Клинико-патогенетические особенности естественного течения вирусного гепатита C и оптимизация лабораторно-диагностических критериев исходов заболевания

Размещено на http://allbest.ru

На правах рукописи

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени

доктора медицинских наук

Клинико-патогенетические особенности естественного течения вирусного гепатита с и оптимизация лабораторно-диагностических критериев исходов заболевания

14.00.10. - инфекционные болезни

Знойко Ольга Олеговна

Москва - 2007

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

Научный консультант: академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Ющук Николай Дмитриевич

Официальные оппоненты: член-корреспондент РАМН Пак Сергей Григорьевич , доктор медицинских наук, зав.каф. ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова , профессор Росздрава

доктор медицинских наук, Никитин Игорь Геннадьевич , профессор каф. госпитальной терапии, ГОУ ВПО РГМУ Росздрава

доктор медицинских наук Шабалина Светлана Васильевна, профессор вед. н.с. ФГУН “ЦНИИ эпидемиологии”, Роспотребнадзора

Ведущее учреждение - ГУ Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М. П. Чумакова РАМН

Защита диссертации состоится « » ______________2008 г. в « » часов на заседании диссертационного совета Д.208.114.01 ФГУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (111123, Москва, ул. Новогиреевская, д.3-а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Автореферат разослан « »___________________ 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор Горелов Александр Васильевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. HCV-инфекция - одна из ведущих причин хронической патологии печени. В мире насчитывается более 175 миллионов человек, инфицированных вирусом гепатита С (около 1%). В большинстве развитых стран хронический гепатит С составляет четвертую часть в структуре всех хронических гепатитов, а хронический гепатит С с исходом в цирроз занимает первое место в структуре смертности от заболеваний печени (Kim WR. 2002; Tanaka Y. et al. 2006 Poynard T, 2003. Berry V. et al 2005, Yim CK. et al.2001).

По данным ВОЗ 2002 года, в 2001 году хронические заболевания печени были причиной 1,4 млн. смертей, включая 796 тыс. случаев смерти от цирроза и 616 тыс. - от рака печени. Как минимум 20% этих смертей (более 280 тыс.) связывают с гепатитом С. (Poynard T, et al. , 2003). Острая инфекция вирусом гепатита С у иммунокомпетентных людей только в 15-20% случаев заканчивается выздоровлением, а в большинстве случаев (80-85%) приводит к формированию хронической инфекции. (Wright T. et al 2004, Национальный Институт Здоровья США, 2002г.)

Установлено, что через 10 лет от момента инфицирования у 5-10% больных хроническим гепатитом С формируется цирроз печени, а через 20-30 лет уже у 20%-25% больных. Известно, что вирусный гепатит С с исходом в цирроз печени является наиболее частым показанием к проведению трансплантации печени в Европе и США, в связи с чем для большинства стран мира вирусный гепатит С является большой медицинской, социальной и экономической проблемой. (Poynard T. et al. 2003, Saadeh S et al. 2001, Никитин И.Г. и Строжаков Г.И. 2003).

К сожалению, даже в развитых странах из-за неадекватной диагностики и лечения смертность от хронического гепатита С продолжает оставаться высокой. (Poynard T.2006). Начиная с 1989г, когда появилась возможность диагностики гепатита С, и до настоящего времени в изучении патогенеза и естественного течения HCV-инфекции достигнуты значительные успехи: сформированы основные представления о механизме репликации вируса, показано, что в исходе острой инфекции ключевую роль играет клеточный иммунный ответ (Nakamoto Y.et.al 2001), а в исходе хронической инфекции скорость и интенсивность развития фиброза печени (Poynard T, et al 1999, 2002, 2006). Доказано, что HCV обладает высокой степенью генетической изменчивости и антитела, образующиеся к поверхностным антигенам HCV не обладают вируснейтрализующими свойствами, достаточными для элиминации вируса. (Bassett S.E.1996).

В течение последнего десятилетия быстрыми темпами развивались генные методы диагностики HCV-инфекции, позволившие добиться определения генетического материала вируса в минимальных концентрациях и доказать способность его репликации в лимфоцитах крови и других тканях помимо ткани печени. Благодаря разработке высокочувствительных методов идентификации нуклеиновых кислот и применению этих методов для уточнения исходов вирусного гепатита С, была сформирована концепция о новой форме инфекции вирусом гепатита С - скрытой или “оккультной” HCV-инфекции и был поставлен вопрос о принципиальной возможности реконвалесценции от этой инфекции, как спонтанной так и в результате противовирусной терапии (Carreсo V. 2006 Pan Yan-feng et al.2005, 2007 Castillo I. et al. 2007).

Наконец, за последние 10 лет, разработано достаточно эффективное лечение комбинацией пегиллированного интерферона и рибавирина, позволяющее добиться устойчивого вирусологического ответа у 50-60% больных ХГС (Poynard T. 2006, Ивашкин В.Т. с соавт., 2002, 2004, Блохина Н.П.с соавт, 2002, Никитин И.Г., 2003).

Однако, связи с недостаточной эффективностью современного противовирусного лечения в основе которого лежит опосредованное через иммунную систему организма действие интерферона, интенсивно изучаются функциональные особенности белков вируса гепатита С и особенности репликационного комплекса, который они образуют с целью разработки новых лекарственных препаратов, воздействующих на HCV (Lechmann M, et al 2000.),

Несмотря на большие достижения в изучении иммунопатогенеза гепатита С, остается много нерешенных вопросов в области диагностики, профилактики и лечения данного заболевания. К сожалению до настоящего времени не разработана профилактическая вакцина, предупреждающая заражение вирусом гепатита С, не разработаны критерии реконвалесценции этого заболевания, существует проблема непреодолимой резистентности к основному противовирусному препарату- интерферону, не внедрены в широкую клиническую практику методы диагностики скрытой HCV-инфекции и неинвазивные методы мониторинга фиброза печени.

