культуры берут пробирку в левую руку, а правой, обхватив ватную пробку IV и V пальцами, вынимают ее, пронося над пламенем горелки. Удерживая другими пальцами той же руки петлю, набирают ею посевной материал, после чего закрывают пробирку пробкой. Затем в пробирку со скошенным агаром вносят петлю с посевным материалом, опуская ее до конденсата в нижней части среды, и зигзагообразным движением распределяют мате риал по скошенной поверхности агара. Вынув петлю, обжигают край пробирки и закрывают ее пробкой. Петлю стерилизуют в пламени горелки и ставят в штатив. Пробирки с посевами надписывают, указывая дату посева и характер посевного материала (номер исследования или название культуры).

Посевы «газоном» производят шпателем на питательный агар в чашке Петри. Для этого, приоткрыв левой рукой крышку, петлей или пипеткой наносят посевной материал на поверхность питательного агара. Затем проводят шпатель через пламя горелки, остужают его о внутреннюю сторону крышки и растирают материал по всей поверхности среды. После инкубации посева появляется равномерный сплошной рост бактерий.

Способы культивирования микроорганизмов

Стационарный способ. При культивировании этим способом питательные среды сохраняются постоянными, никаких манипуляций с ними не производят. Преобладают анаэробные энергетические процессы. Выход биомассы незначителен.

Глубинный способ с аэрацией. Глубинное культивирование проводят в реакторах в герметичных котлах с жидкой питательной средой, оборудованных автоматическими приспособлениями для контроля рН, О2, температуры, поступления стерильного воздуха и т.д. (цв. вклейка, рис. VII).

Проточный способ культивирования позволяет клеткам длительное время находиться в определенной фазе роста (экспоненциальной) при постоянной концентрации питательных веществ и в одних и тех же условиях, обеспечивающих непрерывный рост культуры. Метод основан на том, что в культивируемую суспензию непрерывно добавляют свежую питательную среду и одновременно удаляют соответствующее количество бактерий.



23.Действие физических и химических факторов на микроорганизмы, Использование в практике. Стерилизация, способы, аппаратура. Дезинфекция. Дезинфектанты

Влияние физических факторов.

Влияние температуры. Различные группы микроорганизмов развиваются при определенных диапазонах температур. Бактерии, растущие при низкой температуре, называют психрофилами, при средней (около 37 °С) -- мезофилами, при высокой -- термофилами.

К психрофильным микроорганизмам относится большая группа сапрофитов -- обитателей почвы, морей, пресных водоемов и сточных вод (железобактерии, псевдомонады, светящиеся бактерии, бациллы). Мезофилы включают основную группу патогенных и условно-патогенных бактерий. Они растут в диапазоне температур 10-- 47 °С; оптимум роста для большинства из них 37 °С.

При более высоких температурах (от 40 до 90 °С) развиваются термофильные бактерии. Термофилы обитают в горячих источниках, участвуют в процессах самонагревания навоза, зерна, сена.

Высушивание. Обезвоживание вызывает нарушение функций большинства микроорганизмов. Наиболее чувствительны к высушиванию патогенные микроорганизмы (возбудители гонореи, менингита, холеры, брюшного тифа, дизентерии и др.). Более устойчивыми являются микроорганизмы, защищенные слизью мокроты.

Высушивание под вакуумом из замороженного состояния -- лиофилизацию -- используют для продления жизнеспособности, консервирования микроорганизмов. Лиофилизированные культуры микроорганизмов и иммунобиологические препараты дли­тельно (в течение нескольких лет) сохраняются, не изменяя своих первоначальных свойств.

Действие излучения. Неионизирующее излучение -- ультрафиолетовые и инфракрасные лучи солнечного света, а также ионизирующее излучение -- гамма-излучение радиоактивных веществ и электроны высоких энергий губительно действуют на микроорганизмы через короткий промежуток времени.

Действие химических веществ. Химические вещества могут оказывать различное действие на микроорганизмы: служить источниками питания; не оказывать какого-либо влияния; стимулировать или подавлять рост.

