Клинико-патогенетические аспекты герпесвирусных инфекций у детей первых месяцев жизни

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

Клинико-патогенетические аспекты герпесвирусных инфекций у детей первых месяцев жизни

14.00.09 - педиатрия

14.00.36 - аллергология и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Кравченко Лариса Вахтанговна

Ростов-на-Дону

2009

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Ростовский научно-исследовательский институт акушерства и педиатрии Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи»

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор Афонин Александр Алексеевич

доктор медицинских наук, профессор Сизякина Людмила Петровна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Дегтярев Дмитрий Николаевич

доктор медицинских наук, профессор Летифов Гаджи Муталибович

доктор медицинских наук, Никогосова Ольга Викторовна

Ведущая организация:

Научный центр здоровья детей РАМН.

Защита состоится «_____» ___________________ 2009 г. в _______ часов на заседании диссертационного совета Д208.082.05 при ГОУ ВПО Ростовском государственном медицинском университете (344022, г. Ростов-на-Дону, пер. Нахичеванский, 29).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Ростовского государственного медицинского университета.

Автореферат разослан «_____» _________________2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доцент В.А. Шовкун

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Герпесвирусные инфекции являются одной из актуальных проблем педиатрии, так как они занимают ведущее место в причине мертворождаемости, преждевременных родов, младенческой смертности, заболеваемости новорожденных и ранней инвалидизации (Гриноу А., Осборн Д., Сазерленд Ш., 2000; Володин Н.Н (ред.), 2002; Шарапова О.В., Корсунский А.А., 2003; Шабалов Н.П. и соавт., 2005; Ковальчук Л.В. и соавт., 2006; Черняковский О.Б. и соавт., 2009). Это обусловлено убиквитарным распространением герпесвирусов, многообразием вызываемых заболеваний, часто принимающих хроническое течение (Зуев В.А., 1988; Ганковская Л.В., Ковальчук Л.В., Бахарева И.В., 2007; Кулаков В.И., Барашнев Ю.И., 2007; Сучков С.В. и соавт., 2007; Pallier С. et al., 2002; Mace M. et al., 2004; Pusztai R. et.al., 2004; Picone O. et al., 2005). Внутриутробная инфекция развивается у 27-36,6% детей, рожденных живыми у матерей группы высокого инфекционного риска, обусловливая от 11% до 45% перинатальных потерь, достигая по данным разных авторов 65,6% (Царегородцев А.Д, Рюмина И.И., 2001; Цхай В.Б. и соавт., 2002; Подзолкова Н.М. и соавт., 2003; Орджоникидзе Н.В., и соавт., 2005; Макаров О.В. и соавт., 2008; Черняховский О.Б. и соавт., 2009; Griffits P.D., 2002; Whitley R, 2004). Частота ранней неонатальной заболеваемости и смертности при внутриутробном инфицировании колеблется от 5,3 до 27,4%, а мертворождаемость составляет 16,8% (Сенчук А.Я, Дубоссарская З.М., 2005; Бусуек Г.П. и соавт., 2006). По данным В.И. Кулакова (2003) среди детей, заболевших в ранний неонатальный период, инфекционные заболевания выявляются у 50 - 60%, а у 37,5% умерших новорожденных инфекционная патология явилась основной причиной смерти. Сложной задачей остается выявление конкретной этиопатогенетической причины заболевания, несмотря на широкий арсенал современных методов диагностики, включающих полимеразную цепную реакцию, серодиагностику (Aurelius E. et al., 1993; Damato E.J. , et al., 2002; Flowler K.B. et al., 2003). Многие авторы указывают на то, что в ряде случаев клиническая диагностика герпесвирусной инфекции в настоящее время является чрезвычайно трудной из-за неспецифичности и полиморфности симптоматики, что приводит к позднему назначению патогенетической терапии (Гриноу А. и соавт., 2000; Дегтярева М.