Бактериальный кератит. Клинико-иммунологические особенности течения, прогноза, лечения разных форм заболевания

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Бактериальный кератит. Клинико-иммунологические особенности течения, прогноза, лечения разных форм заболевания

14.00.36 - аллергология и иммунология

14.00.08 - глазные болезни

Шаимова Венера Айратовна

Челябинск, 2007

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

бактериальный кератит терапия иммунотропный

Актуальность проблемы

Бактериальный кератит (БК) занимает 2-е место по частоте после вирусных поражений роговицы, составляя 13 - 47% (Савельев В.Н., Савельев В.В., 2002). Заболевание является тяжелой патологией, приводящей к значительному понижению зрения, слепоте, анатомической гибели глаза в 8-9% случаев, заканчиваясь энуклеацией в 23,7%, и остается причиной инвалидизации в 25% случаев всей инвалидности по зрению (Малов В.М., 2002; Майчук Ю.Ф., 2003; Деев Л.А., 2006).

Проблема бактериального кератита изучалась многими исследователями на разных этапах развития офтальмологии: до применения антибактериальной терапии, в период активного применения антибиотиков. В литературе представлены обширные данные по этиологии, клинике бактериального кератита, предложены различные методы консервативного и хирургического лечения.

Однако рост и урбанизация населения, его постоянная маятникообразная миграция, загрязнение окружающей среды, а также нередко бесконтрольное применение антибиотиков, иммунодепрессантов, являются причиной снижения защитных механизмов системного и местного характера, смены микробных возбудителей, повышения роли оппортунистической, условно-патогенной микрофлоры в развитии воспалительных заболеваний глаз. В результате в настоящее время, несмотря на применение мощного арсенала лекарственных средств, бактериальный кератит относится к тяжелой патологии органа зрения (Полунин Г.С., 2004; Fong C.F., 2004). Все это объясняет необходимость изучения бактериального кератита и его этиологии, патогенеза в современных условиях.

В литературе отсутствует единая клиническая классификация бактериального кератита. Недостаточно исследованы иммунологические аспекты патогенеза, особенности иммунного ответа на системном и местном уровне, цитокиновый профиль слезной жидкости при клинически разных формах и осложненном течении бактериального кератита, взаимосвязь метаболических нарушений, состояния про- и антиоксидантной систем в патогенезе течения клинически разных форм заболеваний и их осложнений. Получение новой информации о состоянии системного и секреторного иммунитета при разных клинических формах заболевания определяет перспективы оптимизации лечения бактериального кератита на основе внедрения ранее не применявшихся иммунотропных методов лечения. Указанные предпосылки определили цель и направления настоящего исследования.

Цель исследования: оптимизация диагностики, прогноза течения, лечения бактериального кератита на основе анализа этиологии, иммунологических аспектов патогенеза, выделения клинически разных форм и фаз течения заболевания, внедрения этапной дифференцированной терапии с использованием иммунотропных препаратов.

Задачи работы:

Обосновать клиническую классификацию бактериального кератита с выделением первичной и вторичной форм и трех фаз течения: I - воспалительной, II - пролиферативной, III - реорганизации рубца и эпителизации роговицы.

Исследовать видовой состав и микробную обсемененность конъюнктивальной полости у пациентов с разными формами бактериального кератита.

Определить характер нарушений клеточного и гуморального звеньев иммунной системы при разных клинических формах бактериального кератита, при неосложненном и осложненном течении.

Выявить характер нарушений иммунных показателей слезной жидкости при разных клинических формах бактериального кератита, при неосложненном и осложненном течении.

Оценить степень гипоксии и уровень продуктов перекисного окисления липидов, антиоксидантной системы слезной жидкости при первичной и вторичной форме бактериального кератита и определить взаимосвязь метаболических изменений с иммунными нарушениями.

Определить информативность иммунологических показателей на системном и мукозальном уровнях для прогноза осложненного течения бактериального кератита.

Разработать этапное, патогенетически обоснованное лечение клинически разных форм бактериального кератита с использованием методов иммунокоррекции.

Научная новизна

На основе анализа микробных этиологических агентов, морфологии, клинического течения, обосновано выделение двух клинических форм бактериального кератита с тремя фазами течения. Первичная форма бактериального кератита развивается при инфицировании здоровой роговицы экзогенной микрофлорой после микротравмы. Вторичная форма бактериального кератита возникает при инфицировании дистрофически измененной роговицы эндогенной микрофлорой из очагов хронической инфекции.

Впервые установлено, что иммунный ответ на внедрение патогенной микрофлоры при первичной форме бактериального кератита, проявляется на местном уровне в условиях формирования острой тканевой гипоксии: значительным повышением количества нейтрофилов в очаге воспаления, ростом содержания в слезной жидкости sIgA, IgA, IgМ, провоспалительных цитокинов (IL-1б, IL-1в, TNF-б, IL-8) и реактантов острой фазы воспаления (орозомукоид, б₁-ИП, С3, С4). На системном уровне выявлена активация фагоцитов, усиление их поглотительной и бактерицидной функции, рост количества CD22-клеток, уровня IgМ, IgA, реактантов острой фазы воспаления, флогогенных цитокинов (IL-1б, IL-1в, IL-8).

Установлено, что в основе развития вторичной формы БК, развивающейся на фоне предшествующих заболеваний глаза и хронической тканевой гипоксии, лежит низкий уровень ответа иммунной системы на внедрение условно-патогенной микрофлоры. Оригинальными являются данные о снижении содержания в слезной жидкости sIgA, IgA, IgМ, провоспалительных цитокинов (IL-1б, IL-1в, TNF-б, IL-8), реактантов острой фазы воспаления, нейтрофилов в области дефекта роговицы. На системном уровне происходит снижение поглотительной и внутриклеточной бактерицидной активности фагоцитов, общей численности лимфоцитов, CD3+, CD4+ клеток, количества лимфоцитов с готовностью и с морфологическими признаками апоптоза.

Впервые выявлены информативные иммунологические критерии прогноза развития осложнений бактериального кератита, защищенные патентом №224553 Российской Федерации «Способ прогнозирования характера течения бактериального кератита», 2005г.

Разработано этапное, патогенетически обоснованное лечение первичной и вторичной форм бактериального кератита с дифференцированным назначением иммунотропной терапии.

