Клинико-патогенетические особенности естественного течения вирусного гепатита C и оптимизация лабораторно-диагностических критериев исходов заболевания

Лечение продолжалось 48 недель при условии достижения РВО - отрицательного результата на наличие РНК HCV в крови на 12-й неделе лечения. Если РВО не был достигнут, больные выводились из исследования на 16-й неделе лечения. У всех пациентов, включенных в исследование, анализ сыворотки крови на содержание CL - IV и ГК проводился до включения в исследование и сразу после его отмены в том случае, если лечение проводилось 48 недель.

Если лечение длилось 16 недель, то определение маркеров фиброза проводилось через 6 месяцев после отмены лечения. ПБП проводилась не более, чем за 12 месяцев до начала лечения и в течение 3-х дней после отмены терапии если пациент получал лечение 48 недель. Пациентам, исключенным из исследования повторная биопсия печени не проводилась. В исследование было включено 10 женщин и 31 мужчина, 33 пациента (80,4%) были в возрасте до 30 лет. У 24-х человек из 41 (58,5%) получен устойчивый вирусологический ответ на лечение, у 17-ти (41,5%) - вирусологический ответ не достигнут. Группы пациентов с ответом на лечение и без достижения УВО не отличались по возрастному и половому составу, а так же по предположительной давности заболевания, большинство включенных в исследование употребляли психоактивные вещества внутривенно за 1-5 лет до включения в исследование.

В группе больных, не ответивших на лечение, 1 генотип был выявлен у 41,2% пациентов (7 из 17), в то время как абсолютное большинство больных, ответивших на лечение интерфероном, были инфицированы генотипом 3a (21 из 24) - 87,5%.

До начала лечения в группе больных ХГС с последующим достижением УВО фиброз 3 стадии по шкале Ishak регистрировался у 11 из 24 пациентов (45,8%), в группе, не ответивших на лечение, у 5 из 7 (29,4%), различия не достоверны (p> 0,05).

При анализе значений ГК и CL-IV до и после лечения в зависимости от достигнутого ответа на лечение интерфероном получены следующие данные: значения ГК не отличались от нормы у абсолютного большинства пациентов как до лечения, так и после, не превышали нормы в изучаемых группах и существенно не менялись в зависимости от ответа на лечение; значения CL-IV были повышены до лечения у 5 (20,8%) из 24 больных, ответивших на терапию, и у 4 (23,5%) из 17 пациентов без ответа на лечение, после отмены терапии доля лиц с повышенными значениями CL-IV в группе больных с УВО уменьшилась с 20,8% до в целом ышать норму и дшились у с достижением УВО (терапиюовень ыхые показатеияе генотипом 3ф________________________________8,3% (2 из 24); а в группе без УВО выросла с 23,6% до 41,2 % (7 из 17). Таким образом, доля больных с ухудшением показателей CL-IV после отмены терапии стала существенно большей в группе больных без достижения УВО по сравнению с группой больных с достижением УВО (41,2 %±12,3 и 8,3% ±5,6 соответственно, p<0,05)

В группе больных с достижением УВО средние значения CL-IV до начала терапии (127,6±6,8) и после нее (116,8±6,7) не различались и не превышали нормальные показатели.

Среднее значение CL-IV до начала терапии у больных без достижения УВО (125,9±1,48 нг/мл) так же не превышало нормальные показатели и не отличалось от такового до лечения в группе с достижением УВО (127,6±6,8 нг/мл), но после отмены терапии стало существенно более высоким, превышало нормальные значения, а так же было достоверно выше, чем в группе пациентов с достижением УВО после отмены лечения (146,7±1,2 и 116,8 ±6,7 нг/мл, соответственно), p<0,05.

Закономерности персистенции ВГС в лейкоцитах и плазме крови больных ХГС до и после лечения интерфероном

В исследование включено 104 пациента с наличием антител к HCV в крови, 58 мужчин и 46 женщин в возрасте от 15 до 72 лет. У 24 человек (23,0%) была диагностирована клинико-биохимическая ремиссия длительностью от 12 месяцев до 4-х лет (отсутствие жалоб, внепеченочных проявлений HCV инфекции и стойко нормальные показатели уровня активности АлАТ).

Пациенты этой группы никогда не получали терапию генноинженерными интерферонами (ИФН) и ремиссия у них носила спонтанный характер. У 80 человек (76,9%) наблюдался постоянно повышенный или волнообразный уровень активности АлАТ на протяжении 6 - 60 месяцев.

Среди всех РНК позитивных образцов сывороток крови (n= 99) в 76,6 % случаев выявлялся генотип 1b (76 человек), в 6,9 % - генотип 1а (7 человек), в 4,0 % - генотип 2а (4 человека), в 2,0% случаев - генотип 3а (2 человека). У 10 пациентов одновременно выявлялось несколько генотипов: 5 пациентов - генотип 1b+1а (5,0%), 3 пациента - генотип 1b+2а (3,0%), 2 пациента генотип 1b+3а (2,0%).

У больных с клинико-биохимической ремиссией генотип 1b был выявлен в 92,3 % случаев, у больных ХГС с гиперферментемией - в 86,3% случаев. В результате обследования 24 человек в фазе спонтанной клинико-биохимической ремиссии РНК HCV была выявлена в лейкоцитах у 11 (45,8%) пациентов, в плазме - у 13 (54,1%). При этом у 6 (25%) больных РНК HCV обнаружена только в лейкоцитах, у 8 (33,4%) - только в плазме, а у 5 (20,8%) - одновременно в плазме и лейкоцитах. В итоге РНК HCV выявлялась у 19 больных (79,2%) из 24. У пяти пациентов в фазе спонтанной клинико-биохимической ремиссии РНК HCV не выявлялась ни в плазме, ни в лейкоцитах (20,8%).

При обследовании 80 больных ХГС с наличием гиперферментемии РНК HCV в лейкоцитах была выявлена у 76 человек (95,3%), в плазме - у 69 (86,3%), только в лейкоцитах у 11 (13,7 %), только в плазме у 4 (5%), одновременно в плазме и лейкоцитах у 65 (81,3%). В целом РНК HCV выявлена у всех 80 пациентов (100%).

Таким образом, в группе пациентов со спонтанной клинико-биохимической ремиссией по сравнению с группой больных ХГС существенно реже выявляется РНК HCV как в плазме (13 из 24 - 54,1% ±10,4 и 69 из 80 86,3% ±3,8) , так и в лейкоцитах (11/24 - 45,8% ±10,4 и 76/80- 95,3% ±2,4,р 0,01), в то время как доля пациентов с персистенцией РНК HCV изолированно в лейкоцитах не отличается в той и другой группах.

Лечение препаратами рекомбинантного интерферона в дозе 3 млн. ЕД 3 раза в неделю проводилось 54-м пациентам с постоянно повышенным или волнообразным уровнем АлАТ в течение 6-ти месяцев. Через 6 месяцев лечения больные были обследованы на наличие РНК HCV в плазме и лейкоцитах.