Стерилизация (обеспложивания, «sterilis»--бесплодный)- полное уничтожение объекта от всех микроорганизмов, находящихся как в вегетативных, так и споровых формах. Для стерилизации применяют в основном физические методы: стерилизация в сушильно-стерилизационном шкафу, стерилизация текучим паром, тиндализация, автоклавирование, прокаливание, воздействие ионизирующих излучений, кипячение. Методы стерилизации

Физические методы стерилизации.

1. Прокаливание на огне - фламбирование ( спиртовка) -- применяется для стерилизации бактериологических петель, препаровальных игл , предметных стекол, пинцетов.

2. Кипячение--применяется редко. Кипячением в воде в течение 10-40 минут можно стерилизовать многоразовые шприцы, иглы.

3. Стерилизация сухим жаром производится в печах Пастера.

4. Стерилизация паром проводится при более низкой температуре чем стерилизация сухим жаром, и производится при температуре в 100--120°. Различают: 1)Стерилизация паром под давлением -- основан на том, что образующийся пар не выходит наружу, а скопливается в замкнутом пространстве и повышает давление. 2)Стерилизация паром под давлением производится в автоклавах. На сегодняшний день это самый распостраненный способ стерилизации в бактериологической практике

Автоклав представляет, собой металлическую цилиндрическую емкость с толстыми двойными стенками и с герметически закрывающейся массивной крышкой. Автоклав оборудован манометром и термометром для контроля давления и температуры . Под дном автоклава находятся нагревательные элементы . стерилизуемые предметы помещают внутрь емкости и герметично закрывают крышку, начинается повышение давления и температуры.

Дробная стерилизация. Дробной стерилизации подвергаются материалы, не переносящие температуры выше 100° (желатина, молоко, питательные среды с углеводами). При температуре в 100°погибают вегетативные формы бактерий,затем дают оставшимся спорам прорасти в вегетативные формы и через сутки снова стерилизуют материал при 100°.

Тиндализация представляет собой дробную стерилизацию при низкой температуре, предложенную Тиндалем для объектов, не переносящих температуры в 100°. Их подвергают нагреванию в течение 5--6 дней подряд при более низкой температуре ( 56--60°) по 1 часу ежедневно Тиндализация производится или на водяной бане, или в специальных приборах с терморегуляторами.

Пастеризация. Метод предложен Пастером для частичной стерилизации жидкостей, теряющих свои качества под действием высокой температуры),используется при температурной обработке продуктов питания(соки, молоко, вино ). Способ основан на том, что при нагревании жидкости до 50--60° в течение 15--30 минут или до 70--80° в течение 5--10 минут погибает большинство бесспоровых микробов , а споры остаются жизнеспособными. Поэтому необходимым условием является упаковка и охлаждение пастеризованного продукта .

В бактериологической практике пастеризация при 90° применяется для разделения спороых и бесспоровых видов бактерий.

Обработка материалов рентгеновскими, ультрафиолетовыми, г-лучами.

Радиоционный метод стерилизации.Используется для стерилизации изделий медицинского назначения одноразового применения (одноразовые чашки Петри)

Стерилизация ультрофиолетовым облучением используется для стерилизации воздуха помещений медицинского назначения, сложных изделий медицинского назначения (исскуственный клапан седца и т.д.)

Механические методы стерилизации.

1.Стерилизация фильтрованием.

Применяется в тех случаях, когда материал не может быть подвергнут нагреванию ( сыворотки, белковые лекарственные вещества и т. д.).

Для этой цели прменяются фильтры тонкой очистки из мелкопористых веществ. Они готовятся в виде цилиндрических свечей (фильтр Шамберлана, Берке-фельда) или асбестовых пластинок (фильтр 3eйтца).

Фильтрование производится под повышенным давлением, вследствие чего жидкость нагнетается через поры фильтра в приемник, или же создается разрежение в приемнике и тогда жидкость всасывается в него через фильтр.Поэтому к фильтрующему прибору присоединяется или нагнетающий, или разрежающий насос.

Наиболее простым способом является фильтрование с помощью водоструйного насоса: в приемнике создается отрицательное давление и жидкость всасывается через фильтр. Стерильность профильтрованной жидкости проверяется путем ее посева на питательную среду - посев остается стерильным.