Практическая значимость работы состоит в оптимизации диагностики и совершенствовании лечения бактериального кератита на основе выделения первичной и вторичной клинических форм заболевания и трех фаз течения кератита, внедрения этапного дифференцированного лечения.

Обосновано, что определение вида микрофлоры, степени бактериальной обсемененности конъюнктивальной полости, чувствительности микрофлоры к антибиотикам при первом обращении пациента при обеих клинических формах бактериального кератита является эффективным направлением в определении этиотропной терапии на поликлиническом этапе лечения.

Показано, что цитологические исследования мазков-отпечатков из очага воспаления роговицы способствуют уточнению фазы течения первичного и вторичного бактериального кератита для своевременного назначения этапного лечения кератита.

Выявление различий в характере иммунного ответа на местном и системном уровне обосновывает проведение дифференцированной иммунотропной терапии с использованием при первичной форме препаратов противовоспалительно-иммуносупрессивного действия (лекролин, дексаметазон), а при вторичной форме бактериального кератита - иммуностимулирующие (беталейкин) и иммунозамещающие препараты (чигаин).

Ранняя диагностика и своевременно назначенное этапное, патогенетически обоснованное лечение с применением иммунотропных препаратов позволяет ускорить купирование инфекции, эпителизацию дефекта роговицы, улучшить остроту зрения, уменьшить развитие осложнений и снизить показания к хирургическому лечению практически вдвое при обеих формах бактериального кератита.

Положения, выносимые на защиту:

1. Обосновано выделение клинически разных форм бактериального кератита (первичной и вторичной) и трех фаз заболевания (воспалительной, пролиферативной, реорганизация рубца и эпителизации роговицы).

2. Для первичной формы бактериального кератита характерна высокая обсемененность роговицы преимущественно патогенной бактериальной микрофлорой, для вторичной - условно-патогенной бактериальной флорой.

3. Особенности формирования иммунного ответа при первичной и вторичной формах бактериального кератита на системном и мукозальном уровнях зависят не только от характера этиологического микробного агента, но и от предшествующего состояния роговицы.

4. Уровни провоспалительных цитокинов IL-1в и IL-8 в слезной жидкости являются высокоинформативными показателями в прогнозе течения бактериального кератита.

5. Установленные патогенетические особенности клинически разных форм бактериального кератита, характеризующиеся высоким уровнем иммунного ответа при первичной форме и низким уровнем - при вторичной форме заболевания и развивающиеся на фоне тканевой гипоксии разной длительности и выраженности, определяют характер этапного дифференцированного назначения иммунотропных препаратов.

6. Эффективным направлением в лечении вторичного бактериального кератита является применение нового отечественного иммуностимулирующего препарата беталейкина.

Внедрение результатов исследования

Комплекс лечебно-диагностических мероприятий с 2001 г. внедрен в практику глазных отделений Уральского региона: ГКБ №3 (г. Челябинск), глазного центра «Зрение» (г. Челябинск), глазного отделения Областного клинического госпиталя для ветеранов войн (г. Екатеринбург). Данные диссертационного исследования используются при чтении лекций и проведении практических занятий клиническим интернам, ординаторам и врачам-слушателям циклов повышения квалификации на кафедре офтальмологии ГОУ ДПО «Уральская государственная медицинская академия дополнительного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», на кафедре иммунологии и аллергологии ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Апробация работы

Материалы исследования доложены и обсуждены на Международной научно-практической конференции «Цитокины. Воспаление. Иммунитет», Санкт-Петербург, 2002, Х научно-практической конференции Екатеринбургского Центра МНТК «Микрохирургия глаза», 2002, Межрегиональной научно-практической конференции «Воспалительные заболевания органа зрения», Челябинск, 2004, Объединенном иммунологическом форуме г. Екатеринбург, 2004, заседании областного общества офтальмологов Челябинск, 2006.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 46 работ, получены 3 патента на изобретение.

Структура и объем диссертации

Работа состоит из введения, 6 глав, выводов, практических рекомендаций и списка используемой литературы. Объем диссертации - 238 страниц, в том числе 28 таблицы и 22 рисунка. Список используемой литературы включает 295 источников, из них 172 - на русском языке и 169 - на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Исследование проведено в 2000-2006гг. на базе Областного центра травмы и неотложных состояний органа зрения МУЗ ГКБ №3 (г. Челябинск), кафедры офтальмологии ГОУ ДПО «Уральская государственная медицинская академия дополнительного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию». В исследование включено 312 пациентов с бактериальным кератитом (БК). Мужчин - 172, женщин - 134, детей - 6. Возрастной диапазон от 10 до 92 лет, средний возраст - (58 9 лет).

В работе использовались офтальмологические клинико- инструментальные, цитологические, гистологические, бактериологические, иммунологические, биохимические и статистические методы исследования.

Офтальмологическое исследование включало в себя: сбор анамнеза, клиническое, инструментальное исследование. При сборе анамнеза обращали особое внимание на возможные факторы риска, наличие сопутствующих (фоновых) заболеваний. При клиническом обследовании проводились авторефрактометрия, визометрия, биомикроскопия с использованием широкоугольной линзы в 60,0D, прямая и обратная офтальмоскопия, компьютерная периметрия, тонометрия (пальпаторно), а также ультрасонография.

С целью изучения возможных эндогенных источников заболевания тщательно обследовали состояние век, мейбомиевых желез, конъюнктивы, проводили диагностическое промывание слезно-носовых путей, по показаниям - пробу Норна. Для динамического наблюдения за состоянием роговицы и переднего отрезка глаза проводили фотографирование с помощью щелевой лампы с фотонасадкой. Биомикроскопически исследовали состояние роговицы: изучался характер инфильтрата, оценивались локализация, размеры распространения по площади и в глубину, в случае изъязвления - состояние дна язвенного фокуса, края и перифокальный отек.

Ультрасонография проводилась с помощью ультразвукового А-В- скана. Исследование проводилось на офтальмологическом ультразвуковом аппарате Humphrey 850 (Carl Zeiss Croup, Germany) c использованием датчика 10 МГц.