В., 2001; Володин Н.Н., 2004; Шабалов Н.П., 2004; Воронцова Ю.И. и соавт., 2004; Сенчук А.Я., Дубоссарская З.М., 2005; О.В. Макарова, 2006; Бочарова И.И. и соавт., 2007; Carillo J. et al., 1999; Greatsas G. et al., 1999; Levition A., Paneth N., 1999; Corey R., Flynn J., 2000; Dwyer R., 2002). В настоящее время доказано, что отрицательный результат обследования крови и мочи методом ПЦР, полученный в первые дни жизни, не исключает возможности отсроченной реализации внутриутробной инфекции (Воронцова Ю.Н. и соавт., 2004; Федорова Н.Е. и соавт., 2005). Диагностическая ценность лабораторных методов, основанных на оценке гуморального иммунитета (антитела к герпесвирусу IgM и IgG) в период ранней неонатальной адаптации, связана с особенностями антителогенеза (недостаточная выработка IgM и трансплацентарное происхождение IgG) и является низкой (Володин Н.Н и др., 2001; Кулаков В.И., Барашнев Ю.И., 2007). Это свидетельствует о том, что не существует ни одного метода обследования, обладающего в реальных клинических условиях 100% чувствительностью и специфичностью. Согласно исследованиям Н.Н. Володина, Д.Н. Дегтярева (2003), B.T. Rouse (2001); E.B. Staros (2005) любая интерпретация результатов лабораторного исследования должна проводиться с обязательным учетом анамнестических и клинических данных. Имеются веские основания подозревать герпесвирусную инфекцию на основании учета перинатальных факторов (генитальный герпес у матери, возможные иммуносупрессивные воздействия), весомых клинических данных (TORCH - синдром при наличии различной степени выраженности повреждения ЦНС), данных НСГ. В этих случаях, учитывая, что выявление вирусспецифического антигена - наиболее надежного и достоверного метода диагностики - не всегда возможно из-за трудностей детекции антигена, целесообразно изучать вспомогательные методы диагностики для дифференцированного подхода к назначению энергичной противовирусной терапии, не дожидаясь вирусологических исследований (Володин Н.Н., Дегтярев Д.Н. (ред.), 1998; Кудашов Н.Н., 2005) . Для решения этих вопросов в настоящее время многие исследователи занимаются изучением функционального состояния системы интерферона при герпесвирусной инфекции у новорожденных и детей первых месяцев жизни со сниженным противовирусным иммунитетом (Ершов Ф.И. и соавт., 2005; Исаков В.А. и соавт., 2006; Железникова Г.Ф., 2008). Приоритетным направлением является разработка новых технологий ранней диагностики нарушений функциональной, метаболической, иммунологической адаптации новорожденных (Алиев А.Ф., 2002; Володин Н.Н. и соавт. 2000; Карпухин Е.В., Валлиуллина С.А., 2002; Цхай В.Б. и соавт., 2002; Фризе К., Кахель В., 2003; Баранов А.А. и соавт., 2006; Дегтярев Д.Н., 2006; Рабсон А., и соавт., 2006; Царегородцев А.Д. и соавт., 2006; Козлова Л.И., 2006; Баранов А.А., Альбицкий В.Ю., 2007; Бочарова И.И., и соавт., 2007; Володин Н.Н и др., 2007; Ганковская Л.В. и соавт., 2007; Железникова Г.Ф., 2008; Орджоникидзе Н.В., Ушницкая Е.К., 2008; Alford C. et al., 1999; Faumont N. et al., 2001; Edelmann K.H., Wilson C.B., 2001). Не менее важной проблемой является выбор тактики терапии, минимизация этиотропной и иммунокорригирующей терапии в неонатальном периоде.