Химческие метод стерилизации.

Методы основаны на обработке оборудования химическими веществами, обладающими бактерицидными свойствами. Применяются при стерилизации приборов и материалов, чувствительным к высоким температурам.

Дезинфекция - мероприятия, направленные на уничтожение или снижение численности микроорганизмов. Для дезинфекции применяют физические и химические методы.

1.Механические методы - влажная уборка.

Физические методы:кипячение, сжигание трупов.

2.Химические методы: методы с использованием веществ, обладающих антисептическими свойствами (дезинфектантов)

Классификация дезинфектантов

1. галогенсодержащие дезинфектанты (имеют в своем составе галогены) -- препараты йода (спиртовой раствор йода, раствор Люголя, йодоформ, йодинол, йодопирин), хлора (хлорамины, хлориты);

2. перекисные соединения - перекись водорода, пергидроль (30% водный раствор перекиси водорода) дезоксон-1 и др. 3. кислоты и их соли - борная, салициловая, тетраборат натрия, калия перманганат, щелочи - аммиак и его соли, бура;

4. спирты - 70°--80° этанол и др.;

5. альдегиды - формальдегид, гексаметилен-тетрамин, бетапропиолактон;

6. детергенты - декамин, хлоргексидин, этоний и др.

поверхностно-активные вещества, относящиеся к четвертичным аммониевым соединениям и амфолитам (ниртан, амфолан и др.)

6. производные 8-оксихинолина - хинозол, интестопан, нитроксолин, 4-хинолона - оксолиновая кислота, хиноксалина - хиноксилин, диоксидин;

7. производные нитрофурана - фурацилин, фурагин, фуразолидон;

8. производные фенола - трикрезол, фенилрезорцин, фенилсалицилат,

9. дегти - деготь березовый, ихтиол и др.;

10. красители - бриллиантовый зеленый, метиленовый синий, этакридина лактат;

11. соединения тяжелых металлов - дихлорид ртути, нитрат серебра, колларгол, протаргол, сульфат цинка.

12. газовая смесь из оксида этилена с метилбромидом.



24.Влияние биологических факторов на микроорганизмы. Использование в практике

К биологическим средствам могут быть отнесены препараты, содержащие живых особей - бактериофагов и бактерий, обладающих выраженной конкурентной активностью по отношению к патогенным и условно-патогенным для человека и животных видам микробов. Они вводятся в организм в жизнеспособном состоянии. Фаги и антагонисты оказывают прямое повреждающее действие на патогенных и условно-патогенных микробов; изготовленные из них лекарственные препараты предназначены для местного применения, для них характерна специфичность действия на микроорганизмы и безвредность для пациента; целью их внесения в организм человека и животных является лечение или профилактика инфекционных заболеваний. По механизму действия они близки к химическим антисептикам.

Необходимо также помнить и о молочно-кислых бактериях, которые вызывают процесс молочно-кислого брожения. Некоторые молочно-кислые бактерии способны синтезировать антибиотики и с их помощью подавлять развитие болезнетворных микробов.

Препараты, содержащие бактерии (эубиотики или пробиотики): колибактерин, лактобактерин, бифидумбактерин, бификол, микрококкобактерин, линекс, бактисубтил и другие.

Препараты, содержащие бактериофаги: бактериофаг брюшнотифозный, бактериофаг дизентерийный, бактериофаг сальмонеллезный, бактериофаг коли-протейный, бактериофаг стафилококковый, бактериофаг стрептококковый, бактериофаг пиоцианеус, бактериофаг синегнойный, бактериофаг клебсиеллезный, пиофаг комбинированный и другие.