Цитологические исследования мазков-отпечатков с очага воспаления роговицы проводили по методу М.П. Покровской, М.С. Макарова (1942). Микроскопия 168 препаратов проводилась на микроскопе Leiсa DMRXA (Германия) с использованием увеличения 1000 (масляная иммерсия). Клеточный состав выражали в процентах, подсчитывая до 100 клеток для более точного представления о динамике процесса в дефекте роговицы.

Гистологические исследования фрагментов удаленной роговицы после сквозной кератопластики и энуклеированных глазных яблок выполнены по методу И.П. Масловой-Хорошиловой (1987)

Бактериологические исследования микрофлоры конъюнктивальной полости проведены у 1247 здоровых лиц и 312 пациентов с бактериальным кератитом. Использовались универсальные питательные среды (мясо-пептонный бульон (МПБ), мясо-пептонный агар (МПА), специальные (кровяной, сывороточный агар, сывороточный бульон), избирательные (щелочная пептонная вода, щелочной мясо-пептонный агар), дифференциально-диагностические (среда Эндо, Левина, Плоскирева). Для определения тинкториальных и морфологических свойств изолированных колоний применяли окраску мазков по Граму и другие методы. Чистую культуру выделяли на скошенном агаре или других средах. Идентификацию выделенной чистой культуры проводили с помощью исследования морфологических, биохимических, антигенных и других свойств возбудителей.

Иммунологические исследования крови выполнены у 137 пациентов, слезной жидкости - у 129 больных БК. Нами исследованы: популяционный и субпопуляционный анализ лимфоцитов в периферической крови путем идентификации CD-молекул, экспрессированных на мембране клеток, методом непрямой иммунофлюоресценции с моноклональными антителами (МКА) серии ИКО с применением тест-системы производства НИИ «Препарат» г. Н.Новгород;

Для морфологической оценки апоптоза лимфоцитов использовали суправитальный краситель Hoechst 33342 (Boehringer Mannheim) с подсчетом процента клеток с морфологическими признаками апоптоза (Vermes I., 2000).

Уровень РОФ (б1-ингибитор протеаз, орозомукоид), иммунных комплексов, компонентов комплемента С3, С4 содержание иммноглобулинов (IgA, IgM, IgG) определяли с использованием турбодиметрического метода на приборе «Турбокс» фирмы «ORION DIAGNOSTICA» (Финляндия) с помощью тест-систем этой же фирмы. Секреторный иммуноглобулин А (sIgA) определялся с использованием тест-систем Института вакцин и сывороток им. Гамалеи. Определение активности лизоцима в слезной жидкости проводили по стандартной методике (Бухарин О.В., Васильев Н.В., 1974). Определение количества IL-1б, IL-1в, TNF-б, IL-8 в сыворотке крови и слезной жидкости проводилось методом иммуноферметного анализа с использованием тест-систем ООО «Цитокин» (С.-Петербург).

Биохимические исследования слезной жидкости у больных с БК были выполнены у 129 больных в динамике по стандартным методикам, адаптированным к малому объему биологического материала и с соответствующей корреляцией расчетов. Определяли содержание молочной (МК), пировиноградной кислоты - (ПВК), активность лактатдегидрогеназы - (ЛДГ), соотношение содержания молочной кислоты к пировиноградной (МК / ПВК)

Активность процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) оценивали по концентрации диеновых конъюгатов (ДК), кетодиенов с сопряженными триенами (КД с СТ), шиффовых оснований (ШО), малонового диальдегида (МДА) (Каган В.Е.,1986). Состояние антиоксидантной системы оценивали по активности фермента супероксиддисмутазы (Журкин А.Г., 1986) и каталазы (Королюк М.А., Иванова Л.И., Майорова И.Г., 1998).

Статистическая обработка результатов

Результаты проведенных исследований обработаны методами вариационной статистики с вычислением средней арифметической (М), стандартной ошибки среднего арифметического (m). Для проверки достоверности различий средних значений выборок, имеющих распределение, близкое к нормальному, и равенство дисперсий, использовались стандартные методы параметрической статистики для данных (критерии Фишера и Стьюдента). При отклонении от нормального распределения данных, при неравенстве числа наблюдений в сравниваемых группах и малом объеме выборки использовались непараметрические критерии (Колмагорова-Смирнова, Манна-Уитни, Вальда-Вольфовича) для двух независимых выборок. Различия считались достоверными при р<0,05. Статистическая обработка результатов проводилась с использованием прикладного пакета программы Statistica 6.0 (Stat Soft Inc.). Корреляционный анализ проводился по Спирмену. Математическая модель прогноза течения бактериального кератита рассчитана на основе регрессионного анализа.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В результате проведенного клинико-иммунологического, микробиологического, биохимического, морфологического исследования обоснована клиническая классификация бактериального кератита с выделением двух форм (первичной и вторичной), и трех фаз течения кератита (I - воспалительной, II - пролиферативной, III - реорганизации рубца и эпителизации роговицы). Обследовано 90 пациентов с первичной (возникающей в результате микротравмы здоровой роговицы) и 222 - с вторичной (протекающей на фоне дистрофических изменений роговицы) формами бактериального кератита. Изучение анамнеза позволило установить особенности факторов риска возникновения первичной и вторичной форм бактериального кератита, к которым относятся наличие или отсутствие фоновых заболеваний глаз, очагов хронической инфекции, микротравм, количественный и качественный состав микрофлоры конъюнктивальной полости, возраст пациентов. Установленные факторы риска развития первичной и вторичной форм БК представлены в таблице 1.

Таблица 1. Факторы риска возникновения различных форм БК

Факторы риска	Клинические формы БК
	первичная	вторичная
	абс	%	абс	%
Микротравма без инородного тела роговицы	25	27,8%	2	0,9%*
Микротравма с инородным телом роговицы	32	35,6%	1	0,5%*
Непроникающее ранение роговицы	8	8,9%	1	0,5%*
Постконтузионная эрозия	5	5,5%	1	0,5%*
Контактная коррекция	15	16,7%	0	0
Фоновые заболевания глаз	4	4,4%	217	97,6%*
Причина не известна	1	1,1%	0	0
Всего	90	100%	222	100%

Примечание: * - значимость различий (р < 0,05) при сравнении показателей: относительно первичной формы БК.