Таким образом, несмотря на то, что проблема герпесвирусных инфекций у новорожденных и детей первых месяцев жизни является предметом изучения многих исследователей, однозначного решения этой проблемы нет. Большое значение приобретает дальнейшее изучение патогенетических механизмов формирования герпесвирусной инфекции для выбора оптимального метода диагностики, прогноза хронического течения заболевания и возможных осложнений у детей первых месяцев жизни с позиций оценки у них способности к полноценной межклеточной кооперации и зависимости первичного противовирусного иммунного ответа от взаимодействия костимуляторных молекул, изучение роли ИФН -б, ИФН -г в иммунной защите (Макаров О.В. и др., 2006; Железникова Г.Ф., 2008; Carillo J. et al., 1999; Greatsas G. et al., 1999; Levition A., Paneth N., 1999; Corey R., Flynn J., 2000; Macher C. et al., 2001; Dwyer R., 2002). Вышеизложенное открывает перспективу для решения проблемы ранней диагностики и оптимизации лечения этой грозной патологии у детей первых месяцев жизни.

Цель работы: Разработка ранних критериев диагностики, прогноза течения и возникновения осложнений герпесвирусной инфекции (ЦМВИ, герпеса 1-2 типа, Эпштейна-Барр вирусной инфекции) у детей первых месяцев жизни для своевременного назначения комплексной этиопатогенетической терапии.

Основные задачи исследования

1. Выявить особенности преморбидного фона и клинического течения герпесвирусных инфекций у детей первого года жизни с учетом тяжести, стадии патологического процесса и клинической формы заболевания.

2. Изучить процессы активации, костимуляции и апоптоза иммунокомпетентных клеток, у детей первых месяцев жизни с герпесвирусной инфекцией в зависимости от этиологии заболевания и стадии патологического процесса.

3. Оценить особенности цитокинового статуса у детей первых месяцев жизни с герпесвирусной инфекцией в зависимости от этиологии заболевания и стадии патологического процесса.

4. Изучить содержание молекул активации, апоптоза, костимуляции и интерферонового статуса с целью прогноза генерализации патологического процесса, хронического течения заболевания и развития осложнений к концу первого года жизни у детей с ЦМВИ.

5. Разработать критерии доклинической диагностики и прогноза манифестации инфекционного процесса у новорожденных, родившихся у матерей с хроническими гинекологическими заболеваниями.

6. Оптимизировать комплексную этиопатогенетическую терапию при герпесвирусной инфекции у детей первого года жизни.

Научная новизна работы

В настоящей работе впервые:

- проведено клинико-иммунологическое исследование в аспекте изучения процессов активации, костимуляции, пролиферации и апоптоза иммунокомпетентных клеток, а также ИФН -б, ИФН -г у детей первых месяцев жизни с герпесвирусной инфекцией, позволившее установить новые закономерности формирования клинических форм заболевания, развития осложнений и оптимизировать тактику лечебных мероприятий;

- выявлены особенности динамики уровней ИФН-б, ИФН-г в сыворотке крови больных с учетом типа возбудителя и стадии патологического процесса: на начальных этапах развития герпесвирусной инфекции у детей с ЦМВИ и Эпштейна-Барр вирусной инфекции имеет место повышение уровня ИФН - б, при ЦМВИ и инфекции, вызванной вирусом простого герпеса, имеет место снижение выработки ИФН - г, являющееся одной из причин тяжелого течения заболевания. Дальнейшее снижение уровня ИФН - г, свидетельствует о сохраняющихся нарушениях в системе интерферона, что диктует необходимость проведения повторных курсов иммунокорригирующей терапии;

- определены критерии доклинической диагностики и прогноза манифестации инфекционного процесса у новорожденных, родившихся у матерей с хроническими гинекологическими заболеваниями, по уровню провоспалительных (ИЛ-2, ИФН -б ИФН -г, ФНО -б), противовоспалительных (ИЛ-4) цитокинов и Т-лимфоцитов с рецепторами CD69, CD71, CD95 (патент на изобретение № 2237900 от 10.10. 2004; патент на изобретение № 23117550 от 20.02.2008);