Определение РНК HCV в плазме и лейкоцитах проведено 22 больным до лечения, и через 6 месяцев после отмены терапии. У 14 пациентов обследование проводилось до лечения, сразу после отмены терапии и через 6 месяцев после отмены лечения; 32 пациента были обследованы непосредственно после отмены терапии.

Среди пациентов, получавших терапию, у 46 (85,2%) был выявлен первый генотип HCV. Из 54 пациентов, получавших лечение, 24 (44,4%) оказались резистентны к проводимой терапии, т.е. у данной группы больных не происходило снижения или нормализации активности АлАТ и исчезновения РНК HCV в сыворотке крови на фоне лечения в течение 6 месяцев. У 30 больных ХГС (55,6%) на фоне лечения произошла биохимическая ремиссия - нормализация уровня АлАТ и в дальнейшем нормальные показатели аминотрансфераз сохранялись в течение 4 - 6 месяцев. Из 14 человек, обследованных до, после отмены лечения и через 6 месяцев после отмены терпи, у 12 на фоне лечения ИФН была отмечена биохимическая ремиссия.

У всех 12 (100%) РНК HCV выявлялась в лейкоцитах до лечения и у 4 (33,3 %) - после лечения. У 11 (91,6 %) РНК HCV выявлялась в плазме до лечения и у 4 (33,3%) после лечения. У 3 (25,0%) больных после лечения РНК HCV выявлялась как в плазме, так и в лейкоцитах. Всего РНК HCV была выявлена у 5 (41,6 %) из 12 пациентов на фоне нормальных показателей АлАТ после лечения ИФН и выявлялась достоверно реже, чем до лечения (41,6%±14,9 - 5/12 и 100% - 12/12 соответственно - р 0,01). Из 30 больных ХГС с развитием биохимической ремиссии на фоне терапии (обследованных до и после лечения), РНК HCV выявлена у 12 (40%) из 30 пациентов. У 10 (33,3%) пациентов РНК HCV обнаружена в плазме и у 6 (20%) в лейкоцитах. У двух пациентов РНК HCV выявлялась только в лейкоцитах (6,6%).

После окончания периода наблюдения наличие УВО регистрировалось только у 15 пациентов из 54-х (27,7%) . У 9 пациентов из 15 достигших УВО (60%), до лечения определялся 1-й генотип HCV и, таким образом, только у 9 из 46 больных с первым генотипом HCV был достигнут УВО (19,5%).

Анализ частоты выявления РНК HCV изолированно в лейкоцитах среди больных с нормальными показателями АлАТ показал, что РНК HCV выявлялась только в лейкоцитах в 25% (6/24) случаев у пациентов со спонтанной клинико-биохимической ремиссией и только в 6,6% (2/30) случаев у больных с ремиссией после лечения, данные различия достоверны (р 0,01). Важно отметить, что по частоте выявления РНК HCV в плазме среди обсуждаемых групп различий не выявлено. Таким образом, среди больных со спонтанной ремиссией достоверно чаще выявляется персистенция HCV в лейкоцитах по сравнению с больными ХГС с ремиссией после лечения.

Анализ частоты выявления РНК HCV в различных субстратах крови в группе больных, резистентных к лечению интерфероном, показал наличие виремии у 100% больных через 6 месяцев лечения. У 17 (70,8%) из 24 пациентов без биохимической ремиссии на фоне терапии РНК HCV была обнаружена в лейкоцитах и у 24 (100%) в плазме.

При сравнительном анализе частоты выявления РНК HCV в различных субстратах крови у больных с биохимической ремиссией после лечения ИФН и в группе пациентов без биохимической ремиссии, обнаружены существенные различия по частоте выявления РНК HCV в лейкоцитах (без учета выявления в плазме) - 6/30 - 20%±7,3 и 17/24 - 70,8% ±9,5 соответственно (р 0,01), в плазме (без учета лейкоцитов) 10/30 -33,3%±8,6 и 24/24- 100% соответственно (р 0,01), а так же суммарно в плазме и лейкоцитах 12/30- 40% ±8,9 и 24/24 -100% соответственно (р 0,01).

В начале исследования среди больных ХГС (n=80), не получавших лечение интерфероном, РНК HCV была выявлена изолированно в лейкоцитах у 13,7% пациентов (11 из 80), а в целом у 95,3% больных (76 из 80). В группе больных ХГС (n=54), получивших противовирусную терапию, через 6 месяцев интерферонотерапии РНК HCV была выявлена в лейкоцитах у 42,6% пациентов (23 из 54), причем изолированно в лейкоцитах у 3,7% пациентов (2 из 54). Выявленные различия в группах достоверны в отношении выявления РНК HCV в лейкоцитах в целом (р 0,01) и в отношении выявления РНК HCV изолированно в лейкоцитах (р 0,05). Частота выявления РНК HCV в лейкоцитах крови у больных ХГС не получавших лечение интерфероном, и больных ХГС, получивших лечение интерфероном в течение 6 месяцев, представлена в таблице 4.

Таким образом, лечение интерфероном существенно уменьшает долю больных ХГС с персистенцией в лейкоцитах крови. С другой стороны, сам факт персистенции РНК HCV в лейкоцитах крови не препятствовал развитию биохимической ремиссии у 55,6% пациентов (30/54) из группы больных, получавших лечение.

Изолированная персистенция в лейкоцитах регистрировалась только у 6,6% (2/30) больных в этой группе. При этом, в группе больных, резистентных к интерферону (n=24), вообще не регистрировалась изолированная персистенция РНК HCV в лейкоцитах крови после лечения.

Таблица 4

Частота выявления РНК HCV в лейкоцитах крови у больных ХГС, не получавших лечение интерфероном, и больных ХГС, получивших лечение интерфероном в течение 6 месяцев и обследованных после окончания лечения.

Локализация РНК ВГС	Больные ХГС не получавшие лечение n=80	Больные ХГС получившие лечение интерфероном в течение 6 месяцев и обследованные после окончания лечения n=54
РНК HCV в лейкоцитах	76/80 95,3%*	23/54 42,6%*
РНК HCV только в лейкоцитах крови	11/80 13,7%**	2/54 3,7%**

*- * (р 0,01) , **- ** (р 0,05)

Факт выявления персистенции РНК HCV в лейкоцитах у абсолютного большинства больных ХГС (95,3%) не позволяет считать наличие РНК HCV в лейкоцитах фактором, влияющим на резистентность к лечению интерфероном. Факт изолированной персистенции РНК HCV в лейкоцитах регистрируется только у 13,7% больных ХГС и не регистрируется у больных ХГС без биохимической ремиссии на фоне лечения, что так же не позволяет считать изолированную персистенцию РНК ВГС в лейкоцитах фактором резистентности к лечению ИФН.

Клиническое значение выявления аутоиммунных антител SLA, LKM-1, LSP, SMA, LC-1, LKM, ANA и AMA в сыворотке крови больных ХГС с предполагаемым аутоиммунным компонентом и резистентных к интерферонотерапии

Было обследовано 26 больных ХГС (12 женщин и 14 мужчин) в возрасте от 24 до 60 лет (средний возраст 38,8+/-7,8 лет) в динамике заболевания.