Данные таблицы показывает, что наиболее частыми причинами возникновения первичной формы БК является травматическое повреждение роговицы: микротравма (с инородным телом -35,6%, без инородного тела - 27,8%), реже - несоблюдение режима контактной коррекции (16,7%). При этом наличие фоновых заболеваний глаз на начальных стадиях установлено только у 4,4% пациентов. Практически первичная форма бактериального кератита развивалась вследствие инфицирования ранее здоровой роговицы в период острой травмы (микротравмы).

Напротив, при вторичной форме бактериального кератита основными факторами развития заболевания у 97,7% пациентов явились фоновые, длительно текущие заболевания глаз, приводящие к дистрофии роговицы: буллезная кератопатия при глаукоме, эндотелиально-эпителиальная дистрофия роговицы, рубцовые помутнения роговицы после перенесенных кератитов воспалительного или травматического характера.

Существенные различия установлены в характере этиологических микробных факторов при первичной и вторичной формах заболевания. Бактериологические исследования отделяемого конъюнктивальной полости при первичной форме БК установили рост микрофлоры у 98,9% пациентов, при этом, монокультура составила 92,3%, смешанная флора - 5,5%. Преобладал рост патогенных бактерий (Pseudomonas aeruginosa - 30,5%, Staphylococcus aureus - 42,7%) с высокой (84,1%) степенью интенсивности роста (КОЕ >10³). Смешанная микрофлора в большинстве случаев представлена ассоциацией S. aureus и S. еpidermidis.

При вторичной форме БК рост микрофлоры установлен у 86,1% пациентов, при этом, монокультура составила 82,4%, смешанная флора - 3,7%. Преобладал рост условно-патогенных видов S. epidermidis (45%), Е. сoli (13,1%), S. saprofiticus (3,3%), а также Str. viridans (4,9%). Смешанная микрофлора была представлена в большинстве случаев ассоциацией S. epidermidis и Corynebacterium jeikeum. Высокая степень обсемененности (КОЕ >10³) конъюнктивы наблюдалась у 72,7% пациентов.

Отличались группы пациентов с первичной и вторичной формой заболевания и по возрасту. Возрастной состав пациентов с клинически разными формами бактериального кератита представлен в таблице 2.

Таблица 2

Распределение пациентов при различных клинических формах бактериального кератита по возрасту

Формы БК	Возрастные группы
	До 18*лет	19-39 лет	40-59 лет	60-79 лет	80 лет и старше	Всего n
	абс	%	абс	%	абс	%	абс	%	абс	%
первичная	6	6,7	49	54,4	25	27,8	9	10	1	1,1	90
вторичная	0	0	8	3,6	22	9,9	165	74,3	27	12,2	222

Примечание:

*- среди них детей: 10 лет - 1; 15 лет - 1; 16 лет - 2, 18лет - 2.

Как видно из таблицы, первичная форма БК в большинстве случаев встречается в более молодой возрастной группе (19-39 лет), реже в возрасте 40-59 лет, тогда как вторичная форма БК, напротив, чаще наблюдается в возрасте старше 60 лет. Следует отметить, что заболевание в возрастной группе до 18 лет выявлено только при первичной форме бактериального кератита.

Первичная и вторичная форма БК отличались не только по этиологии, но и по клиническим проявлениям. Клиническая картина первичной формы бактериального кератита характеризовалась у всех пациентов острым началом с обильным слезотечением, светобоязнью, отёком век, гиперемией конъюнктивы, смешанной инъекцией глазного яблока разной степенью выраженности, резким снижением зрения. На роговице определялся инфильтрат серо-желтого цвета, чаще всего в центре или в парацентральной области роговицы разных размеров.

Вторичная форма БК характеризовалась подострым началом, вялотекущим течением, клинически стертыми симптомами: незначительным отёком век, умеренным слизистым отделяемым, слабовыраженной смешанной инъекцией. Поверхность роговицы была неравномерна в сочетании с участками деэпителизации, буллезного вздутия, дистрофических изменений в виде отложений солей кальция - кристаллов белого цвета, липидных гранул - в форме желтоватых отложений. Инфильтрат на фоне дистрофических изменений роговицы наблюдался разных размеров по поверхности и глубине распространения со слабо выраженным перифокальным отёком. Кроме этого, определялись отечность, васкуляризация в области лимба с появлением новообразованных сосудов, распространяющиеся в разные слои роговицы.

Обе формы бактериального кератита в своем течении имели 3 фазы развития воспалительного процесса: I - воспалительная фаза, II - пролиферативная, III - реорганизации рубца с эпителизацией роговицы. Однако каждая из форм БК отличалась по продолжительности течения. Так, I фаза при первичной форме длилась 5-7 дней, а при вторичной -10-18 дней, II фаза соответственно 7-10 дней и 8-15 дней, III фаза - 6-10 дней и 12-20 дней.

Фазы течения кератита были верифицированы с помощью цитологических исследований мазка-отпечатка непосредственно с поверхности дефекта роговицы.

Для I фазы течения первичной формы БК было характерно большое количество нейтрофилов (84-90%), при этом только 10% определялись в состоянии деструкции и аутолиза, в то время как при вторичной форме наблюдалось в мазках меньшее количество нейтрофилов (74 %), а половина из них находились в состоянии деструкции и аутолиза.

Во II фазе течения кератита при первичной форме уменьшалось количество нейтрофилов до 58-70%, тогда как при вторичной форме - происходило увеличение количества нейтрофилов с уменьшением клеток с явлениями аутолиза и деструкции до 25%. III фаза характеризовалась при обеих формах регенераторным типом цитограммы: уменьшением нейтрофилов до 36-40%, увеличением фибробластов до 45-47%, наличием пластов регенерирующего эпителия.

Течение первичной формы БК осложнилось у 19 (21,1%) из 90 пациентов с быстрым изъязвлением роговицы до глубоких слоев с формированием: десцеметоцеле - 2, перфорацией роговицы - 4, экспульсивной геморрагией - 1; развитием абсцесса роговицы - 7; генерализацией инфекции с развитием эндофтальмита - 4, панофтальмита - 1. Ввиду отсутствия эффекта консервативного лечения, нами проведено хирургическое лечение у 18 пациентов: послойная кератопластика - 2, сквозная кератопластика - 11, энуклеация - 3, эвисцерация - 2.