- установлены наиболее информативные критерии форм тяжести заболевания при ЦМВИ, основанные на совокупной оценке клинических симптомов и иммунных нарушений, проявляющихся дефектами процессов костимуляции, осуществляемых через молекулу CD20+CD40+, готовности лимфоцитов к апоптозу (CD95) и нарушением выработки ИФН - б и ИФН - г (патент на изобретение № 2341797от 20. 12. 2008);

- дано клинико-патогенетическое обоснование выделения клинических и иммунологических критериев хронизации инфекционного процесса при ЦМВИ, связанных с нарушением механизмов активации и костимуляции иммунокомпетентных клеток в виде снижения уровней содержания относительного числа клеток с маркерами CD3+, CD28+, CD71+, CD95+ и увеличения клеток с маркерами CD20+ , CD40+, CD69+;

- установлена тесная взаимосвязь между сохранением изменений со стороны ЦНС в течение первого года жизни и нарушениями в клеточном звене иммунной системы, касающаяся Т-лимфоцитов с рецепторами CD69+, CD71+, CD95+, CD28+;

- оптимизирована комплексная этиопатогенетическая терапия герпесвирусной инфекции у детей первого года жизни с учетом динамики изменения иммунных маркеров.

Практическая значимость

На основании результатов исследования преморбидного фона, клинических показателей и иммунного статуса

- определены клинические, специфические (ИФА и ПЦР) и иммунологические критерии диагностики герпесвирусной инфекции в зависимости от этиологии заболевания и тяжести патологического процесса;

- разработаны наиболее информативные критерии прогноза формы тя -

жести заболевания, основанные на оценке клинических симптомов, методов специфической диагностики (ИФА и ПЦР), показателей специфического иммунного ответа, включающего оценку активации, пролиферации, костимуляции и апоптоза иммунокомпетентных клеток, а также уровня интерферонов б и г;

- разработан диагностический алгоритм прогноза хронического течения ЦМВИ, основанный на комплексной оценке состояния преморбидного фона, клинических проявлений заболевания, изменений иммунного статуса, что позволяет осуществлять своевременное комплексное лечение заболевания.

Положения, выносимые на защиту

1. Клиническая картина герпесвирусной инфекции детей первого года жизни проявляется полиорганным характером поражения, включая нервную, бронхолегочную, сердечно-сосудистую, гепато-билиарную, пищеварительную системы, и зависит от состояния преморбидного фона (хронические воспалительные гинекологические заболевания, осложнения беременности у матерей, перинатальное поражение ЦНС, низкая оценка по шкале Апгар), а также глубины и характера иммунологических нарушений.

2. Для диагностики форм тяжести и вариантов течения герпесвирусной инфекции у детей раннего возраста необходим комплекс методов, включающих оценку преморбидного фона, клиническое обследование, изучение специфического противовирусного ответа в реакции ИФА, детекцию ДНК вируса методом ПЦР и изучение иммунного статуса. Изменения в иммунном статусе, отражающие нарастание готовности лимфоцитов к апоптозу и изменение костимулирующего сигнала, влияющего на пролиферацию, дифференцировку и переключение классов В-лимфоцитов, являются одним из значимых механизмов, определяющих формирование различных форм тяжести и вариантов течения заболевания при герпесвирусной инфекции у детей первых месяцев жизни.

3. Доклиническая диагностика инфекционного процесса у новорожденных основана на выявлении нарушений интерферонового статуса и усилении выработки провоспалительных цитокинов. К предрасполагающим факторам реализации воспалительного процесса относится такая группа риска как хронические воспалительные гинекологические заболевания у матерей.

4. Предложенная программа комплексного лечения способствует исчезновению клинических симптомов, восстановлению иммунологических сдвигов у большинства больных.