В связи с этим можно выделить ряд актуальных направлений научных исследований, которые обусловлены проблемами клинической практики и тактическими вопросами ведения пациентов с вирусным гепатитом С:изучение клинической картины, исходов и вариантов течения вирусного гепатита С в сочетании с факторами неспецифического и специфического гуморального и клеточного ответа организма человека в ответ на внедрение вируса гепатита С, без чего невозможна разработка профилактических и лечебных вакцин, создание новых противовирусных препаратов и разработка критериев реконвалесценции; изучение закономерностей персистенции РНК HCV в различных субстратах организма человека в отсутствие лечения и после лечения интерфероном; изучение факторов резистентности к интерферону, таких как генетическая вариабельность генома HCV и рекомбинация фрагментов генома HCV; изучение механизмов и скорости формирования фиброза у больных хроническим гепатитом С и разработка методов неинвазивного мониторинга фиброза печени для оценки рисков прогрессии заболевания, эффективности лечения и прогнозирования исходов заболевания.

Исходя из актуальности нерешенных клинических проблем, касающихся HCV-инфекции были сформулированы цели и задачи данного исследования.

Цель исследования. Обосновать возможность прогнозирования исходов инфекции вирусом гепатита С на основании оценки диагностической значимости сывороточных маркёров фиброза печени, изучения факторов резистентности к интерферонотерапии и определения параметров специфического и неспецифического иммунного ответа для совершенствования тактики наблюдения и лечения больных гепатитом С.

1. Учитывая наличие в популяции больных ХГС лиц с быстрым формированием фиброза печени показана необходимость проведение ПБП больным ХГС даже с известной небольшой длительностью заболевания (1-3 года) для исключения выраженного фиброза печени и выработки лечебной тактики.

2. Учитывая наличие расхождений в оценке выраженной стадии фиброза печени по критериям Knodell и шкале METAVIR в 3,1% случаев и дополнительное выявление пациентов с выраженной стадией фиброза - F2 по шкале METAVIR в 7,8% случаев показана целесообразность проведения оценки биоптата печени одновременно по двум критериям.

3. Продемонстрирована целесообразность определение уровня CL-IV в сыворотке крови у больных ХГС не ответивших на интерферонотерапию или с противопоказаниями к выполнению ПБП для осуществления неинвазивного мониторинга фиброза печени с целью исключения прогрессирующего фиброза.

4. Показано, что тестирование РНК HCV в лейкоцитах крови может быть рекомендовано в качестве дополнительного метода обследования, так как позволяет выявлять виремию у части предполагаемых спонтанных реконвалесцентов ВГС и больных ХГС с отсутствием РНК HCV в плазме крови после завершения курса противовирусной терапии.

5. Установлено, что наличие анти-NS5А IgG у предполагаемых реконвалесцентов ВГС со сроком наблюдения более 3 лет является показанием для углубленного обследования с целью исключения латентной HVC- инфекции, а у больных ОГС в остром периоде заболевания является маркером перехода ВГС в хроническую форму.

Апробация работы и внедрение в практику. Диссертация апробирована заседания кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии ГОУ ВПО МГМСУ Росздрава от 30 июня 2007г. (протокол № 52). Материалы диссертации доложены и на II, III, IV, V и VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Гепатит В, С, Д и G - проблемы изучения, диагностики, лечения и профилактики» (1997, 1999, 2001, 2003 и 2007гг), II Всероссийской конференции «Полимеразная цепная реакция в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний» (1998г.), III, VIII, XI Российской конференции «Гепатология сегодня» (1998, 2002, 2006), научно-практической конференции “Гепатит С (Российский консенсус)” в 2000г., Третьей Международной ассамблеи “Новые медицинские технологии” (2001г), Московской научно-практической конференции “Инфекционные болезни и антимикробные средства”( 2003, 2004, 2006, 2007гг)., на заседании Общества врачей-инфекционистов г. Москвы (2003), на проблемной учебно-методической комиссии по инфекционным болезням на базе Всероссийского научно-методического центра по непрерывному медицинскому и фармацевтическому образованию при МЗ России (Москва 2002г), совещании в рамках New Visby Program в Шведском институте по контролю над заболеваемостью (Центр Микробиологии и биологии опухолей Каролинского Института) г. Стокгольм (2003г), на международной конференции “ HCV 2005 Visby Program Workshop: HCV infection- factors associated with persistence, clearance and protection, г. Мальмо Швеция (2006г), конференции с международным участием “Клиническая и экспериментальная вирусология HCV-инфекции” в Биомедицинском учебном и исследовательском центре Латвийского университета (Латвия, г.Рига, 2005г), на конференции практических врачей “Актуальные вопросы гепатологии” Главного клинического госпиталя МВД России, (Москва 2004г), научно-практической конференции «Вопросы инфекционной патологии Урала», (Тюмень, 2004), Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (2004г),конференции “Хронические вирусные гепатиты в практике лечебных учреждений военно-медицинского управления ФСБ России: актуальность проблемы, возможности диагностики и лечения” (Москва 2005г.), первом международном конгресс по репродуктивной медицине (Москва ,2006г), Российском медицинском форуме-2006, г.Москва, на VII съезде научного общества гастроэнтерологов России, посвященном 40-летию со дня основания Всесоюзного НИИ гастроэнтерологии- Центрального НИИ гастроэнтерологии (Москва 2007г.), VII Российском съезде инфекционистов “ Итоги и перспективы диагностики и лечения инфекционных больных” (Нижний Новгород, 2007г.). Материалы диссертации доложены в виде постерных докладов на международных конференциях и симпозиумах: XVI всемирном конгрессе эпидемиологов (г.Монреаль,2002г), IX Объединенной Европейской Гастроэнтерологической неделе (г.Амстердам), XI симпозиуме по Гепатиту С (г.Гейдельберг, 2004г), Всемирном конгрессе по гастроэнтерологии (г.Монреаль, 2005г), 12-ом Международном Симпозиуме по Вирусным гепатитам и болезням печени (г.Париж, 2006), Первой конференции по вопросам ВИЧ/СПИД в Восточной Европе и Центральной Азии (г Москва, 2006г), 3-ей Интернациональной конференции по ВИЧ и HCV/ВИЧ коинфекции (г.Париж, 2007г), 4-ом Интернациональном симпозиуме по гепатиту С (г.Глазго, 2007)

Публикации. Основные положения диссертации изложены в 64 печатных работах, опубликованных в период с 1996 г. по 2006 г., из них 15 в центральной печати.