Морфологические исследования роговичных дисков, полученных после сквозных кератопластик, проведенных по поводу осложнений, выявили: лизис эпителия, некроз стромы, обильную инфильтрацию полиморфноядерными лейкоцитами (рис.1). Инфильтрат в роговице располагался как в поверхностных, так и в средних, глубоких слоях стромы, при этом отмечался отек десцеметовой мембраны вплоть до участков ее лизиса. Вокруг инфильтрата строма была резко отечной, отдельные стромальные пластинки были некротизированы, коллагеновые волокна разрушены, выявлялись участки некроза стромы роговицы.

Рис.1. Микрофото. Язвенный дефект роговицы при первичной форме бактериального кератита. Лейкоцитарная инфильтрация подлежащих слоёв. Окраска гематоксилин-эозин. Увеличение х 400.

Течение вторичной формы БК осложнилось у 73 (32,9%) из 222 пациентов: десцеметоцеле - 51, перфорацией роговицы - 10, экспульсивной геморрагией - 3; развитием абсцесса роговицы - 5; генерализацией инфекции с развитием эндофтальмита - 4. Хирургическое лечение проведено 39 пациентам: послойная кератопластика - 22 , сквозная кератопластика - 15, энуклеация - 2.

Морфологические исследования роговичных дисков, полученных после кератопластик, выявили наличие старых рубцовых изменений стромы роговицы в виде разрастания соединительной ткани в поверхностных, средних и глубоких слоях с большим количеством новообразованных сосудов и единичных нейтрофилов и лимфоцитов. Поверхность эпителия роговицы определялась неравномерной с резким истончением, буллезными изменениями и участками лизиса (рис.2). Инфильтрат состоял из большого количества роговичных пластинок неправильной формы, умеренного количества нейтрофилов и лимфоцитов (с преобладанием лимфоцитов) в поверхностных, средних, реже в глубоких слоях роговицы. Вокруг инфильтрата определялся неравномерный отек эпителия различной ширины с участками слабого скопления лимфоцитов и нейтрофилов.

Рис.2. Микрофото. Вторичная форма бактериального кератита с изъязвлением. Дефект эпителия, множество новообразованных сосудов, умеренная нейтрофильная инфильтрация. Окраска гематоксилин-эозин, увеличение х 400.

Для обоснования выделения двух форм БК, важным явилось установление различий в состоянии иммунного гомеостаза у пациентов на системном и локальном уровнях. Иммунологические исследования периферической крови показали, что при первичной форме БК достоверно повышено относительное и абсолютное число В-клеток (СD22+) в сравнении с контролем и вторичной формой БК при отсутствии других изменений в популяционном и субпопуляционном спектре лимфоцитов. При вторичной форме БК наблюдается достоверное снижение числа СD3+, СD4+, СD8+, СD22+ клеток, а также содержания в циркуляции лимфоцитов с морфологическими признаками апоптоза, чем при первичной форме БК и в контрольной группе. При первичной форме БК концентрация провоспалительных цитокинов IL-1б, IL-1в, IL-8 в сыворотке крови являются достоверно повышенными по сравнению с контролем и вторичной формой БК (таблица 3).

Таблица 3

Концентрация провоспалительных цитокинов в сыворотке крови при разных клинических формах бактериального кератита, М m

Показатели	Доноры n=30	Формы БК
		первичная n= 36	вторичная n =38
IL-1б (пкг/мл)	98,36,5	152,69,2*	62,13,2*,**
IL-1в (пкг/мл)	66,85,7	108,27,9*	39,5 2,7*,**
TNF-б (пкг/мл)	36,73,6	41,33,9	33,94,3
IL-8 (пкг/мл)	20,42,8	38,93,8*	18,23,8**

Примечание: значимость различий (р < 0,05) при сравнении показателей:

^* - относительно доноров;

^** - относительно первичной формы БК.

Иммунологические исследования слезной жидкости в динамике показали, что при первичной форме БК содержание sIgA, IgM, компонента комплемента С₃ и активности лизоцима на момент госпитализации пациентов достоверно повышено по сравнению с нормой, нормализация уровня sIgA происходит к 28-30 дню, IgM - к 14-17 дню, центральный компонента C3 и активность лизоцима остаются повышенными до 28-30 дня.

Напротив, при вторичной форме БК, в первые дни заболевания содержание sIgA, IgM, компонента комплемента С3 и активность лизоцима в слезной жидкости оказалось существенно меньше, чем в контрольной группе и чем при первичной форме БК.

Далее на 14-17 день исследования отмечается повышение уровня с нормализацией большинства показателей к 28-30 дню исследования (кроме sIgA и активности лизоцима).

Уровни цитокинов при первичной и вторичной формах БК в слезной жидкости в динамике приведены в таблице 4.

Таблица 4

Уровень провоспалительных цитокинов в слезной жидкости при клинически разных формах бактериального кератита в динамике заболевания, М m

Показатели	Доноры n =25	Сроки (дни)	Клинические формы
			первичная n=32	вторичная n=36
IL-1б (пкг/мл)	91 9,2	на момент госпитализации	270 25,2*	37 6,1*,**
		7-10	320 28,4*	55 6,9*,**
		14-17	200 21*	58 8,1*,**
		28 - 30	113 16*	61 8,4*,**
IL-1в пкг/мл)	89 9,0	на момент госпитализации	162 17,1*	35 5,6*,**
		7-10	170 15,1*	35 5,4*,**
		14-17	114 11,5*	38 5,9*,**
		28 - 30	93 7,9	41 6,0*,**
TNF- (пкг/мл)	718,3	на момент госпитализации	138 22,1*	34 2,1*,**
		7-10	184 18,1*	57 4,1**
		14-17	85 9,8	89 5,1
		28 - 30	72 5,8	135 16,2*,**
IL-8 (пкг/мл)	325 48,1	на момент госпитализации	1416 92,6*	315 26,8**
		7-10	1200 87,2*	430 36,1**
		14-17	623 58,3*	594 43,1*
		28 - 30	412 37,3	689 45,2*

Примечание: значимость различий (р < 0,05) при сравнении показателей:

^* - относительно доноров;

^** - относительно первичной формы БК.