Апробация работы

Основные положения работы представлены: на научно-практической конференции «Антибактериальные стратегии в акушерстве, гинекологии и педиатрии» (Ростов-на-Дону, 2001), 4-ом съезде Российской ассоциации специалистов перинатальной медицины (Москва, 2002), I Всероссийском конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» (Москва, 2002), II Российском конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» (Москва, 2003), VIII конгрессе педиатров России «Современные проблемы профилактической педиатрии» (Москва, 2003), научно-практической конференции педиатров Юга России «Актуальные вопросы педиатрии» (Ростов-на-Дону, 2003), научно-практической конференции «Современные проблемы педиатрии» (Ростов-на-Дону, 2003), научно-практической конференции «Современные проблемы педиатрии» (Ростов-на-Дону, 2004), X конгрессе педиатров России (Москва, 2005), Российской научной конференции «Педиатрия: из XIX в XXI век» (Санкт-Петербург, 2005), научно-практической конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии у детей» (Ростов-на-Дону, 2006); на X Конгрессе педиатров России (Москва, 2006), I междисциплинарном конгрессе «Ребенок и лекарство» (Санкт-Петербург, 2006), II Ежегодном конгрессе специалистов перинатальной медицины «Новые технологии в перинатологии» (Москва, 2007), 2-ой Российской конференции «Иммунология репродукции: теоретические и клинические аспекты» (Сочи, 2007), I Международном Семинаре «Инфекция в акушерстве и перинатологии» (Москва, 2007), I Балтийском Конгрессе по детской неврологии (Санкт-Петербург, 2007), XI Конгрессе педиатров России «Актуальные проблемы педиатрии» (Москва, 2007), XII Конгрессе педиатров России «Актуальные проблемы педиатрии» (Москва, 2008 года).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 32 работы, из них в изданиях, рекомендованных Перечнем ВАК МО и науки РФ - 9 статей, получено 3 патента на изобретения: «Способ прогнозирования нарушений адаптаций у новорожденных от матерей с хроническими воспалительными гинекологическими заболеваниями» № 2237900 10 октября 2004; «Способ прогнозирования генерализованной формы герпесвирусной инфекции у детей первых месяцев жизни» № 2341797 от 20. 12. 2008; «Способ ранней диагностики цитомегаловирусной инфекции у новорожденных» № 2317550 от 20.02.2008; 1 медицинская технология (№ ФС - 2005/115- Москва, 2006).

Внедрение в практику здравоохранения

герпесвирусный инфекция диагностика новорожденный

Полученные данные внедрены в работу отделения патологии новорожденных и родильного отделения ФГУ «Ростовского НИИ акушерства и педиатрии Росмедтехнологий», используются при проведении семинаров с учебными ординаторами и в лекциях на тематических семинарах для врачей-педиатров и неонатологов Южного федерального округа.

Структура диссертации

Диссертация изложена в традиционной форме. Состоит из введения, обзора литературы, глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы и приложения. Работа представлена на 346 страницах машинописного текста, иллюстрирована 75 таблицами и 51 рисунками. Библиографический указатель включает 476 работ, из них 273 отечественных и 203 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ

Общая характеристика материалов и методов исследования

Проведено проспективное, рандомизированное, открытое, сравнительное исследование 245 новорожденных и детей первых месяцев жизни. Основную группу (221 ребенок) составили дети с герпесвирусной инфекцией, находившиеся на лечении в отделении патологии новорожденных и детском реабилитационном отделении ФГУ «Ростовского научно-исследовательского института акушерства и педиатрии Росмедтехнологий» (директор - д.м.н., проф., Заслуженный деятель науки РФ В.И. Орлов) в 2000 - 2008 г.г. Исследование состояло из двух этапов. Задачами первого этапа были развернутое клинико-лабораторное обследование пациентов с целью верификации герпесвирусной инфекции; установление роли процессов активации, костимуляции и апоптоза иммунокомпетентных клеток в патогенезе данной инфекции в зависимости от этиологии заболевания. В задачи второго этапа исследования входила разработка прогноза течения и возможных осложнений на примере цитомегаловирусной инфекции как наиболее часто встречающейся инфекции.