Основные положения проведённых исследований вошли в методические рекомендации «Вирусные гепатиты. Клиника, диагностика, лечение» (2000), «Противовирусная терапия хронических вирусных гепатитов В и С у ВИЧ-инфицированных» (2006), «Алгоритм диагностики и лечения гепатита С у ВИЧ-инфицированных потребителей инъекционных наркотиков» (2006г) и другие инструктивно-методические документы. Основные положения диссертации вошли также в «Лекции по инфекционным болезням» под редакцией академика РАМН профессора Ющука Н.Д. (1996, 1999).

Результаты настоящего исследования используются в учебном процессе Московского государственного медико-стоматологического университета по подготовке студентов, интернов, клинических ординаторов, врачей - слушателей курсов на факультете постдипломного обучения в лекционных материалах и при проведении семинарских занятий. Результаты диссертационной работы внедрены в практическую работу Инфекционной клинической больницы №1 г. Москвы.

Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 285 страницах машинописного текста, включает в себя введение, обзор литературы, несколько глав собственных исследований, обсуждение и выводы; работа проиллюстрирована 60 таблицами, 40 рисунками. Обзор литературы составлен на основании анализа 50 источников на русском языке и 280 - на иностранном.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Объём, характер и методы проведённых исследований

Для решения поставленных в настоящей работе задач были проведены следующие клинико-лабораторные исследования:

1. Клиническое обследование (данные физикального осмотра и оценка жалоб пациентов) с последующей формулировкой основных клинических синдромов и определения степени их выраженности проводилось у 150 больных острым гепатитом С и 380 больным хроническим гепатитом С, наблюдаемых в ИКБ №1 г. Москвы в 1996-2006гг.

Анализ морфологии пунктата печени в зависимости от степени биохимической активности и давности заболевания проводился у 307 больных с репликативной формой ХГС включая больных с постоянно нормальной активностью трансаминаз - ХГС ПНАТ в течение 1 года - 5 лет и больных с постоянно повышенной или волнообразной активностью АлАТ -ХГС ППАТ, которым была выполнена ПБП. Эффективность монотерапии интерфероном (в стандартных дозах З млн.МЕ 3 раза в неделю) больных хроническим гепатитом С оценивалась при наблюдении за 160 больными.

Исследование клинико-диагностической роли сывороточных маркеров фиброза - гиалуроновой кислоты и коллагена IV типа проводилось у 88 больных ХГС, 28 пациентов с циррозом печени; 13 больных желтушной формой ОГС, у которых в последующем сформировался ХГС; 19 пациентов с фиброзом легких (ФЛ) и у 32 здоровых добровольцев. Оценка частоты выявления аутоантител (ANA, SMA, AMA, анти-LKM-1, анти-LC-1, анти-LSP) проводилась у 26 больных ХГС с предполагаемым аутоиммунным компонентом, включая 9 пациентов резистентных к интерферонотерапии. Клиническое значение персистенции РНК HCV в лейкоцитах крови больных ХГС оценивалось у 104 пациентов с наличием анти-HCV в крови (включая 24 пациента со спонтанной клинико-биохимической ремиссией, 30 с ремиссией на фоне терапии интерфероном, и 24 больных резистентных к интерферонотерапии). Выявление вариантов генетической изменчивости ISDR региона гена NS5А генотипа 1b вируса гепатита С у больных ХГС проводилось у 16 пациентов резистентных к интерферонотерапии и 3-х пациентов с достижением вирусологического ответа. Степень распространения рекомбинантного интергенотипического варианта вируса гепатита С - RF1_2k/1b изучалась в группе из 63 больных ХГС, включая 49 пациентов получавших монотерапию интерфероном.

Исследование особенности естественного течения и исходов гепатита С при различных формах заболевания в сопоставлении с показателями специфического (гуморального) и неспецифического (иммунный статус) иммунного ответа пациента осуществлялось в группе пациентов включавшей 150 больных ОГС (из них 30 с известным исходом заболевания), 45 больных ХГС (из них 20 с ХГС ППАТ и 23 с ХГС ПНАТ), 12 рековалесцентов ВГС со сроком наблюдения 3-10 лет, и 30 здоровых людей контрольной группы. Острый вирусный гепат С диагностировался в случае клинической картины острого гепатита с обязательным наличием желтухи; изменениями функциональных проб печени (гипербилирубинемия более 20 мкмоль/л, превышение АлАТ более 10 норм АЛТ), при наличии в крови анти-HCV, РНК HCV и исключения маркеров других острых гепатитов. Хронический вирусный гепатит С диагностировали в случае длительности заболевания более 6 месяцев, наличия анти-HCV и РНК HCV в крови. Диагноз ЦП устанавливался на основании клинико-лабораторных и инструментальные исследований (снижение протромбинового индекса, общего количества тромбоцитов, альбумина, признаки портальной гипертензии при ультразвуковом исследовании, эзофагогастродуоденоскопии с оценкой состояния вен пищевода и кардиального отдела желудка).

2. Всем пациентам изучаемых групп выполнялось биохимическое исследование крови, включавшие фракционное количественное определение уровня билирубина методом Йендрашика, определение уровня активности аспартатаминотрасферазы, аланинаминотрансферазы методом IFCC на автоматическом биохимическом анализаторе Cobac Mira Plus (Hoffman-La-Roche, Швейцария), показателей тимоловой пробы модифицированным методом Mac-Lagan, протромбинового индекса, активности щелочной фосфатазы, гамма-глутамилтранспептидазы, количества общего холестерина, бета-липопротеидов, общего белка и белковых фракций методом электрофореза.