При первичной форме БК содержание в слезной жидкости всех изучаемых флогогенных цитокинов (IL-1, IL-1в, ТNF-, IL-8) оказалось повышенным с момента госпитализации и практически на всем периоде наблюдения. При вторичной форме БК в слезной жидкости содержание IL-1в, IL-1б, TNF-б в первые дни исследования было ниже контрольной нормы. В динамике уровень IL-1, IL-1в оставался низким, тогда как содержание в слезной жидкости IL-8 и TNF-б достоверно повышалось на 28-30 день.

Параллельно с изменением уровней провоспалительных цитокинов у пациентов в слезной жидкости менялось и содержание реактантов острой фазы воспаления. При первичной форме БК содержание ₁-ингибитора протеаз в первые 7-10 дней заболевания было повышено, что следует расценивать как адекватную компенсаторную реакцию на усиление процессов протеолиза в воспалительной фазе течения кератита, затем в период пролиферации к 14-17 дню наблюдалось соответственно снижение концентрации ингибитора до нормы. При вторичной форме БК содержание ₁-ингибитора протеаз в слезной жидкости в первые дни исследования было достоверно ниже нормы и показателей при первичной форме БК, затем содержание увеличивалось в период пролиферации и рубцевания.

Содержание орозомукоида при обеих формах БК регистрировалось повышенным в течение всего периода исследования, особенно в первую неделю, однако при вторичной форме его концентрация была вдвое ниже, чем при первичной форме БК.

Таким образом, анализ иммунных показателей слезной жидкости и крови выявляет существенные различия в содержании патогенетически значимых для развития эндогенного воспаления клеточно-молекулярных компонентов иммунной системы при первичной и вторичной формах БК.

Развитие воспаления стандартно сопровождается параллельным формированием тканевой гипоксии, влияющей на состояние не только роговицы, но и функции иммуноцитов. Нами изучены активность и направленность гликолиза на местном уровне по показателям МК, ПВК и ЛДГ в слезной жидкости при клинически разных формах бактериального кератита в динамике заболевания. Определен коэффициент гипоксии (МК / ПВК) для первичной и вторичной форм БК в разные сроки исследования.

При первичной форме БК коэффициент гипоксии на уровне слезной жидкости кратковременно (до 7- 10 дня) повышается по сравнению с контрольной группой. При вторичной форме коэффициент гипоксии остается достоверно высоким в течение всего периода наблюдения в сравнении со здоровыми лицами и пациентами с первичной формой БК.

Определение продуктов ПОЛ, показало, что при обеих формах БК при поступлении имеются достоверно высокие показатели всех продуктов ПОЛ, что является характерным для воспалительной фазы течения кератита. Однако при исследовании в динамике при первичной форме существенных отличий с донорской группой не выявляется. Напротив, у пациентов с вторичной формой БК эти различия сохраняются до 14-17 дня. При сравнительном анализе уровня продуктов ПОЛ в слезе при первичной и вторичной формах БК, выявляются достоверные различия по содержанию МДА и ШО во все сроки наблюдения.

Установлена взаимосвязь между иммунологическими показателями слезной жидкости и коэффициентом гипоксии при клинически разных формах БК. Так, определена прямая корреляционная связь сильной степени между коэффициентом гипоксии и содержанием IL-1в (r = 0,527), IL-8 (r = 0,822), количеством нейтрофилов (r = 0,791) в мазках-отпечатках очага воспаления роговицы при первичной форме. Напротив, при вторичной форме БК выявлена обратная корреляционная связь сильной степени между коэффициентом гипоксии и содержанием sIgA (r = -0,913), IL-1в (r = -0,819) в слезной жидкости и прямая корреляционная связь сильной степени с уровнем IL-1в (r = 0,744) в периферической крови.

Выраженные корреляционные взаимосвязи зарегистрированы между иммунологическими показателями и клиническими симптомами при развитии осложнений. Так, при первичной форме выявлена корреляционная связь сильной и средней степени между тяжестью осложнений и следующими иммунологическими показателями: уровнем IL-8 (r = 0,764), IL-1в (r = 0,751), б₁ - ингибитора протеаз (r = -0,695), активностью лизоцима (r = -0.605). При вторичной форме БК также определена достоверная корреляционная связь между тяжестью осложнений и следующими иммунологическими показателями: уровнем, IL-1в (r = -0,870), sIgA (r = -0,810), IL-8 (r = -0,571), TNF-б (r = -0,589), б₁ - ингибитором протеаз (r = -0,712).

Применение регрессионного анализа позволило разработать модель прогноза осложненного течения бактериального кератита. Из 36 различных показателей (клинических, инструментальных, лабораторных) в качестве наиболее информативных выявлены иммунологические параметры: содержание IL-1в, IL-8 слезной жидкости, позволяющие прогнозировать осложненное течение с точностью до 92,1%. Прогнозирование различных осложнений БК защищено 3 патентами на изобретение.

Результаты изучения этиологии, клинико-иммунологических и других особенностей БК, а также корреляционного, регрессионного анализа полученных данных, позволили нами схематически представить патогенетические особенности развития первичной и вторичной форм БК (рис.3,4).

Первичная форма БК развивается при инфицировании здоровой роговицы экзогенной микрофлорой в период микротравмы. В основе развития первичной формы БК лежит кратковременная острая тканевая гипоксия, а также формирование иммунного ответа на мукозальном и системном уровне на патогенные микробные агенты в виде аккумуляции и активации фагоцитов в очаге воспаления (нейтрофилов до 84-90%, из них 10 % клеток - в состоянии деструкции и аутолиза). На фоне роста в очаге воспаления численности лейкоцитов установлено накопление в слезной жидкости разнообразных биологически активных веществ, основными из которых являются цитокины (IL-1, TNF-a , IL-8), реактанты острой фазы, ферменты и ингибиторы протеолиза, иммуноглобулины и компонент комплемента С3. Накопление свободных радикалов приводит к активации ПОЛ. Однако высокая активность антиоксидантной ферментной системы обеспечивает эффективную инактивацию продуктов ПОЛ и быстрый переход в следующую фазу течения кератита - пролиферацию.