Группа из 26 пациентов была выделена из 104 больных ХГС с подтвержденной вирусемией, наблюдавшихся в течение 4-5 лет по следующим критериям: наличие непостоянных, но повторяющихся жалоб на миалгии или артралгии в отсутствии лечения или на фоне лечения интерфероном; повышенное значение ревматоидного фактора в крови даже однократно в период наблюдения, до начала лечения интерфероном.

Указанные критерии позволяли предположить, с одной стороны, наличие аутоиммунного компонента на фоне ХГС и, с другой стороны, усугубление степени выраженности аутоиммунного компонента на фоне лечения интерфероном и развитие резистентности к лечению.

Исследовалось от 2-х до 9-ти образцов крови от каждого пациента (всего 86 образцов от 26 больных). 17 больных не получали лечение и они обследованы с интервалами в 1-2 года, 9 больных получали лечение интерфероном в дозе 3 млн ЕД 3 раза в неделю в течение 6-12 месяцев.

Группа из 9 больных, получавших лечение была представлена семью пациентами, инфицированными субтипом 1b HCV, резистентными к терапии интерфероном (без УВО и биохимической ремиссии) и двумя пациентами, инфицированными субтипом 1b HCV с достижением УВО и биохимической ремиссии. Анти- LC1 и анти- LKM не регистрировались в крови ни у одного больного ХГС как до, так и после лечения интерфероном.

В образцах сывороток крови, полученных до начала лечения интерфероном, чаще всего регистрировались ANA (в 18 образцах от 8-ми пациентов), при этом приблизительно с одинаковой частотой в образцах с повышенным и нормальным уровнем АЛТ (31,3% и 20%, p>0,05) . На фоне лечения интерфероном ANA выявлялись только у 1 больного из 7 (1 из 14 исследованных образцов - 7,1%).

Необходимо отметить, что во всех 19 образцах положительных на наличие ANA, определялись минимальные значения положительной реакции (8 sp). После завершения лечения интерфероном ANA не выявлялись в крови ни у одного из обследованных пациентов.

Остальные виды аутоиммунных антител регистрировались в крови больных ХГС с частотой от 1,2% до 20% и также на уровне минимальных положительных значений.

В целом, аутоантитела выявлялись у 14 (53,8%) из 26 больных ХГС с предполагаемым аутоиммунным компонентом, при этом только у 4х пациентов (15,4%) выявлялись 2 вида аутоиммунных антител. Только в 4-х из 17 образцов сывороток крови выявлялись одновременно два вида аутоиммунных антител.

У 2-х из 7-ми пациентов, резистентных к лечению интерфероном, выявлялись аутоиммунные антитела (SMA или ANA в минимальных значениях), при этом только в одном случае на фоне лечения интерфероном (1 из 14 образцов на фоне лечения).

Клиническое значение изменчивости NS5A региона HCV (ISDR) у больных ХГС, инфицированных генотипом 1b и устойчивых к лечению генноинженерным интерфероном

Из 19 больных ХГС, инфицированных генотипом 1b, была выделена группа из 16 человек, у которых на фоне лечения интерфероном в дозе 3 млн ЕД три раза в неделю в течение 6 месяцев не было получено как биохимического, так и вирусологического ответа.

У трех (15,8%) пациентов из 19 был достигнут биохимический и вирусологический ответ на терапию через 24 недели лечения, они продолжили терапию интерфероном и, впоследствии, у них был зафиксирован УВО через 48 недель после отмены терапии.

Группа больных, резистентных к лечению интерфероном была представлена пациентами в возрасте от 26 лет до 61 года, 10 мужчин и 6 женщин.

У шести пациентов была точно известна давность заболевания, так как они перенесли острый гепатит С за 6 - 48 месяцев до начала лечения.

У девяти пациентов давность заболевания можно было предполагать, так как у них в анамнезе было переливание крови за 12 - 72 месяца до начала терапии.

У шести пациентов была выполнена ПБП и диагностирован фиброз первой стадии по Knodell.

У остальных 7 пациентов клинико-лабораторная картина, давность заболевания и результаты УЗИ печени позволяли исключить наличие цирроза печени.

У всех пациентов до начала лечения уровень АлАТ превышал нормальный в 2 и более раза (от 86 до 314 мкмоль.мин/л), и, в среднем, составлял 193,0+/-20,9 мкмоль./мин.л до лечения и 156,9 +/-18,5 мкмоль.мин/л после лечения.

Регистрируемый уровень вирусной нагрузки находился в диапазоне от 52.000 до 1.799.270 копий/мл и достоверно не различался до и после отмены терапии (737.356 ± 230.058,6 и 751.487,6 ±185.286,1 соответственно, p>0,05).

У 4-х из 16 пациентов резистентных к лечению интерфероном (25%), не было выявлено изменений аминокислотных последовательностей в регионе ISDR.

Данный регион генома HCV генотипа 1b у этих больных соответствовал последовательностям нуклеотидов, кодирующих соответствующие аминокислоты, как было описано в 1990г N.Kato в отношении изолята HCV-J, впоследствии охарактеризованного N.Enomoto (1996), как “дикий” вариант.

У 10-ти из 16 пациентов (62,5%) были выявлены изменения аминокислотных последовательностей только в одной из следующих позиций: 2248, 2218, 2219, 2227 или 2244.

У двух пациентов (12,5%) были выявлены замены аминокислотных последовательностей в двух и более позициях: 2218 и 2227; 2218 и инсерции 4ак и 2ак в позиции 2237.

Таким образом, у 12 из 16 пациентов (75%) были выявлены замены аминокислотных последовательностей в 1-3 позициях. Результаты выявления мутационной изменчивости региона ISDR у 19-ти пациентов исследуемой группы представлены на рисунке 2.

Рисунок 2. Варианты мутационной изменчивости региона ISDR у 19-ти больных ХГС

Анализ нуклеотидной последовательности фрагмента NS5А региона генома HCV (ISDR) проводился как до лечения, так и по его окончании, и в группе пациентов, резистентных к интерферону, в геноме HCV не было выявлено новых замен аминокислотных последовательностей после окончания лечения.

Среди трех пациентов, достигших УВО в результате терапии интерфероном, у двух (66,6%)- пациенты N 17, 18 (рис.2), были инфицированы вариантом HCV, идентичным изоляту HCV-J.

У одной из трех пациенток (33,3%) достигших УВО после курса интерферонотерапии (пациенткаN19), выявлена замена в позиции 2218 до лечения (замена гистидина на аргинин) и затем в позиции 2219 после лечения (замена гистидина на аргинин), в то время как позиция 2218 стала соответствовать “дикому” варианту HCV-J.

Распространение и клиническое значение рекомбинантого варианта ВГС у больных ХГС московского региона

В исследование было включено 63 пациента с диагнозом ХГС, не получавших противовирусную терапию, 48 мужчин и 15 женщин, в возрасте от 19 лет до 63-х лет (ср.28,52 ± 9,65 лет), наблюдавшихся в КГО ИКБ1 г. Москвы в 2002-2005гг.