3. Клиническое исследование периферической крови с подсчётом форменных элементов в единице объёма на автоматической гематологической системе ADIVA 60-CT выполнялось от 20 до 40 раз всем больным, включенным в исследование.

4.Определение в сыворотке крови маркёров вирусных гепатитов. Специфическая диагностика вирусных гепатитов проводилась в лаборатории ИКБ №1 г. Москвы методом ИФА при помощи различных коммерческих диагностическими тест-систем (НВsАg - «Organon teknika»; анти-НBсоrе IgM, IgG - «Диагностические системы» или «Lа Roche», Швейцария, «Вектор-Бест»; анти-HCV - «Органон», «ГепаCкан, «La Roche» иммуноблотинг «Deciscan».

5.Ультрасонографическое исследование органов брюшной полости проводилось на аппарате Esaote Megas.

6. Пункционная биопсия печени проводилась чрезкожно при помощи пункционной иглы «Hepafix» (типа Menghini) диаметром 1,2-1,6 мм под местной анестезией. Морфологическое исследование пунктата печени заключалось в оценке некрозовоспалительной активности гепатита, выраженности фиброза и проводилось полуколичественным методом с использованием критериев Knodell и шкалы METAVIR, в 41 случае дополнительно по критериям Ishak .

7. Полимеразная цепная реакция и определение генотипа HCV: качественное и количественное определение РНК HCV осуществляли с использованием набора «fmol DNA Sequencing Kit» фирмы «Promega». Экстракцию нуклеиновых кислот и выявление РНК HCV в клинических образцах (плазмы крови и лейкоцитарной фракции) проводили с использованием коммерческого набора «Полигеп С» НПФ «Литех». Генотипирование HCV проводили с помощью SSCP анализа ампликонов, полученных при детекции РНК HCV в исследуемых клинических образцах с использованием системы типоспецифичных праймеров, предложенной Н. Okamoto и путем прямого секвенирования NS5A области генома ВГС. Определение генотипов и субтипов ВГС для выявления рекомбинантных субтипов было проведено методом филогенетического анализа, секвенированных NS5B-, 5'UTR- и core-фрагментов генома HCV. Детекцию РНК HCV методом ПЦР с предварительным получением кДНК методом обратной транскрипции (ОТ-ПЦР) осуществляли с помощью коммерческой тест-системы «Гепатоген С» производства ЗАО НПФ «ДНК-Технология». ОТ-ПЦР проводили с использованием флуоресцентных зондов и результаты оценивали после прохождения реакции по уровню флуоресценции, измеряемого ПЦР-детектором. В качестве мишени для постановки ОТ-ПЦР была выбрана 5' нетранслируемая область РНК HCV.

8. Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей NS5A фрагмента генома вируса гепатита С был проведен с использованием программы «Sequence Navigator software» (Biosystems Inc, Foster City, CA). Аминокислотная последовательность (позиции HCV NS5A 2209-2248) исследуемых образцов была сопоставлена с интерферон-чувствительным фрагментом генома вируса гепатита С (HCV ISDR NS5A 2209-2248) референсного изолята вируса гепатита С (HCV-J). Количественное определение RNA HCV проводили с помощью набора «Amplicor HCV monitor test» фирмы «Roche».

9. Исследование аутоиммунных антител ANA, SMA, AMA анти-LKM-1, выявлялись методом иммунофлюоресценции, антитела к печеночному цитозолу (LC-1), антитела к специфическому печеночному липопротеину (LSP) выявлялись методом ИФА с использованием лабораторных тест - систем (разработка Speciality Laboratory, USA). Всего проведено 602 исследования с 86 образцами сывороток крови.

10. Гуморальный ответ к HCV изучался с применением лабораторных тест-систем, позволяющих раздельно выявлять анти-HCV класса IgM и IgG к различным белкам HCV методом ИФА и содержащих рекомбинантные белки и синтетические пептиды, моделирующие иммунодоминантные эпитопы структурных (core и его пептиды с аминокислотными последовательностями: аа 1-20, аа 13-33, аа 61-87; Е1; Е2, включая HVR-N и HVR-C) и неструктурных белков HCV (NS3 и его 18 пептидов, входящие в состав 7 пулов) , NS4, мозаичный NS5А, а так же синтетические пептиды, моделирующие иммунодоминантные участки аминокислотной последовательности различных белков HCV core-16 (аа 3-116); NS4-20 (аа 1921-1940); NS5А-23 (аа 2295-2317). Пептиды и белок сore синтезированы в лаборатории антигенных детерминант вирусных белков и пептидного синтеза Института вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН, использовались рекомбинантные полипептиды NS3, NS4, NS5А (разработка НПО «Диагностические системы» г. Нижний Новгород).

11. В изучаемых группах: ОГС, ХГС ППАТ, ХГС ПНАТ, реконвалесценты ВГС со сроком наблюдения 3-10 лет, контрольной группы, проводилось исследование следующих показателей иммунного статуса: CD3+, CD4+, CD8+, CD16+, CD20+, HLA- DR+CD3+, CD95+, О-лимфоцитов. Определение процентного содержания субпопуляций лимфоцитов осуществлялось с помощью метода проточной цитофлюориметрии.