Проведена оценка эффективности комплексной терапии герпесвирусной инфекции, включающей этиотропную терапию (ацикловир), иммунозаместительную (иммуновенин) и иммуномодулирующую (ликопид) терапию. Программа иммунологического обследования включала определение ДНК вирусов методом полимеразной цепной реакции, специфических антител классов IgG и IgM к герпесвирусам в сыворотке крови у детей и их матерей, по показаниям - в спинномозговой жидкости; определение про- и противовоспалительных цитокинов, а также показателей клеточного и гуморального иммунитета в сыворотке крови в динамике заболевания.

Клинический осмотр детей осуществляли на первом месяце и в дальнейшем в 3, 6, 9 и 12 месяцев жизни. Всем наблюдавшимся детям в эти сроки проводили исследования ИФА крови, ПЦР мочи и крови на герпесвирусы, УЗИ головного мозга, УЗИ печени и почек, эхокардиографическое исследование. Наряду с клиническим осмотром, проводили иммунологическое обследование пациентов, включающее определение абсолютного и относительного количества лейкоцитов, лимфоцитов, субпопуляций Т и В-лимфоцитов, пула IgM, A, G. Общее количество лимфоцитов подсчитывали в лейкоцитарной формуле стандартным методом. Цитокиновый статус определялся на первом месяце, а в дальнейшем в 3 и 6 месяцев жизни.

В 3 месяца (через 6- 8 недель после первого курса терапии) с целью контроля эффективности лечения и изменений в иммунологическом статусе проводилось повторное иммунологическое обследование.

С учетом этиологии герпесвирусной инфекции все дети были разделены на четыре группы: в зависимости от тяжести состояния (согласно классификации К.В. Орехова, 2002) дети с ЦМВИ были разделены на две группы: 1.1 - ЦМВИ типичная генерализованная форма (тяжелая) - 67 человек (30,3 %); 1.2 - ЦМВИ типичная генерализованная форма с неполной клинической симптоматикой (среднетяжелая) - 80 человек (36,2 %).

- вторую группу (2) составили дети с инфекцией, вызванной вирусом простого герпеса 1 и 2 типа - 35 человек (15,8 %);

- третью группу (3) составили дети с Эпштейна-Барр вирусной инфекцией - 39 человек (17,7 %);

контрольная группа (03) включала 24 условно-здоровых ребенка обоего пола в возрасте до одного месяца без герпесвирусной инфекции.

Течение цитомегаловирусной инфекции у детей имеет свои отличительные особенности. По течению, согласно классификации Л.Н. Гусевой (2003), все дети с цитомегаловирусной инфекцией (147 чел.) были распределены на следующие группы: острое течение заболевания (клинические проявления и обнаружение ДНК цитомегаловируса методом ПЦР в крови или в моче в течение 3-х месяцев) отмечалось у 78 (53,1 %) детей, затяжное течение (клинические проявления и обнаружение ДНК цитомегаловируса методом ПЦР в крови или в моче до 6 месяцев) - у 39 (26,5 %) детей, хроническое течение (клинические проявления и обнаружение ДНК цитомегаловируса методом ПЦР в крови или в моче более 6 месяцев) - у 30 (20,4 %) пациентов.

Для выявления вирусов герпеса 1 и 2 типов, вируса цитомегалии, вируса Эпштейна-Барр, использовали метод полимеразной цепной реакции. В качестве материала для исследования у пациентов служили периферическая кровь и моча. Обнаружение вышеперечисленных возбудителей методом ПЦР проводилось с использованием наборов реагентов производства «Ампли Сенс» (ЦНИИ Эпидемиологии г. Москва) и оборудования, включающего многоканальный амплификатор ДНК «Терций» (производство ДНК-Технология г. Москва) с компьютером и программным обеспечением. Определение специфических антител классов IgG и IgM в сыворотке крови к вирусам простого герпеса 1, 2, 6 типов, цитомегаловирусу, проводилось иммуноферментным методом с использованием стандартных наборов реактивов фирмы «Вектор-Бест», г. Новосибирск. Определение антител класса IgM к капсидному антигену и IgG к ядерному антигену (EBNA) вируса Эпштейна - Барр в сыворотке крови проводилось иммуноферментным методом с использованием стандартных наборов реактивов фирмы “BCM DIAGNOSTIC” (LLC USA). Определение антител класса IgG и IgM в ликворе к герпесвирусам проводилось иммуноферментным методом с использованием стандартных наборов реактивов фирмы “EUROIMMUN” (Deutschland).