В сыворотках пациентов, включенных в исследование, выделялась РНК HCV и, затем проводилось генотипирование с использованием в качестве праймеров зондов, типоспецифических для 1 генотипа информация о которых расположена в 5'UTR и Core регионах.

На втором этапе исследования образцы РНК HCV из сывороток крови всех 63 пациентов, полученные до начала терапии, были подвергнуты филогенетическому анализу после проведения прямого секвенирования регионов NS5B, 5'UTR и core генома HCV.

Лечение (монотерапия стандартным альфа 2а интерфероном в дозе 3 млн ЕД подкожно 3 раза в неделю) получали 49 человек.

В группе из 63 пациентов было установлено следующее распределение генотипов: у 19 выявлен генотип 1 субтип 1b (30,2%), у 1-го генотип 2 субтип 2а (1,6%), у 43 -х 3-й генотип субтип 3а (65,0%).

Два образца РНК HCV от двух пациентов (2 из 63-3,1%) после проведения филогенетического анализа идентифицированы как рекомбинантные (2k/1b) и полностью соответствовали выявленному ранее в популяции Санкт-Петербурга рекомбинантному субтипу RF1_2k/1b.

Среди 49 пациентов, получивших лечение, генотипы распредилились таким образом: у 10 пациентов выявлялся генотип 1, субтип 1b, у 36 пациентов генотип 3, субтип 3а и у 1 больного генотип 2, субтип 2а, у 2-х пациентов выявлен рекомбинантный вариант РНК HCV.

В группе больных, получавших лечение и с наличием РВО, доля рекомбинантного варианта составила 3,7% (1/27), а в группе с отсутствием РВО - 4,5% (1/22) - p>0,05.

Необходимо отметить, что из 63 пациентов, включенных в исследование, только 2 человека были эпидемиологически связаны друг с другом (муж и жена), и именно они были инфицированы рекомбинантным вариантом HCV.

Данные результаты позволяют констатировать возможность передачи половым путем рекомбинантного субтипа RF1_2k/1b.

Из 2-х пациентов, инфицированных рекомбинантным вариантом HCV, у одного пациента регистрировалась резистентность к лечению монотерапией интерфероном и отсутствие в дальнейшем вирусологического ответа на комбинированную терапию интерфероном и рибавирином в течение 3-х месяцев, в то время, как во втором случае, получен УВО в ответ на монотерапию интерфероном в течение года.

Сравнительная характеристика показателей иммунного статуса у пациентов с различными вариантами течения ХГС, ОГС с различными исходами заболевания и реконвалесцентов ОГС с длительностью наблюдения 3-10 лет

У больных с различными вариантами течения ХГС, реконвалесцентов ВГС с длительностью наблюдения 3-10 лет и больных ОГС было определено процентное содержание и абсолютное количество 9 показателей иммунного статуса: CD3+, CD4+, CD4/8, CD8+, CD16+, CD20+, HLA DR+CD3+, CD95+, 0-лимфоциты. При анализе процентного содержания в крови 9 исследуемых параметров иммунного статуса у больных ХГС ППАТ, ХГС ПНАТ, реконвалесцентов ВГС с длительностью наблюдения 3-10 лет и больных ОГС статистически достоверных различий с контрольной группой не выявлено.

Не выявлено статистически достоверных различий и по содержанию абсолютного количества В-лимфоцитов, NK и средних показателей иммунорегуляторного индекса у больных ХГС ППАТ, ХГС ПНАТ, реконвалесцентов ВГС с длительностью наблюдения 3-10 лет, больных ОГС при сравнении с группой контроля.

При анализе средних показателей абсолютного количества CD95+-лимфоцитов, статистически достоверные различия с контрольной группой (164±41) были выявлены только у больных ОГС с различными исходами и только на 12 месяце от начала заболевания: ОГС с предполагаемой реконвалесценцией 272±16, ОГС с последующей хронизацией 332±63 (p<0,05).

Содержание абсолютного количества популяции CD3+Т-лимфоцитов, которая отражает общий уровень Т-лимфоцитов периферической крови, было достоверно выше, чем в контрольной группе (949±117), у пациентов с ХГС ППАТ с давностью заболевания 3-10 лет (1428±117, p<0,01); у больных ОГС с предполагаемой реконвалесценцией в первые 10 дней желтушного периода (1585±250, p<0,01), на 3 и 12 месяцах от начала заболевания (1322±113, p<0,05, 1472±187, p<0,05, соответственно); у больных ОГС с последующим развитием хронического гепатита в первые 10 дней желтушного периода (1441±127, p<0,01), на 3 месяце (1314±111, p<0,05), 6 и 12 месяцах от начала заболевания (1276±113, 1575±159, p<0,01).

Анализ средних показателей абсолютного количества CD4+Т-лимфоцитов (Т-хелперов) в изучаемых группах выявил статистически достоверные различия с контрольной группой (563±70): у больных ОГС с последующей реконвалесценцией в первые 10 дней желтушного периода (880±123, p<0,05), на 3-м (799±108, p<0,01) и 12-м месяцах от начала заболевания (873±137, p<0,05); у больных ОГС с последующим развитием хронического гепатита в первые 10 дней желтушного периода, на 3, 6 и 12 месяцах от начала заболевания (905±104, 840±66, 837±77, 1001±105, p<0,01); у пациентов с ХГС с длительностью наблюдения 3-10 лет (849±75, p<0,01).

Достоверные различия по сравнению с контрольной группой (368±64) в абсолютном количестве CD8+Т-лимфоцитов, оказывающих цитотоксическое и супрессорное действие, а также играющих ведущую роль в противовирусном иммунитете, были выявлены только у больных ХГС с повышенным уровнем АлАТ с давностью заболевания 3-10 лет (567±53, р<0,05). Средние значения абсолютного количества О-лимфоцитов, обладающих низкой функциональной активностью, было достоверно выше по сравнению с группой контроля (135±25) у больных ХГС с длительностью наблюдения 3-10 лет (231±41, p<0,05); у больных ОГС с последующим развитием хронического гепатита в первые 10 дней желтушного периода (244±34, p<0,01), на 3 и 6 месяцах от начала заболевания (230±33, 237±43, соответственно p<0,05), что говорит о повышенном содержании лимфоцитов с низкой функциональной активностью у больных с формирующимся хроническим гепатитом и у больных с уже сформировавшимся хроническим гепатитом С (ХГС ППАТ).

Средние значения абсолютного количества активированных Т-лимфоцитов (HLA-DR+CD3+) было достоверно выше, чем в группе контроля (35±14) у пациентов с ХГС ППАТ и ХГС ПНАТ (155±33, 95±14, соответственно, р<0,01), у реконвалесцентов ВГС с длительностью наблюдения 3-10 лет (98±15, p<0,01); у больных ОГС с последующей реконвалесценцией в первые 10 дней желтушного периода (187±69, p<0,05) и на 3 месяце от начала заболевания (100±22, p<0,01); у больных ОГС с последующим развитием хронического гепатита в первые 10 дней желтушного периода (104±15, p<0,01), на 3 (104±14, p<0,01) и 12 месяцах от начала заболевания (85±20, p<0,05).