12. Концентрацию гиалуроновой кислоты (ГК) в сыворотке крови определяли с применением стандартных коммерческих наборов «HYALURONIC ACID (HA) QUANTITATIVE TEST KIT» фирмы Corgenics Inc. (USA) на основе одноступенчатого ИФА, для исследования концентрации CL - IV использовали стандартные коммерческие наборы «CL - IV PLATE KIT» фирмы DAIICHI FINE CHEMICALCO., LTD (Japan) на основе двухступенчатого ИФА

Часть статистической обработки результатов осуществлялась с помощью программы Microsoft Excel (версия 7,0 для Windows`98 и 2000). Были определены: процентное содержание ряда полученных данных (%), средняя арифметическая (М), средняя ошибка средней арифметической (m). Для проверки гипотезы о различии выборок (групп больных) применялся критерий Стьюдента. Основной статистический анализ результатов клинических исследований проводился с помощью программы Statistica for Windows 6,0. Однородность групп оценивалась с применением теста на нормальный закон распределения (критерий Колмогорова-Смирнова), корреляционные связи оценивались в соответствии с коэффициентом Спирмена.

Для определения влияния индекса фиброза по Knodell, METAVIR, Ishak на изучаемые факторы (уровень коллагена и гиалуроновой кислоты в крови) использовали однофакторный дисперсионный анализ - ANOVA. Зависимость средних значений и дисперсий оценивали по критериям Стьюдента, Уэлча, Фишера. Критерий Фишера использовали при сравнении дисперсий изучаемых величин, при их (дисперсий) равенстве использовали t (критерий Стьюдента), при их неравенстве использовали T (критерий Уэлча). Результаты описаны в виде среднего значения ± средняя ошибка средней (M±m). Для оценки значимости различий качественных признаков в группах использовали критерий хи-квадрат. Для оценки значимости корреляционной связи между лабораторными показателями применялся параметрический корреляционный анализ Спирмена (r).

Работа выполнена в клинике кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии в ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию (ректор - прфессор О.О.Янушевич, президент- академик РАМН, профессор Н. Д. Ющук) на базе ГУЗ г. Москвы ИКБ№1 ДЗ г. Москвы (гл. врач - д.м.н., проф. Малышев Н.А., зав. консультативным специализированным гепатологическим отделом - д.м.н., проф. Блохина Н.П.). В выполнении отдельных фрагментов работы принимали участие сотрудники лаборатории диагностики вирусных гепатитов и отдела молекулярной вирусологии НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, Specialty Laboratories (США), Шведского института по контролю над заболеваемостью (Swedish Institute for Infectious Disease Сontrol) г.Стокгольм, Швеция, лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов ФГУ «НИИ Физико-химической медицины» Росздрава, ИКБ №1 ДЗ г. Москвы, ЗАО НПФ “ДНК- технологии”, лаборатории клинической биохимии ГУ РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН, НИИЭМ им. Пастера г.Санкт-Петербург и кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии ГОУ ВПО МГМСУ ( к.м.н. Яшина Т.Л., д.б.н., проф. Говорун В.М., к.б.н. Ильина Е.Н., д.б.н., д.б.н. Круглов И.В., ст.н.с М.Г.Исагулянц, к.б.н. И.Г.Мальков, в.н.с.,Н.В.Любимова, д.б.н., Кушлинский Н.Е., к.б.н. О.В. Калинина, к.м.н. Д.М. Брагинский, Е.И.Келли., д.м.н. Е.А.Климова, к.м.н. О.Л. Огиенко., к.м.н. Н.Х.Сафиуллина., к.м.н. К.Р. Дудина), которых искренне благодарю за помощь.

Приношу глубокую благодарность заслуженному деятелю науки РФ, президенту Московского государственного медико-стоматологического университета, заведующему кафедрой инфекционных болезней и эпидемиологии, академику РАМН, профессору Николаю Дмитриевичу Ющуку за большую научно-консультативную помощь, оказанную при проведении настоящей работы.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

С целью определения степени активности и стадии процесса в печени, выработки лечебной тактики было обследовано 307 больных хроническим гепатитом С (94 женщины (30,6%) и 213 мужчин (69,4%) в возрасте от 16 до 65 лет. У большинства больных (179 из 307-58,3%) выявлялся 1-й генотип HCV. Наиболее представительной была группа пациентов в возрасте от 21 года до 31 года (42,7%). У большинства пациентов (96,7%) антитела к вирусу гепатита С обнаружили при диспансеризации или при обследовании по поводу других заболеваний.

Только у 10 (3,3%) больных поводом для обследования на наличие антител к ВГС явилось изменение самочувствия и появление жалоб на снижение толерантности к физической нагрузке или дискомфорта в правом подреберье. иммунопатогенез вирусный гепатит вакцина

Точно установить длительность заболевания было возможно у 8,8% пациентов, перенесших желтушную форму ОГС (27/307). Они перенесли ОГС, в среднем, за 3,02±0,7 года (от 0,5 до 17 лет) до проведения пункционной биопсии печени.

Предположительную давность заболевания у части пациентов можно было определить по дате гемотрансфузии (40 пациентов - 13%) и начала внутривенного введения наркотических средств (87 пациентов - 28,4%). У части больных (153 пациента - 49,8%) установить давность заболевания не представлялось возможным.

Длительность заболевания у 154 (50,2%) больных ХГС с известной и предположительной давностью инфицирования до момента проведения ПБП составила, в среднем, 6,86±5,6 лет и варьировала в широких пределах (от 0,5 до 30 лет).

При морфологическом исследовании пунктата печени стадия фиброза по критериям Knodell была установлена у 307 больных. По двум критериям (Knodell и METAVIR) были оценены пунктаты печени 192 больных и получены данные, представленные в таблице 1.

Таблица 1

Распределение больных в зависимости от стадии фиброза печени при оценке пунктата печени по критериям Knodell и шкале METAVIR.

Результаты, представленные в таблице, демонстрируют, что оценка пунктата печени по критериям Knodell позволила выявить в группе из 307 пациентов наличие выраженного фиброза (F3+F4) у 47 больных - 15,3% случаев.

При оценке выраженного фиброза печени одновременно по критериям Knodell и шкале METAVIR выявлены расхождения по наличию стадий F3-F4 у 6 из 192 больных - 3,1%. Дополнительно по шкале METAVIR удалось выявить наличие фиброза 2 стадии у 15 (7,8%) пациентов.