Рис. 3. Этиологические и патогенетические особенности воспалительной фазы первичной формы бактериального кератита



Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 4.Этиологические и патогенетические особенности воспалительной фазы вторичной формы бактериального кератита

На системном уровне выявлен рост СD22+ клеток в циркуляции, усиление секреции провоспалительных цитокинов, активация функциональной активности фагоцитов, увеличивается концентрация IgА, sIgA, IgM, C3, C4. Каждый из этих белков обладает способностью участвовать в эффекторной фазе иммунного ответа.

Вторичная форма БК формируется на фоне дистрофически измененной роговицы, хронической тканевой гипоксии, в условиях накопления вторичных и конечных продуктов ПОЛ, стойкого снижения уровня антиоксидантной защиты тканей глаза. Иммунный ответ на системном уровне характеризуется снижением общей численности лимфоцитов, CD3+, CD4+ популяций, количества лимфоцитов с готовностью к апоптозу и с морфологическими признаками апоптоза, падением поглотительной и внутриклеточной бактерицидной активности фагоцитов. На мукозальном уровне установлена деструкция и аутолиз 50% нейтрофилов, низкий уровень IgA, sIgA, IgM, активности лизоцима, иммунных комплексов, б₁ИП, орозомукоида, провоспалительных цитокинов (IL-1, TNF-б₁) в слезной жидкости. Превалирование условно-патогенной микрофлоры, более низкий уровень системного и локального иммунного ответа, хронический характер течения воспалительного процесса свидетельствуют о снижении противомикробной резистентности дистрофически измененной роговицы при данной форме заболевания.

Представленные схематически основные этиологические и патогенетически значимые факторы при разных формах БК явились обоснованием дифференцированных направлений оптимизации терапии первичной и вторичной форм заболевания.

Лечение бактериального кератита

Разработано этапное, патогенетически обоснованное лечение клинически разных форм бактериального кератита, соответствующее фазе течения заболевания (рис. 5). На I этапе лечебные мероприятия направлены на купирование инфекции и отторжение, эвакуацию некротически измененных тканей; на II этапе - на подавление остаточной инфекции, стимуляцию репаративных процессов, стабилизацию мембран клеток; на III этапе - на реорганизацию рубцового помутнения и эпителизацию роговицы.

К особенностям лечения первичной и вторичной формы БК относится дифференцированное применение иммуномодулирующей терапии. При первичной форме БК с острым течением воспалительного процесса, с высоким уровнем накопления провоспалительных цитокинов в слезной жидкости целесообразно применение в I и II фазах заболевания препаратов противовоспалительно - иммуносупрессивного действия (лекролин, дексаметазон), а при вторичной форме БК (при снижении уровней sIgA, а также IL-1, IL-1в, TNF-б в слезе) - иммуностимулирующей и иммунозамещающей терапии (беталейкин и чигаин).

Нами изучена эффективность этапного, патогенетически обоснованного лечения первичной и вторичной форм БК по следующим критериям: клиническим, бактериологическим, иммунологическим, биохимическим.

Установлено, что при первичной форме БК у пациентов основной группы, получающих этапное, дифференцированное лечение с применением противовоспалительно-иммуносупрессивной терапии, такие клинические признаки, как исчезновение отделяемого из конъюнктивальной полости, смешанной инъекции, перифокального отека, очищение дна дефекта от некротических масс, рассасывание инфильтрата и эпителизация краев раны наступили на 3 - 5 дней раньше, чем у пациентов контрольной группы, получавших только стандартное лечение. Следует отметить, что полная эпителизация роговицы у пациентов основной группы наступила на 6 дней раньше по сравнению с группой контроля.

Рис.5. Схема лечения первичной и вторичной форм бактериального кератита

Результаты бактериологических исследований показали, что в контрольной и основной группах рост микрофлоры в конъюнктивальной полости в первые дни исследования выявлен был у всех пациентов, при этом чаще всего наблюдался рост S. аureus (46,4% и 43,8% соответственно), реже - Pseudomonas aeruginosa (28,3% и 28,1% соответственно). Следует отметить, что рост микрофлоры к 3 дню исследования у больных основной группы был выявлен в 1,6 раза реже, на 7-й день исследования в 3 раза реже, чем в контрольной группе.

Изучение эффективности лечения по содержанию провоспалительных цитокинов показало, что при первичной форме БК в основной группе концентрация их снижается уже в фазе пролиферации в 1,5 - 2,5 раза, достигая нормальных показателей. В контрольной группе содержание в слезной жидкости IL-1б, IL-1в, TNF-б в фазе пролиферации имеют тенденцию к снижению, при этом достоверное уменьшение их количества наблюдается только в III фазе рубцевания и эпителизации.

Анализ осложнений контрольной и основной групп, показал, что в основной группе частота осложнений составила 12,5%, тогда как в контрольной группе при применении традиционного лечения частота осложнений наблюдалась в 1,8 раза чаще (21,4%). Использование этапного, дифференцированного лечения в основной группе позволило улучшить зрение у 56,3% пациентов, тогда как при применении традиционного лечения в контрольной группе острота зрения повысилась только у 25,0% пациентов.

Установлено, что применение этапного, дифференцированного лечения при вторичной форме БК с использованием иммуностимулирующей и иммунозамещающей терапии позволило в более короткие сроки в основной группе добиться улучшение клинического состояния роговицы: исчезновение отделяемого из конъюнктивальной полости смешанной инъекции, перифокального отека, очищение дна дефекта от некротических масс, рассасывание инфильтрата и эпителизация краев раны наступили на 3 - 5 дней, полная эпителизация дефекта роговицы - в среднем на 11 -13 дней раньше, чем в контрольной группе, получавших традиционное лечение.

В основной группе наблюдается достоверное увеличение содержания sIgA, лизоцима и ₁-ИП уже в период пролиферации и нормализуется в период реорганизации рубца и эпителизации роговицы. Напротив, в контрольной группе содержание в слезной жидкости sIgA, лизоцима, ₁-ИП в I и II фазе воспаления практически не отличаются, при этом тенденция к увеличению показателей определяется только в период рубцевания и эпителизации.