Существует три основных способа получения антибиотиков:

1. биологический синтез (так получают природные антибиотики -- натуральные продукты ферментации, когда в оптимальных условиях культивируют микробы-продуценты, которые выделяют антибиотики в процессе своей жизнедеятельности);

2. биосинтез с последующими химическими модификациями (так создают полусинтетические антибиотики). Сначала путем биосинтеза получают природный антибиотик, а затем его первоначальную молекулу видоизменяют путем химических модификаций, например присоединяют определенные радикалы, в результате чего улучшаются противомикробные и фармакологические характеристики препарата;

3. химический синтез (так получают синтетические аналоги природных антибиотиков, например хлорамфеникол/левомицетин). Это вещества, которые имеют такую же структуру, как и природный антибиотик, но их молекулы синтезированы химически.

25.Понятие о химиотерапии и химиотерапевтических препаратах. Классификация химиопрепаратов

1. Требования, предъявляемые к химиотерапевтическим средствам Одним из крупнейших достижений медицины второй половины XX века является широкое использование химиотерапии. Химиотерапия - это лечение инфекционных и опухолевых заболеваний химическими препаратами, не являющимися продуктами реакции организма и возбудителя. Препараты, используемые для химиотерапии, называются химиотерапевтическими. К ним предъявляют ряд требований.

Химиотерапевтический препарат должен обладать:

этиотропностью, т.е. подавлять жизнедеятельность и развитие возбудителя болезни или опухолевых клеток, или уничтожать его в тканях и средах организма. Вся химиотерапия в целом всегда является этиотропной, т.е. направленной на причину заболевания - микроорганизм-возбудитель заболевания или опухолевую клетку:

следующее требование - химиопрепараты должны достаточно хорошо растворяться в воде, так как только в таком виде они могут быть доставлены во внутреннюю среду организма. Для того чтобы соответствовать именно этому условию, для химиотерапии довольно часто используются соответствующие производные основного действующего вещества. Малорастворимые или нерастворимые вещества пригодны только для местного применения;

химиотерапевтические препараты, с одной стороны, должны быть достаточно стабильны во внутренней среде организма, но, с другой стороны, они не должны иметь кумулятивного эффекта (способности накапливаться в макроорганизме).

вещества, используемые для химиотерапии, должны быть безвредны.

Несмотря на то, что любой химиотерапевтический препарат обладает тем или иным побочным действием на организм человека, это действие должно быть по возможности минимальным, а тератогенный (способность вызывать образование отклонений в развитии) и мутагенный (способность вызывать мутации) эффекты по возможности отсутствовать. Это требование к качеству химиопрепаратов (безвредность) оценивается химиотерапевтическим индексом, который представляет собой отношение минимальной терапевтической дозы препарата к максимально переносимой. Очевидно, что, чем меньше химиотерапевтический индекс, тем лучше препарат; если же индекс больше или равен 1, то такое вещество не может быть использовано как средство химиотерапии.

Нередко в клинической практике понятия "химиотерапия" и "антибиотикотерапия" используются как синонимы. Однако это неверно, так как антибиотики - только один из классов химиотерапевтических препаратов, и, следовательно, антибиотикотерапия - только один из видов химиотерапии. В настоящее время известно несколько сотен химиотерапевтических препаратов, и постоянно ведется поиск все новых и новых веществ.

2. Классификация химиотерапевтических средств В основу классификации химиотерапевтических препаратов положены разные принципы.

По направленности действия все химиопрепараты делятся на:

противопротозойные - метронидазол (флагил, трихопол), орнидазол (тиберал), пентамидин (пентам), пириметамин;

противовирусные - азидомитидин, фоскарнет (фоскавир), ганцикловир (цитовен), амантадин, римантадин (ремантадин), ацикловир (зовиракс), рибавирин (виразол, виразид) и другие;

противогрибковые - полиены - амфотерицин В (фунгилин), нистатин (микостатин), леворин, натамицин (пимофуцин); азолы - клотримазол (кандид), бифоназол (микоспор), миконазол (монистат), интраконазол (оругал, споранокс), флуконазол (дифлюкан), кетоконазол (низорал, ороназол) и другие - флуцитозин, тербинафин, гризеофульвин и другие;

антибактериальные.

Среди антибактериальных препаратов в клинической практике всегда отдельно выделяются противотуберкулезные (антимикобактериальные) и противосифилитические средства, что связано с особенностями возбудителей этих заболеваний.