Группа больных с фиброзом печени 3-4 стадии была представлена 37-ю (79,7%) мужчинами и 10-ю женщинами (21,3%), средний возраст по группе составлял 35 ± 4,7 лет. У 7 пациентов из 47 (8,5%) больных данной группы диагностирована 4 стадия фиброза печени.

Среди пациентов с 4-й стадией фиброза печени было 2 женщины (28,6%) и 5 мужчин (71,4%). Среди больных ХГС с выраженным фиброзом печени значительная часть была представлена пациентами в возрасте 41-50 лет (36,2%), однако, группа пациентов моложе 30 лет составляла приблизительно такую же долю - 38,3%.

Поскольку важным фактором, влияющим на степень поражения печени при ХГС, является употребление алкоголя, целесообразно было определить количество лиц, злоупотребляющих алкоголем, в целом, по группе - оно составило 34 человека (11,1%): 21 пациент с ХГС F1 и 13 пациентов с ХГС F3 по критериям Knodell.

К группе лиц, злоупотребляющих алкоголем, были отнесены больные без признаков тяжелой алкогольной болезни (как лабораторных, так и клинических) и представляющие 4 группу по классификации Э. Е. Бехтель (1986): cистематически пьющие лица - употребляющие 200-300 мл (до 500 мл) водки 1-2 раза в неделю.

Большинство этих больных указывали на регулярное употребление алкоголя (1-2 раза в неделю) в значительных дозах (200-500гр), в основном, за счет крепких алкогольных напитков (водка, коньяк, виски). Доля таких больных в группе ХГС F0 + ХГС F1 составила 8%± 1,7 (21/260 человек), а в группе ХГС F3-4 доля таких больных была уже существенно большей - 27,7% ± 6,5 (13 из 47) (p=0,002*), в тоже время, большинство пациентов с выраженным фиброзом печени - 72,3% (34 из 47) не злоупотребляли алкоголем.

Среди больных ХГС c 3-4 стадией фиброза печени доля пациентов, злоупотребляющих алкоголем, достоверно выше по сравнению с таковой среди больных, не злоупотребляющих алкоголем (38,2%±8,3 (13 из 34 пациентов) и 12,5%±2,0 (34 из 273 пациентов), соответственно, p=0,004).

Таким образом, полученные результаты позволяют сделать заключение о значительном влиянии систематического употребления алкоголя на формирование выраженного фиброза печени у больных ХГС. Однако, большая доля пациентов с фиброзом печени F3-4 (34 из 47 - 72,3%) не злоупотребляла алкоголем и хронический гепатит С оставался единственной причиной формирования фиброза печени у этой группы больных.

Исследуемая группа из 307 больных ХГС была проанализирована также при делении на 2 группы по признаку биохимической активности гепатита: 43 (14%) больных ХГС ПНАТ и 264 (86%) больных ХГС ППАТ. Данные группы отличались только по половому составу: в группе больных ХГС ПНАТ преобладали женщины 67/264 - 25,4%±2,7 и 27/43- 62,8 % ±7,4 р=0,003. Давность заболевания можно было установить у 124 больных ХГС ППАТ и у 14 больных ХГС ПНАТ.

Среди больных ХГС с известной давностью заболевания не было выявлено пациентов с фиброзом 4 стадии. У части больных с известной давностью заболевания наблюдалась очень быстрая прогрессия до стадии фиброза 3.

В нашем исследовании таких пациентов было 7 из группы 39 человек с давностью заболевания 1-5 лет (17,9 %). В группе ХГС ПНАТ нами не выявлено стадии фиброза 3 по Knodell среди больных с давностью заболевания 1-5 лет.

Не выявлено достоверных различий по частоте регистрации фиброза печени более чем 1-й стадии (суммарно по Knodell и METAVIR) среди больных ХГС ППАТ и больных ХГС ПНАТ (46 из 264-17,4% и 5/43 -11,6%, соответственно, p>0,05)

В исследование по изучению диагностического значения определения сывороточных маркёров фиброза печени (гиалуроновой кислоты - ГК и коллагена IV типа - CL-IV) было включено 88 больных ХГС ППАТ с различными стадиями фиброза печени, 28 пациентов с циррозом печени (ЦП): 11больных с ЦП класса А по Чайльд-Пью, 9 с ЦП класса В и 8 с ЦП класса С; у 11 (39,3%) - ЦП HCV - этиологии, у 7 (25 %) - ЦП смешанной этиологии (ВГС+алкоголь) и 10 (35,7%) - ЦП алкогольной этиологии; 13 больных желтушной формой ОГС, у которых в последующем сформировался ХГС; группа сравнения - 19 пациентов с фиброзом легких (ФЛ); контрольная группа (КГ) - 32 практически здоровых человека. Распределение исследуемых групп по полу и возрасту представлено в таблице 2.

Таблица 2

Распределение по полу и возрасту в группах больных ХГС ППАТ, ЦП, ОГС, ФЛ и КГ.

Морфологическое исследование биоптатов печени проводилось одним патоморфологом с использованием полуколичественных методов оценки в баллах выраженности фиброза и активности гепатита по двум шкалам (R.G.Knodell и METAVIR). Количество портальных трактов в исследуемых образцах составляло в среднем 7+/-0,3 (от 4 до 17). Так как при сравнении частоты регистрации различных стадий фиброза у больных ХГС по шкалам R.G.Knodell и METAVIR не получено существенных различий, в дальнейшем сравнительный анализ полученных данных по сывороточным маркерам фиброза и морфологии печени мы проводили используя шкалу R.G.Knodell.