Изучение уровня провоспалительных цитокинов показало, что при вторичной форме БК в основной группе, получавшей в комплексном лечении беталейкин, отмечается достоверное повышение всех цитокинов: IL-1б, IL-1в, TNF-б, IL-8 в пролиферативную фазу воспаления с нормализацией в период рубцевания и эпителизации. Напротив, в контрольной группе уровень IL-1б, IL-1в в слезной жидкости находится на низком уровне в воспалительную и пролиферативную фазу кератита с тенденцией к повышению в период рубцевания. Содержание TNF-б и IL-8 в контрольной группе умеренно повышаются в первой фазе, затем нормализуется к фазе эпителизации и организации рубца роговицы.

Коэффициент гипоксии в основной группе достоверно снижался уже в период пролиферации и нормализовался в период реорганизации рубца и эпителизации роговицы, тогда как в контрольной группе этот показатель демонстрировал только тенденцию к снижению во II и III фазах заболевания. Показатель антиоксидантного потенциала в основной группе достоверно увеличивался уже на стадии пролиферации с нормализацией в фазе рубцевания и эпителизации роговицы. Напротив, в контрольной группе интегральный показатель остался практически не измененным в I-II фазах кератита с тенденцией к нормализации к фазе рубцевания и эпителизации.

При вторичной форме БК в основной группе частота осложнений составила 15%, тогда как в контрольной группе количество осложнений наблюдалось практически в 2 раза больше. Острота зрения после проведенного лечения улучшилась в обеих группах. Однако применение этапного, дифференцированного лечения в основной группе позволило улучшить зрение у 14 (35%) пациентов, тогда как при применении традиционного лечения в контрольной группе острота зрения повысилась только у 8 (21,1%) больных.

Таким образом, обоснование клинической классификации БК с выделением двух форм и трех этапов течения воспалительного процесса, внедрение этапного дифференцированного лечения разных форм болезни на основе оценки иммунологических аспектов патогенеза привело к улучшению диагностики, прогноза и эффективности лечения заболевания.

ВЫВОДЫ

На основании анализа этиологических, иммунологических, биохимических, морфологических и клинических особенностей течения бактериального кератита обоснована клиническая классификация заболевания с выделением первичной и вторичной форм, а также трех фаз течения (I - воспалительная, II - пролиферативная, III - реорганизация рубца и эпителизации роговицы).

Первичная форма характеризуется деэпителизацией здоровой роговицы в период микротравмы, превалированием патогенной микрофлоры (Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa), высокой степенью обсемененности конъюнктивальной полости, острым началом, прогрессирующим течением заболевания. В очаге воспаления определяются лизис эпителия, некроз стромы роговицы с обильной инфильтрацией полиморфно-ядерными лейкоцитами (84-90%), из них 10% клеток находятся в состоянии деструкции и лизиса.

Вторичная форма бактериального кератита развивается при инфицировании дистрофически измененной роговицы условно-патогенной микрофлорой (Staphylococcus еpidermidis, Еsherichia сoli) с высокой степенью обсемененности, отличается подострым началом, вялотекущим, длительным течением. В очаге поражения определяются старые рубцовые помутнения стромы роговицы с новообразованными сосудами, умеренное количество полиморфно-ядерных лейкоцитов (65-70%), половина из которых находятся в состоянии деструкции и лизиса.

При первичной форме бактериального кератита изменения в иммунной системе характеризуются ростом относительного и абсолютного количества CD22 - положительных лимфоцитов, уровня IgA, IgM, С3, С4 компонентов комплемента, реактантов острой фазы на системном уровне. На местном уровне наблюдается повышение количества иммуноглобулинов A, sIgA, M, IgG, компонента комплемента С₃, б₁-ингибитора протеаз, орозомукоида, иммунных комплексов, лизоцима и провоспалительных цитокинов (IL-1б, IL-1в, TNF-б₁, IL-8) в слезной жидкости.

При вторичной форме бактериального кератита иммунологические изменения характеризуются снижением общей численности лимфоцитов, популяций CD3+, CD4+, количества лимфоцитов с готовностью и с морфологическими признаками апоптоза, падением поглотительной и внутриклеточной бактерицидной активности фагоцитов на системном уровне. На местном уровне установлен низкий уровень IgA, sIgA, IgM, лизоцима, б₁-ингибитора протеаз, орозомукоида, провоспалительных цитокинов (IL-1б, IL-1в, TNF-б) в слезной жидкости.

Осложненное течение бактериального кератита характеризуется максимально выраженными признаками иммуносупрессии, что проявляется снижением абсолютного количества лимфоцитов крови, популяций СD3+, СD4+, СD22+, количества лимфоцитов с готовностью (СD95+) и морфологическими признаками апоптоза в периферической крови, а также низким уровнем IgA, IgM, SIgA, ₁-ИП, лизоцима, провоспалительных цитокинов IL-1, IL-1в в слезной жидкости.

При первичной форме бактериального кератита выявлена высокая степень корреляционной взаимосвязи между биохимическими показателями тканевой гипоксии и содержанием IL-1в, IL-8 в слезной жидкости, а также процентным содержанием нейтрофилов в мазках-отпечатках из очага воспаления роговицы; при вторичной форме бактериального кератита корреляционные взаимосвязи между показателями гипоксии и иммунологическими параметрами (sIgA, IL-1в) выявляются не только на уровне слезной жидкости, но и на системном уровне.

Математическая модель, разработанная на основании регрессионного анализа иммунологических показателей (содержание IL-1в, IL-8) слезной жидкости позволяет прогнозировать осложненное течение бактериального кератита с точностью до 92,1%.

Разработано этапное, патогенетически обоснованное лечение клинически разных форм бактериального кератита, соответствующее фазе течения заболевания и характеру выявленных иммунных нарушений. Высокое содержание провоспалительных цитокинов (IL-1, IL-1в, IL-8) в сыворотке крови и слезной жидкости при первичной форме бактериального кератита обосновывает применение препаратов противовоспалительно - иммуносупрессивного действия. Выраженное снижение уровней IL-1, IL-1в, IgA в крови и слезной жидкости при вторичной форме бактериального кератита является основанием для применения иммуностимулирующей и иммунозамещающей терапии.

Установлена высокая эффективность этапного, дифференцированного лечения с применением иммунотропных препаратов при первичной и вторичной формах бактериального кератита, проявляющаяся в ускорении купирования инфекции, эпителизации краев и дна дефекта роговицы, в улучшении остроты зрения, в уменьшении развития частоты осложнений и показаний к хирургическому лечению практически вдвое при обеих формах заболевания.