Таким образом, при комплексном анализе показателей иммунного статуса было выявлено, что абсолютные количества CD3+-, CD4+-, HLA-DR+CD3+-субпопуляций Т-лимфоцитов были повышены как у больных ХГС ППАТ с длительностью наблюдения 3-10 лет, так и в двух подгруппах ОГС. У больных ХГС ППАТ, кроме вышеуказанных показателей, были достоверно выше абсолютные количества CD8+-субпопуляции Т-лимфоцитов.

Наиболее важным результатом при анализе иммунного статуса у пациентов изучаемых групп является факт регистрации отличий группы ХГС ППАТ от группы ХГС ПНАТ. Группа ХГС ПНАТ отличается от группы ХГС ППАТ и ОГС по спектру выявленных различий в показателях иммунного статуса и не отличается от реконвалесцентов ВГС с давностью заболевания 3-10 лет. У больных ХГС ПНАТ и реконвалесцентов ВГС с длительностью наблюдения более 3 лет выявлены достоверные отличия от контрольной группы только по одному показателю - HLA-DR, что может свидетельствовать об успешном иммунном контроле над инфекцией вирусом гепатита С у данной категории пациентов. В отличие от ХГС ПНАТ, в группе больных ХГС ППАТ выявлены достоверные отличия от контрольной группы абсолютных значений CD3+-лимфоцитов, CD4+-Т-хелперов, CD8+лимфоцитов и 0-лимфоцитов.

Клиническое значение специфического гуморального ответа у больных ХГС и ОГС

Специфический гуморальный ответ изучался с использованием лабораторных данных от больных ОГС и ХГС (ХГС ППАТ и ХГС ПНАТ). На первом этапе работы был проведен сравнительный анализ спектра антител класса IgG к синтетическим пептидам структурных и неструктурных белков HCV у больных различными вариантами ХГС и у больных ОГС в течение первых 6-ти месяцев от начала заболевания и проанализирована диагностическая и прогностическая значимость выявленных различий между группами без учета исходов ОГС.

Группа пациентов с острым гепатитом С была представлена 136-ю больными: 101 мужчина (74,26 %) и 35 женщин (25,74 %) в возрасте от 15 до 60 лет (ср. 22,51 +/-0,66 лет), группа ХГС ППАТ - 20-ю больными: 18 мужчин (90%) и 2 женщины (10%) в возрасте от 17 до 72 лет (ср. 32,05+/-3,36 лет), группа ХГС ПНАТ составляла 23 пациента: 8 мужчин (32%) и 15 женщин (68%) в возрасте от 19 до 67 лет (ср. 38,04+/-2,76 лет).

Сравнительные результаты по выявлению анти-core, анти-NS4, анти-NS5А у больных ХГС ППАТ, ХГС ПНАТ и ОГС показали, что в сыворотках крови пациентов с ХГС ППАТ в подавляющем большинстве случаев, выявляются антитела ко всем изучаемым антигенам HCV одновременно: анти-core, анти-NS4 и анти-NS5А и данный спектр выявляется достоверно чаще, чем у больных ХГС ПНАТ (85% ± и 39,1%± , p<0,01) и ОГС в первые 10 дней желтушного периода (85% ±и 32,4%±, p<0,01).

На втором этапе исследования был проведен сравнительный анализ спектра антител класса IgG к генноинженерным белкам HCV и синтетическим пептидам, моделирущим иммунодоминантные эпитопы структурных и неструктурных белков HCV у больных ОГС с учетом исхода заболевания и реконвалесцентов ВГС со сроком наблюдения 3-10 лет.

Группа больных ОГС включала 18 мужчин (60%) и 12 женщин (40%) в возрасте от 16 до 60 лет (ср. 28±5,3лет), группа реконвалесцентов ВГС с длительностью наблюдения 3-10 лет - 12 человек - 5 (41,6%) мужчин и 7 (58,4%) женщин в возрасте от 23 до 64 лет (ср 36,6+/-4,3 лет).

В результате проведенного сравнительного исследования гуморального ответа у больных ОГС с различными исходами и реконвалесцентов ВГС с длительностью наблюдения 3-10 лет на структурные (анти-core, антитела к пептидам core) и не структурные белки (анти-NS3 и антитела к пептидам белка NS3, анти-NS4, анти NS5А) получены следующие данные: единственным маркером гуморального ответа на антигены ВГС связанным с реконвалесценцией является отсутствие анти-NS5А в сыворотке крови пациентов. Среди изученных 29 параметров гуморального ответа на различные антигены HCV только реактивность на белок NS5А можно считать прогностическим маркером исхода ОГС.

Реактивность на белок NS5А (анти-NS5А IgG) у реконвалесцентов ОГС не регистрируется в 1-3-6 месяц от начала заболевания и выявляется только у 25% больных на 12-м месяце заболевания, в то время как у больных ОГС с последующей хронизацией реактивность на NS5А выявлялась на уровне 29% -77% -71% - 83% в течение 1-3-6-12 месяцев соответственно (p<0,05).

Достоверных различий в частоте регистрации анти-NS5А IgG реконвалесцентов ВГС со сроком наблюдения 3-10 лет и больных ОГС с различными исходами не выявлено, однако частота регистрации анти-NS5 у реконвалесцентов ВГС со сроком наблюдения 3-10 лет не превышает 50%, в то время как у больных ОГС с исходом в ХГС составляет 83%.

Сравнительная характеристика динамики появления и частоты выявления антител класса IgG к белку NS5А у больных ОГС с различными исходами в сравнении с частотой регистрации анти-NS5 у реконвалесцентов ВГС со сроком наблюдения 3-10 лет представлена на рисунке 3.



*-** - достоверные различия между группами ОГС с различными исходами.

Рисунок 3. Частота выявления антител класса IgG к белку NS5А у больных ОГС с различными исходами заболевания в течении 12 месяцев наблюдения и у реконвалесцентов ВГС со сроком наблюдения 3-10 лет.

Корреляционный анализ показал, что на 3-ем и 6-ом месяцах от начала заболевания наличие РНК ВГС в крови коррелирует только с присутствием анти-NS5А (R=0,75) и не коррелирует с наличием анти-NS4 и анти-NS3.

Результаты сравнительного анализа гуморального ответа на антигены HCV в группах реконвалесцентов ВГС (с наличием и отсутствием анти-NS5А) представлен на рисунке 4.

Сравнительный анализ гуморального ответа в группах реконвалесцентов с наличием и отсутствием анти-NS5А в крови показал, что у реконвалесцентов ВГС с наличием анти-NS5А в крови достоверно чаще выявляются антитела на большинство белков и пептидов HCV по сравнению с пациентами, негативными по наличию анти-NS5А в крови.

Исключение составляют только белки и пептиды core, а так же 1, 2, 4, 5 и 11 пулы белка NS3.