Больные ХГС, у которых при морфологическом исследовании ткани печени выявлена стадия фиброза F4 (n-4), были включены в группу больных ЦП класса А по Чайлд - Пью. Таким образом, у 4 (14,3%) из 28 пациентов с циррозом печени диагноз ЦП явился неожидаемой гистологической находкой, т.к. у этих больных не было клинических, лабораторных данных и УЗИ - признаков, указывающих на ЦП. Остальным 24 больным ЦП (85,7%) диагноз поставлен на основании клинико-лабораторных данных и УЗИ, биопсия печени не проводилась.

У больных ХГС F1 регистрировался ХГ со слабовыраженной (n-27, 42,9%) и умеренной активностью (n-36, 57,1%), у больных ХГС F3 зарегистрирован гепатит умеренной (n-16, 64%) и выраженной активности (n-9, 36%). При морфологическом исследовании ткани печени больных ХГС F1 и ХГС F3 отсутствие воспалительного процесса (ИГА=0) и минимальная степень активности (ИГА=1-3) не выявлены. Сравниваемые группы (ХГС F1 и ХГС F3) не различались по частоте выявления умеренного хронического гепатита (p>0,05), однако тяжелый гепатит (ИГА=9-12) зарегистрирован только у пациентов с F3 , а слабовыраженный хронический гепатит (4-8) - только у больных с F1.

В связи с тем, что наибольшие трудности в клиническом аспекте представляет дифференциальный диагноз фиброза 1 и 3 стадий, а также фиброза 4 стадии без клинических проявлений ЦП, наибольший интерес представлял сравнительный анализ клинико- лабораторных данных больных ЦП класса А по шкале Child-Pugh и больных ХГС F1 и ХГС F3 .

По доле лиц с наличием жалоб и тех или иных клинических проявлений группы больных ХГС F1 и ХГС F3 не различались: не предъявляли жалоб на момент обследования (68,3% и 64% больных, соответственно), в то время как, среди больных ЦП (А) жалобы отсутствовали лишь у 2 (18,2%, p<0,01) больных. У больных ЦП (А) по сравнению с больными ХГС F1 и ХГС F3 существенно чаще встречались астеновегетативный (72,7%, 17,4% и 24% соответственно, p>0,05), диспептический (81,8%, 14,3% и 12% соответственно, p<0,01) синдромы и тяжесть в правом подреберье (72,7%, 15,9% и 16% соответственно, p<0,01). Достоверно чаще у больных ЦП (А) по сравнению с пациентами с ХГС F1, ХГС F3 наблюдалась гепатомегалия (100%, 60,3%, 68% соответственно, p>0,01) и спленомегалия (63,6%, 14,3%, 16%). Желтуха зарегистрирована у 3 (27,3%) пациентов с ЦП (А) и ни у одного больного ХГС F1 и ХГС F3. Вторичные печеночные знаки выявлялись у 54,5% больных ЦП (А) и не зарегистрированы у пациентов с ХГС F1 и ХГС F3. Также у больных ЦП (А) в отличие от больных ХГС F1 и ХГС F3 регистрировалась энцефалопатия (36,4%). У больных ЦП (А) присутствовали геморрагический синдром (носовые кровотечения и кровоточивость десен - у 27,3% больных) и снижение массы тела на 1-3 кг за последние 1-3 года (44,4%), которые не зарегистрированы у пациентов с ХГС F1 и ХГС F3. По данным УЗИ печени у больных ХГС F1 и ХГС F3 одинаково часто выявлялись следующие признаки: гиперэхогенность и неоднородность эхоструктуры печени (55/63 - 87,3% и 22/25 - 88% соответственно, p>0,05), гепатомегалия (60,3% и 68% соответственно, p>0,05) и спленомегалия (14,3% и 16% соответственно, p>0,05). У больных ЦП (А) при УЗИ наряду с изменением эхоструктуры печени, увеличением размеров печени и селезенки отмечалось увеличение диаметра портальной и селезеночной вен у 7 (63,6 %) пациентов.

Cравнительный анализ биохимических показателей крови больных ХГС F1 с ХГС F3 и ХГС F3 с ЦП (А) не выявил существенных различий по среднему уровню активности АЛТ, АСТ, ГГТП, ЩФ, соотношения АСТ/АЛТ, значений тимоловой пробы, билирубина, общего белка, альбумина и глобулинов, ПТИ, тромбоцитов. Сравнительная характеристика лабораторных показателей больных ХГС F1 и ХГС F3 представлена в таблице 3.

Таблица 3

Сравнительная характеристика лабораторных показателей больных ХГС F1 и ХГС F3.

р>0,05

У пациентов с ЦП (А) по сравнению с больными ХГС F1 выявлены существенно более высокие средние значения только по активности АСТ (161,2±28 и 69,4-±4,4 мкмоль/(мин.л) p<0,01), соотношения АСТ\АЛТ (1,2±0,2 и 0,6±0,03 p<0,01) и значениям тимоловой пробы (14,4±2,2 и 8,1±0,4 Ед p<0,01).

В тоже время у пациентов с ЦП (класс А) по сравнению с больными ХГС F3 и ХГС F1 достоверно ниже был средний показатель количества тромбоцитов в крови (126,2±20,1, 228,9±10,7 и 227,5±6,8 х10³/mm³ соответственно, p<0,01). Доля лиц с тромбоцитопенией значительно больше среди пациентов с ЦП (А) (63,6%), чем среди больных ХГС F1 (15,9%) и ХГС F3 (12%), p<0,01. Учитывая представленный сравнительный анализ клинических и лабораторных данных можно было сделано заключение, что по результатам клинико-лабораторного обследования не представляется возможным провести дифференциальный диагноз ХГС стадии фиброза F1 и F3.

Содержание гиалуроновой кислоты (ГК) и коллагена IV типа (CL - IV) в сыворотках крови больных ХГС F1, ХГС F3, ЦП, ОГС,ФЛ и здоровых лиц

В соответствии с рекомендациями фирмы - производителя референсным интервалом концентрации ГК в сыворотке крови считался диапазон от 0 до 100 нг/мл. Средний уровень ГК в сыворотке крови больных ОГС, пациентов контрольной группы и больных ФЛ, не превышал значений нормы (100 нг/мл) и не было выявлено различий в концентрация ГК среди больных ХГС F1 и ХГС F3.