По способности накапливаться в тех или иных тканях, т. е. по фармакокинетике, клиницисты и фармакологи среди химиотерапевтических веществ выделяют цитостатики (накапливаются в опухолевых клетках и подавляют их рост), уросептики (накапливаются в моче и подавляют развитие возбудителей инфекций почек и мочевыводящих путей) и другие.

26.Антибиотики: классификация по источнику получения, механизму и спектру действия

Антибиотики -- это химиотерапевтические препараты из химических соединений биологического происхождения (природные), а также их полусинтетические производные и синтетические аналоги, которые в низких концентрациях оказывают избирательное повреждающее или губительное действие на микроорганизмы и опухоли.

Принципы классификации антибиотиков.

а) Классификация по происхождению.

Основными продуцентами природных антибиотиков являются микроорганизмы, которые синтезируют антибиотики в качестве средства выживания в борьбе за существование. Животные и растительные клетки также могут вырабатывать некоторые вещества с селективным антимикробным действием . Таким образом, источниками получения антибиотиков являются:

1. Актиномицеты (особенно стрептомицеты) -- ветвящиеся бактерии. Они синтезируют 80 % природных антибиотиков ( стрептомицин, гентамицин).

2. Плесневые грибы -- синтезируют природные бета-лактамы - пенициллин, цефалоспорин (грибы рода Cephalosporium и Penicillium) и фузидиевую кислоту.

3. Типичные бактерии -- например, эубактерии, бациллы, псевдомонады -- (бацитрацин, полимиксины и др.)

4. Животные - экторицид

5. Растения - фитонциды

б) Классификация по способам получения антибиотиков

Существует три основных способа получения антибиотиков:

1. биологический синтез (так получают природные антибиотики -- натуральные продукты ферментации, когда в оптимальных условиях культивируют микробы-продуценты, которые выделяют антибиотики в процессе своей жизнедеятельности);

2. биосинтез с последующими химическими модификациями (так создают полусинтетические антибиотики). Сначала путем биосинтеза получают природный антибиотик, а затем его первоначальную молекулу видоизменяют путем химических модификаций, например присоединяют определенные радикалы, в результате чего улучшаются противомикробные и фармакологические характеристики препарата;

3. химический синтез (так получают синтетические аналоги природных антибиотиков, например хлорамфеникол/левомицетин). Это вещества, которые имеют такую же структуру, как и природный антибиотик, но их молекулы синтезированы химически.

в) Классификация антибиотиков по химической структуре

По химической структуре антибиотики сгруппированы в семейства (классы):1.бета-лактамы (пенициллины, цефалоспорины, карбапенемы, монобактамы)

2.гликопептиды (ванкомицин, тейкопланин)

3.аминогликозиды (стрептомицин, гентамицин, амикацин)

4.тетрациклины (тетрациклин, доксициклин)

5.макролиды (и азалиды) ( эритромицин, азитромицин)

6.линкозамиды (линкомицин)

7. рифамицины ( рифампицин)

8.полипептиды (полимиксин, бацитрацин)

9.полиены ( нистатин, амфотерицин)

10. дополнительный класс - левомицетин (хлорамфеникол)

11.разные антибиотики (фузидиевая кислота, фузафунжин и др.)

27. Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам. Механизмы формирования и пути преодоления лекарственной устойчивости возбудителей инфекционных болезней. Принципы рациональной антибиотикотерапни. Осложнения антибиотикотерапии

Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам.

* Метод диффузии в агар. На агаризованную питательную среду засевают исследуемый микроб, а затем вносят антибиотики. Обычно препараты вносят или в специальные лунки в агаре, или на поверхности посева раскладывают диски с антибиотиками («метод дисков»). Учет результатов проводят через сутки по наличию или отсутствию роста микробов вокруг лунок (дисков). Метод дисков -- качественныйи позволяет оценить, чувствителен или устойчив микроб к препарату.

* Методы определения минимальных ингибирующих и бактерицидных концентраций, т. е. минимального уровня антибиотика, который позволяет invitroпредотвратить видимый рост микробов в питательной среде или полностью ее стерилизует. Это количественные методы, которые позволяют рассчитать дозу препарата, так как концентрация антибиотика в крови должна быть значительно выше минимальной ингибирующей концентрации для возбудителя инфекции.

Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методом дисков. Исследуемую бактериальную культуру засевают газоном на питательный агар или среду АГВ в чашке Петри.

На засеянную поверхность пинцетом помещают на одинаковом расстоянии друг от друга бумажные диски, содержащие определенные дозы разных антибиотиков. Посевы инкубируют при 37 °С до следующего дня. По диаметру зон задержки роста исследуемой культуры бактерий судят о ее чувствительности к антибиотикам.

Механизмы лекарственной устойчивости возбудителей инфекционных болезней. Пути ее преодоления.

Антибиотикорезистентность -- это устойчивость микробов к антимикробным химиопрепаратам. Бактерии следует считать резистентными, если они не обезвреживаются такими концентрациями препарата, которые реально создаются в макроорганизме. Резистентность может быть природной и приобретенной.

Природная устойчивость. Некоторые виды микробов природно устойчивы к определенным семействам антибиотиков или в результате отсутствия соответствующей мишени или в результате бактериальной непроницаемости для данного препарата

Приобретенная устойчивость. Приобретение резистентности -- это биологическая закономерность, связанная с адаптацией микроорганизмов к условиям внешней среды. К химиопрепаратам адаптируются не только бактерии, но и остальные микробы -- от эукариотических форм (простейшие, грибы) до вирусов. Проблема формирования и распространения лекарственной резистентности микробов особенно значима для внутрибольничных инфекций, вызываемых так называемыми «госпитальными штаммами», у которых, как правило, наблюдается множественная устойчивость к антибиотикам (так называемая полирезистентность).

Для борьбы с лекарственной устойчивостью

* в первую очередь -- соблюдение принципов рациональной химиотерапии;

* создание новых химиотерапевтических средств, отличающихся механизмом антимикробного действия

* постоянная ротация (замена) используемых в данном лечебном учреждении или на определенной территории химиопрепаратов (антибиотиков);

* комбинированное применение бета-лактамных антибиотиков совместно с ингибиторами бета-лактамаз (клавулановая кислота, сульбактам, тазобактам).

* химиотерапия должна назначаться строго по показаниям

* при этиологически расшифрованных заболеваниях выбор препарата должен определяться с учетом чувствительности возбудителя (антибиотикограмма), выделенного от данного конкретного больного в результате бактериологического исследования;

* лечение должно проводиться строго по схеме, рекомендованной для выбранного химиопрепарата

* длительность приема химиопрепаратов должна составлять, как минимум, 4--5 дней в целях профилактики формирования устойчивости возбудителя к данному препарату, а также формирования бактерионосительства

Осложнения

Токсическое действие препаратов - развитие этого осложнения зависит от свойств самого препарата, его дозы, способа введения, состояния больного и проявляется только при длительном и систематическом применении антимикробных химиотерапевтических препаратов, когда создаются условия для их накопления в организме.

Дисбиоз (дисбактериоз). Антимикробные химиопрепараты, особенно широкого спектра, могут воздействовать не только на возбудителей инфекций, но и на чувствительные микроорганизмы нормальной микрофлоры. В результате формируется дисбиоз, поэтому нарушаются функции ЖКТ, Предупреждение последствий такого рода осложнений состоит в назначении, по возможности, препаратов узкого спектра действия, сочетании лечения основного заболевания с противогрибковой терапией витаминотерапей, применением эубиотиков и т. п.

Отрицательное воздействие на иммунную систему - аллергические реакции. Причинами развития гиперчувствительности может быть сам препарат, продукты его распада, а также комплекс препарата с сывороточными белками. Предупреждение осложнений состоит в тщательном сборе аллергоанамнеза и назначении препаратов в соответствии с индивидуальной чувствительностью пациента.



28.Бактериофаги. Получение, титрование, использование. Взаимодействие фага с бактериальной клеткой. Умеренные и вирулентные бактериофаги. Применение в медицине Внутривидовое типирование бактерий. Методы. Использование в практике