Таким образом, у реконвалесцентов ВГС позитивных по наличию анти-NS5А в крови сохраняется выраженный гуморальный ответ, как на структурные, так и неструктурные белки ВГС, а гуморальный ответ на белки оболочки ВГС регистрируется исключительно у анти-NS5 позитивных пациентов.

Рисунок 4. Частота выявляемых антител на структурные и неструктурные белки и пептиды HCV в группах реконвалесцентов ВГС со сроком наблюдения 3-10 лет в зависимости от наличия анти-NS5А в крови.

ВЫВОДЫ

1. В результате изучении характера поражения печени у больных с репликативной формой ХГС при различной степени биохимической активности не выявлено достоверных различий по частоте регистрации фиброза печени стадии 2-3 по METAVIR среди больных ХГС ПНАТ и больных ХГС ППАТ.

2. В результате изучения частоты регистрации выраженного фиброза печени (по критериям Knodell) у больных, систематически употребляющих алкоголь установлено, что фиброз печени 3-4 стадии выявляется достоверно чаще среди больных, злоупотребляющих алкоголем, (38% и 12%, соответственно, p=0,004), однако, у большинства больных ХГС с наличием фиброза печени 3-4 стадии (72%) хронический гепатит С является единственной причиной формирования выраженного фиброза печени.

3. При изучении характера поражения печени у больных с репликативной формой ХГС в зависимости от давности и биохимической активности заболевания установлено, что среди больных ХГС с давностью заболевания 1-5 лет в 17,9% случаев регистрируется быстрое формирование фиброза печени 3-й стадии по критериям Knodell, в то время как в группе ХГС ПНАТ среди пациентов с известной давностью заболевания (1-5 года и 6-10 лет) не выявлено больных с быстрым формированием фиброза печени 3-й стадии.

4. Оценка биоптата печени по шкале METAVIR позволяет дополнительно выявить долю пациентов с выраженной стадией фиброза - F2 в 7,8% случаев, расхождения между двумя критериями (Knodell и METAVIR) в оценке выраженной стадии фиброза печени регистрируются в 3,1% случаев.

5. При определении роли маркеров фиброза - гиалуроновой кислоты и коллагена IV типа в диагностике различных стадий фиброза печени получены данные о существенно более высокой средней концентрации коллагена IV типа в крови у больных ХГС с наличием стадии фиброза печени 3 (критерии Knodell), по сравнению больными ХГС с наличием стадии фиброза печени 1 (201,3±27,7 и 117,0±2,4 нг/мл, соответственно, p<0,01).

6. Средние значения концентрации коллагена IV типа после курса интерферонотерапии достоверно различаются в группах больных с различным вирусологическим ответом на лечение и выше в группе с отсутствием вирусологического ответа (146,7±1,2 и 116,8±6,7 нг/мл, соответственно, p<0,05). Доля больных ХГС с нарастанием концентрации коллагена IV типа в крови и превышением нормального уровня после проведенного курса интерферонотерапии существенно выше в группе пациентов без достижения вирусологического ответа по сравнению с группой больных достигших вирусологического ответа на лечение (41,2 % и 8,3%, соответственно, p<0,05). Показатели концентрации гиалуроновой кислоты не превышали нормы в группах больных с различными стадиями фиброза печени и существенно не менялись в зависимости от ответа на лечение.

7. При оценке диагностического и прогностического значения аутоантител (ANA, SMA, AMA, анти-LKM-1, анти- LC-1, анти- LSP) в крови больных ХГС, получающих интерферонотерапию, не получено данных за наличие выраженного аутоиммунного компонента и преобладания какого-либо одного варианта аутоантител в группе больных ХГС, полностью резистентных к лечению интерфероном. Анти-LC-1 и анти-LKM не регистрировались в крови ни у одного больного ХГС как до, так и после лечения интерфероном.

8. При определении клинического значения персистенции вируса гепатита С в лейкоцитах крови больных ХГС, получивших курс интерферонотерапии, получены данные о существенно более редкой регистрации как одновременной персистенции РНК ВГС в лейкоцитах крови и плазме, так и исключительно в лейкоцитах (42,6% и 3,7%, соответственно, р0,01) по сравнению с группой больных, не получавших противовирусную терапию (95,3% и 13,7%, соответственно, р0,05). В группе больных без достижения биохимической ремиссии и с сохраняющейся виремией на фоне лечения не выявлено изолированной персистенции РНК ВГС в лейкоцитах, в то время, как у больных с развитием биохимической ремиссии на фоне лечения, изолированная персистенция РНК ВГС в лейкоцитах регистрируется в 6,6% случаев.

9. При определении вариантов генетической изменчивости ISDR региона гена NS5А 1b генотипа у больных ХГС московского региона, полностью резистентных к интерферонотерапии установлено, что геном вируса гепатита С в 25% не имеет мутаций в ISDR регионе и в 75% случаев представляет собой “промежуточный” тип мутационной изменчивости (1-3 аминокислотные замены).

10. При анализе частоты выявления рекомбинантного интергенотипического варианта РНК ВГС (субтип RF1_2k/1b) среди больных ХГС московского региона установлено, что рекомбинантный геном HCV выявлен у 3,1% пациентов. В группе с наличием РВО на фоне лечения интерфероном доля рекомбинантного варианта составила 3,7%, в группе с отсутствием РВО - 4,5% (p>0,05), что не позволяет считать инфицирование рекомбинантным вариантом RF1_2k/1b фактором резистентности к интерферонотерапии.

11. При анализе исходов гепатита С в сопоставлении с показателями неспецифического иммунного ответа пациента выявлен сходный иммунный профиль групп больных ХГС ПНАТ и реконвалесцентов ВГС с длительностью наблюдения более 3 лет: данные группы пациентов отличаются от контрольной группы только по одному показателю - абсолютному значению маркера активации лимфоцитов (HLA-DR+). Группа больных ХГС ППАТ достоверно отличается от контрольной группы по абсолютному значению содержания в крови CD3+, CD4+, CD8+ Т-лимфоцитов, HLA-DR+ и 0-лимфоцитов.

12. При анализе исходов гепатита С в сопоставлении с показателями специфического гуморального ответа пациента установлено, что в группе больных ХГС с постоянно нормальным уровнем АлАТ достоверно реже регистрируется полный спектр антител к антигенам структурных и не структурных белков (core , NS4 и NS5) в сыворотке крови по сравнению с группой больных ХГС с постоянно повышенным уровнем АлАТ (85% и 39,1%, соответственно, р0,01).

13. При исследовании особенностей специфического гуморального иммунного ответа пациента при естественном течении гепатита С с учетом исхода заболевания выявлено, что наличие РНК ВГС в крови на 3-ем и 6-ом месяцах от начала заболевания у больных ОГС коррелирует c единственным показателем гуморального ответа - присутствием анти-NS5А IgG. Реактивность на белок NS5А (анти-NS5А IgG) не регистрируется в первые 6 месяцев от начала заболевания только у больных ОГС с последующей реконвалесценцией.