Cредняя концентрация ГК в сыворотке больных ЦП (А) (249,2±40,9 нг/мл) была достоверно выше, чем у больных ОГС (53,9±19,9 нг/мл), ХГС F1 (21,9±2,8 нг/мл), ХГС F3 (40,7±13,4 нг/мл), пациентов с ФЛ (50,3±7,8) и здоровых лиц (22,9±3,4 нг/мл).

С прогрессированием ЦП от стадии А к стадии В концентрация ГК в сыворотке крови нарастала: при ЦП (В) (504,4±132,9 нг/мл) была достоверно выше, чем у пациентов с ЦП (А) (249,2±40,9 нг/мл, p<0,01); а при ЦП (С) (823,5±117,2 нг/мл, p<0,01) значительно выше, чем у пациентов с ЦП (В) (p<0,01).

В используемой в исследовании коммерческой тест-системе по определению в сыворотке крови коллагена IV типа (CL-IV) значения нормы рассчитываются по контрольной группе.

В соответствии с правилами такого расчета мы суммировали средний показатель по КГ и два средних квадратичных отклонения по КГ (99,6 + 2 х 20,7 =141). Таким образом, за норму были приняты значения CL-IV от 0 до 141 нг/мл.

Тест-система обладала наиболее высокими показателями чувствительности (68%) и специфичности (100%) при концентрации CL-IV более 141 нг/мл для диагностики фиброза 3 стадии, но для разграничения фиброза 3 стадии от фиброза 1 стадии оптимальными были концентрации CL-IV более 196 нг/мл (чувствительность метода составляла - 88%, специфичность - 58,7%).

Ни у одного больного ХГС F1 уровень CL-IV не превышал значений 196 нг/мл. У 32% (n-8) больных ХГС F3 концентрация CL-IV была выше 196 нг/мл , у остальных 68% (n-17) больных - ниже 196 нг/мл. Концентрация CL-IV более 280 нг/мл позволяла разграничить ЦП от фиброза 3 стадии со специфичностью 88% и чувствительностью теста 100%.

Средние концентрации CL-IV в сыворотках крови больных ОГС, ХГС F1, ХГС F3, ЦП (А), ФЛ и у здоровых лиц представлены на рисунке 1.

Рисунок 1. Средние концентрации CL-IV (нг/мл) в сыворотке крови больных ОГС, ХГС F1, ХГС F3, ЦП (А), ФЛ и у здоровых лиц.

Средний уровень CL - IV в сыворотке крови больных ФЛ не превышал значений нормальных показателей и достоверно не отличался по сравнению с контрольной группой (92,4±8,3 и 99,6±3,9 нг/мл соответственно, p>0,05). Средняя концентрация CL - IV у больных ХГС F3 была существенно выше, чем у больных ХГС F1 (201,3±27,7 и 116,9±2,4 нг/мл соответственно, p<0,01), а у пациентов с ЦП (А) достоверно больше, чем у больных ХГС F3 (471,5±73,4 и 201,3±27,7 нг/мл соответственно, p< 0,01).

Сравнительный анализ степени активности гепатита (ИГА) и концентрации CL-IV в сыворотке крови больных ХГС показал, что уровень CL-IV в сыворотке крови достоверно выше у пациентов с выраженной активностью гепатита (ИГА 13 -18 баллов) - 251,2±72,5 нг/мл, по сравнению с группами больных с умеренной активностью (ИГА 9 - 11 баллов) - 134,3±7,5 нг/мл (p<0,01) и слабовыраженной активностью (ИГА 4 - 8 баллов) -117+/-4,4 нг/мл (p<0,01). С прогрессированием ЦП отмечалось увеличение уровня CL-IV в сыворотке крови (ЦП (А) - 471,5±73,4; ЦП (В) - 684,2±108,8; ЦП (С) - 1369,8±354,5 нг/мл), но разница не достоверна.

При сравнении среднего уровня CL-IV у больных ОГС и ХГС с различными стадиями фиброза (F1 и F3) достоверных различий не выявлено (161,7±24,7 и 116,9±2,4; 201,3±27,7 нг/мл, соответственно, p>0,05). Однако, средняя концентрация CL-IV в сыворотке больных ОГС была достоверно ниже, чем у больных ЦП (А). Для определения степени изменения уровня CL-IV от острого периода гепатита С до стадии сформировавшегося ХГС оценивался его уровень у больных ОГС в первые 1-15 дней желтушного периода и через 6 - 16 месяцев после острой HCV инфекции. Средние концентрации CL- IV у больных ОГС в эти периоды заболевания достоверно не различались (161,7+/-24,7 и 143,8+/-17,2 нг/мл соответственно, p>0,05).

Содержание коллагена IV типа (CL - IV) и гиалуроновой кислоты (ГК) в сыворотке крови пациентов ХГС до начала лечения интерфероном и после его окончания

Среди больных хроническим гепатитом С выделена группа, получавшая монотерапию интерфероном после подписания информированного согласия об участии в клинических испытаниях. Критериями включения в исследование были: наличие репликативной фазы ХГС, повышение уровня АлАТ более 1,5 норм, выполнение ПБП и морфологическое исследование пунктата печени до включения в исследование (по критериям Ishak), отсутствие данных за цирроз печени, возраст от 18 до 69 лет, отсутствие лечения интерфероном в анамнезе, отсутствие аутоантител (АНФ) в сыворотке крови, нормальные показатели общего билирубина и мочевой кислоты до включения в исследование. Больные, включенные в исследование (41 человек), получали терапию альфа 2 интерфероном в стандартной дозе 3 млн МЕ 3 раза в неделю в течение 48 недель не зависимо от генотипа HCV.