14. При детальном анализе специфического гуморального иммунного ответа реконвалесцентов ВГС со сроком наблюдения > 3 лет показано, что данная группа неоднородна. У реконвалесцентов ВГС, позитивных по наличию анти-NS5А, достоверно чаще в крови регистрируется гуморальный ответ на неструктурные белки ВГС, а гуморальный ответ на белки оболочки ВГС регистрируется исключительно у анти-NS5 позитивных пациентов. Полученные данные о различной реактивности на белок NS5А у больных ОГС с различными исходами, корреляции РНК ВГС с наличием анти-NS5А IgG и выявленные различия в спектре антител у реконвалесцентов со стажем в зависимости от присутствия анти-NS5А IgG в крови позволяют рассматривать анти-NS5А IgG, как маркер персистирующей инфекции вирусом гепатита С.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Role of HGV infection in the etiology of acute none A-E hepatitis. ./ T.L.Yashina, M.O.Favorov, Y.E.Khydyakov, O.O. Znoiko, and ets. // IX Triennial international symposium on viral hepatitis and liver disease - Rome 1996. - Abstract 202 .p.254

2. Климова Е.А., Знойко О.О. Гепатит С // В кн.: «Лекции по инфекционным болезням».- М., 1996.- С.153-161

3. Dynamic study of antibodies to immunodominant region of NS4 HCV protein / Znoiko O.O., Ogienko O.L., Kruglov I.V. and ets. // Abstracts of Fifth International conference « AIDS, cancer and related problems.» - St.Petersburg May 25-30 1997 - c.66

4. Клинико-биохимическая картина острого и хронического гепатита С и ее связь с наличием антител к различным антигенным детерминантам вируса гепатита С / О.О. Знойко, О.Л.Огиенко, И.В.Круглов и др. // Гепатит В,С,D,G -проблемы изучения, диагностики, лечения и профилактики. Тезисы докладов II-й Российской научнопрактической конференции с международным участием, 14-16 октября 1997г. - стр.81

5. .Роль полимеразной цепной реакции в диагностике клинического варианта и оценке эффек-тивности лечения у больных с хроническим гепатитом С Гепатит В,С,D,G -проблемы изучения, диагностики, лечения и профилактики / А.Е.Гущин, О.О. Знойко. И.П.Горбарец и др. // Тезисы докладов II-й Российской научно-практической конференции с международным участием 14-16 октября 1997г. - стр.60

6. Диагностическая значимость метода ПЦР при обследовании больных с HCV-инфекцией / Н.Д.Ющук, О.О.Знойко, Е.А.Климова и др. // Материалы II Всероссийской научно-практической конференции «Полимеразная цепная реакция в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний». - Москва, 1998.- С.71-78.

7. .Эпидемиологическая характеристика HCV- инфекции у медработников / О.Л.Огиенко, О.О.Знойко, Е.А.Климова и др. // Проблемы неотложной хирургии (сборник научных работ). К 90-летию со дня рождения академика .И.Стручкова - Том VI - Москва. 1998 - Стр.155-156

8. Спектр антител к антигенным детерминантам HCV у больных гепатитом С / Н.Д.Ющук, О.О. Знойко, О.Л.Огиенко, и др. // Российский журнал Гастроэнтерологии, Гепатологии, Колонопроктологии - Том VIII, N 5 - 1998. - с.35-39

9. Выявление полиморфизма геномной РНК вируса гепатита С / Е.Н.Ильина, А.Е.Гущин, В.М.Говорун, Е.А.Климова, О.О.Знойко и др. // Тезисы докладов Пятого Российского съезда врачей инфекционистов.- Москва, 1998.- С.128

10. Спектр выявляемых аутоиммунных антител у больных с хроническим гепатитом С. / О.О.Знойко, О.О.Огиенко, Г.Н.Кареткина, и др. // Тезисы докладов V всероссийского съезда врачей-инфекционистов - Москва 1998г. - с.114-115

11. Биохимическая картина желтушной формы ОГС у больных с различным спектром серологических маркеров и результатов ПЦР-анализа. / Н.Д.Ющук, О.Л.Огиенко, О.О.Знойко, и др. // Тезисы докладов V всероссийского съезда врачей-инфекционистов - Москва 1998 - с.158

12. Знойко О.О. Вирусные гепатиты. / Методические рекомендации «Инфекционные болезни» часть 5. Тестовый контроль по темам методического пособия «Инфекционные болезни» (части 1-4) Под редакцией Н.Д.Ющука, Н.Н.Островского, Ю.Я.Венгерова ВУНМЦ МЗ РФ - Москва1998г - Утверждено МЗ РФ - с.71-76

13. Ющук Н.Д. Знойко О.О. Новое в диагностике и лечении вирусных гепатитов // Врачебная газета № 2 ноябрь 1999г, - С. 24-25

14. Современные аспекты изучения вирусных гепатитов / Н.Д .Ющук., О.О.Знойко, Е.А.Климова, Г.Н.Кареткина // Сборник научных трудов к 70-летию со дня рождения академика В.И. Покровского «Патогенетические основы лечения острых инфекционных заболеваний».- Москва, 1999.- С.265-274

15. Частота встречаемости антител к антигенам белков core, NS4, NS5 вируса гепатита С в сыворотках крови больных острым гепатитом С в первые 10 дней желтушного периода. / О.Л.Огиенко, И.В.Круглов, О.О.Знойко, и др. // Гепатит В, С, Д, - проблемы диагностики, лечения и профилактики Тезисы докладов III Российской научно-практической конференции с международным участием. 22-24 июня, Москва, 1999 - с.174

16. Характер морфологических изменений в печени у больных с HCV-инфекцией в зависимости от уровня активности АЛТ / Н.Д.Ющук, О.О.Знойко, Е.А.Климова и др. // Тезисы докладов симпозиума «Человек и лекарство».-1999.- С.264

17. Персистенция HCV в плазме и лейкоцитах больных с хронической HCV-инфекцией до и после лечения / Н.Д.Ющук, О.О.Знойко, Е.А.Климова и др. // Тезисы докладов III Российской научно-практической конференции с международным участием «Гепатит В, С, и Д - проблемы диагностики, лечения и профилактики».- Москва, 1999.-С.260

18. Оценка генетической гетерогенности РНК вируса гепатита С. Возможность прогнозирования течения заболевания. / Е.Н.Ильина, А.Е.Гущин, В.М.Говорун, О.О.Знойко и др. // Тезисы докладов III Российской научно-практической конференции с международным участием «Гепатит В, С, и Д - проблемы диагностики, лечения и профилактики».- Москва, 1999.-С.88-89

19. Выявление геномной РНК вируса гепатита С в сыворотке, лимфоцитах и печени больных гепатитом С / Е.Н Лакина, Е.Н.Самохвалов, О.Г.Левченко, О.В.Мосалова, Е.А.Климова, О.О.Знойко и др. // Тезисы докладов III Российской научно-практической конференции с международным участием «Гепатит В, С, и Д - проблемы диагностики, лечения и профилактики».- Москва, 1999.-С.125

20. Новый подход в генотипировании вируса гепатита С / Е.И.Ильина, А.Г.Гущин, В.М.Говорун, О.О. Знойко и др. // Эпидемиология и инфекционные болезни.-1999. - №5.- С.23-26

21. Климова Е.А., Знойко О.О., Гепатит С / Лекции по инфекционным болезням.- М., 1999. Т.2.- С.30-38

22. Клиника, диагностика, лечение и диспансеризация вирусных гепатитов у взрослых и детей: Методическое пособие- приложение к Приказу КЗ г.Москвы от 06.07.2000г №283 / Н.П.Блохина, Н.А.Малышев, С.Г.Чешик, Н.Д.Ющук, О.О.Знойко и др.//Москва, 2000.-44 с.

23. Выявление позитивных (геномных) и негативных (репликативных) цепей РНК вируса гепатита С в сыворотке крови, лимфоцитах и ткани печени больных хроническим гепатитом С с помощью полимеразной цепной реакции / Е.И.Лакина, Е.И.Самохвалов, О.Г.Левченко, О.В. Масалова, Е.А.Климова, О.О.Знойко и др. // Вопросы вирусологии.- 2000.-N4.- С.37-41

24. Знойко О.О., Климова Е.А., Предварительные результаты 2 фазы испытаний Максамина™(гистамина дигидрохлорида) в комбинации с Интроном-A® (интерфероном -2b) при лечении хронического гепатита С. Анализ 48 недель лечения //Тезисы докладов научно-практической конференции «Гепатит С (Российский консенсус)».- Москва, 2000.- С.64-66

25. Клиническое значение выявления РНК вируса гепатита С в различных субстратах у больных хроническим гепатитом С / Н.Д.Ющук, Е.А.Климова, О.Г.Пылева, О.О. Знойко и др. // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колонопроктологии.-2001.-Т.XI. №1.- Приложение №12.- Материалы Шестой Российской конференции «Гепатология сегодня».- Москва, 2001.- С.21.

26. Серологическое исследование эпитопов белка NS5 вируса гепатита С и их значение для клиники и диагностики./ И.В.Круглов, О.О.Знойко, М.П.Финогенова и др. // Вопросы вирусологии. N1 2000 стр. 14 - 17

27. Закономерности персистенции HCV в плазме и лейкоцитах при хронической HCV-инфекции / Ющук Н.Д., Знойко О.О., Климова Е.А.и др. // Российский журнал Гастроэнтерологии, Гепатологии, Колонопроктологии N 4, 2000г., с. 59-64.

28. Вирусные гепатиты. Клиника, диагностика, лечение: Методические рекомендации / Н.Д. Ющук, Н.П.Блохина, О.О. Знойко и др.// Москва: ВУНМЦ МЗ РФ, 2000г, 44 стр.

29. Histological Status in Asymptomatic Сhronic HCV Infection”/ N.D.Yushuk, I.V.Maev, О.О.Znoiko and et al.. // Gut; Vol. 49 (suppl III ); November 2001; Abstracts of 9-th United Europian Gastroenterology Week 6-10 October 2001, Amsterdam., abstract no. 1263

30. Значение современных лабораторных методов в диагностике острых вирусных гепатитов / Ющук. Н.Д., Гаджикулиева М.М, Знойко О.О. и др. // Тезисы докладов IV Российской научно-практической конференции «Гепатит В, С и D - проблемы диагностики, лечения и профилактики».- Москва, 2001.- С. 407-408

31. Значение выявления РНК вируса гепатита С в различных субстратах у больных хроническим гепатитом С / Н.Д. Ющук, Е.А. Климова, О.О. Знойко и др. // Клиническая медицина.- 2001.- №12.- С.67-71

32. Пункционная биопсия печени и возможности неинвазивного мониторинга фиброза при хроническом вирусном гепатите С / Н.Д.Ющук, О.О. Знойко, Н.Х.Сафиуллина, и др. // Клинические перспективы гастроэнтерологии, гепатологии. N1, 2002, с.9-16

33. Спектр антител к различным антигенам HCV при разных вариантах течения хронической HCV- инфекции./ И.В. Круглов, О.О. Знойко, О.Л.Огиенко и др.// Вопросы вирусологии N2, 2002г, стр.11-16

34. Диагностическая значимость определения антител к различным антигенам вируса гепатита С у пациентов с острой и хронической HCV-инфекцией / Н.Д.Ющук, О.Л. Огиенко, И.В.Круглов, О.О. Знойко и др. // Терапевтический архив, 2002, N 4, стр.18-22

35. Проблемы ранней диагностики острых вирусных гепатитов, актуальные для стационаров хирургического профиля / К.Р. Дудина, О.О. Знойко, И.В Круглов и др. // Неотложная помощь в клинических условиях» (Сборник аучных работ), том IX. Под редакцией Э.В. Луцевича и Г.Н. Проскурникова. Издательство УПЦ «Талант» - 2002, МЗ РФ, МЗ МО, с.138-140

36. Etiological Structure of Viral Hepatitis in Moscow / Znoyko O.O., Michailov M.I., Dudina K.R , Kruglov I.V, Widell A, Isaguliants M. // Final Programme and Book of Abstracts IEA World Congress of Epidemiology in Montreal, Canada, August 18-21, 2002, Supplement to the International Journal of Epidemiology International Epidemiological Association . WP10

37. Возможности лабораторной диагностики острого гепатита С. / К.Р. Дудина, О.О. Знойко, И.Г Мальков, и др. // Материалы VI-го Российского съезда инфекционистов, 29-31 октября 2003г, стр.117

38. Сравнительная характеристика биохимических и морфологических показателей у больных ХГС с постоянно нормальной и волнообразной активностью трансаминаз / О.О. Знойко, Н.Д.Ющук, Е.А.Климова и др. // Тезисы докладов V Российской научно-практической конференции «Гепатит В, С и D - проблемы диагностики, лечения и профилактики».- Москва, 2003.- С.112

39. Исследование сероконверсии к различным антигенам вируса гепатита С у больных гепатитом С с различными исходами / И.В. Круглов, О.Л.Огиенко, О.О. Знойко и др. // Вопросы вирусологии N2, 2003г, стр.36-40

40. Выявление РНК вируса гепатита С методом ОТ-ПЦР в острую и хроническую фазу инфекции./ Знойко О.О., Дудина К.Р., Мальков и др. // Гепатология, приложение к журналу «Экспериментальная и клиническая гастротерология». 2003г. №2. -С.16-19

41. Клинические особенности дельта гепатита у ВИЧ- инфицированных./ С.Л. Максимов, А.В. Кравченко, О.О. Знойко и др. // Эпидемиология и инфекционные болезни, N 2, 2003 стр.26-29

42. Znoiko O.O., Yuschuk N D., Invasive and Non-invasive Monitoring of Hepatitis C Virus-Induced Liver Fibrosis: Alternatives or Complements. // Current Pharmaceutical Biotechnology, 2003 ,4, p.195-209

43. Выявление типоспецифических анти-HCNS4-антител у больных гепатитом С методом иммуноферментного анализа / И.В. Круглов, О.О. Знойко, Е.А.Климова и др. // Вопросы вирусологии , N 3, 2003, с.32-36