Диагностика герпесвирусной инфекции основывалась на комплексной оценке клинической картины заболевания и результатах лабораторных исследований. Диагноз герпесвирусной инфекции ставился при выявлении ДНК вирусов (вирусы простого герпеса 1 и 2 типов, цитомегаловирус, вирус Эпштейна-Барр) в крови и в моче и нарастании титров специфических IgG антител в сыворотке крови в динамике, при наличии специфических IgM в сыворотке крови у ребенка, либо при выявлении специфических IgG и/или IgM специфических антител в цереброспинальной жидкости. Уровень интерлейкинов - 2 и 4 (ИЛ - 2 и ИЛ - 4) в сыворотке крови определяли с помощью набора реагентов для твердофазного иммуноферментного анализа ProCon IL-2, ProCon IL-4, (ООО «Протеиновый контур» г. Санкт-Петербург). Экспрессию мембранных маркеров иммунокомпетентных клеток периферической крови определяли на проточном лазерном цитофлуориметре «Beckman COULTER» Epics XL II. Типирование лимфоцитов проводили с помощью моноклональных антител к кластерам дифференцировки СД3+, СД4+, СД8+, СД20+, СД69, СД71, СД95, СД28, СД40 фирмы IMMUNOTECH (Франция). О состоянии гуморального иммунитета судили по содержанию сывороточных IgG, IgA, IgM иммуноглобулинов, определяемых методом радиальной иммунодиффузии по J. Manchini et al. (1965). Процедура статистической обработки полученных эмпирических данных предусматривала последовательное выполнение нескольких этапов. Проверялось распределение исходных переменных на нормальность с применением пакета прикладных программ MegaStat (Гайдышев И.В., 2001). Проведенная оценка исходных данных по виду распределения не позволила использовать параметрические методы исследования, так как распределение данных не подчинялось нормальному закону. Далее применялись процедуры описательной статистики, с помощью которой оценивались значения медианы и интерквартильного размаха (25%, 75%). Достоверность полученных результатов рассчитывалась при доверительной вероятности 95%. Обработка исходных рядов признаков осуществлялась с использованием пакетов прикладных программ Statistica версии 6.0 и EXCEL 2003, SPSS 13.0, MegaStat. Для сравнения межгрупповых различий использовали непараметрический метод Вилкоксона для независимых групп с помощью пакета AtteStat 9.2.

При помощи пакета SPSS рассчитывались доверительные интервалы для медиан. Пересечение интерквартильных интервалов не говорит об отсутствии достоверных различий сравниваемых групп. В случае сравнения долевых признаков в двух независимых группах объектов исследования применяли программу вычисления точного критерия Фишера. Анализ корреляций 3-х признаков осуществлен графическим методом - карты линий уровня. Были также применены нелинейные методы, метод классификаций, дискриминантный анализ с оценкой точности, чувствительности, специфичности, прогностической ценности положительного и отрицательного результатов.

Для анализа многомерных нелинейных зависимостей использовали пакет PolyAnalist 3.5 Pro, который позволяет от одновременного рассмотрения многих переменных перейти к рассмотрению синтезированной переменной в целях разделения двух групп. Для формирования диагностического правила применялся метод построения характеристической ROC - кривой (Reciever-operating characteristic curve), составлялись таблицы чувствительности и специфичности, анализ которых способствовал определению точки разделения (cut off frequency) показателей.

При объяснении материала, накопленного в результате аналитического исследования, нами был применен, согласно синергетике, целостный подход, а не механистический. С точки зрения синергетики сложную иерархически организованную структуру можно представить как совокупность различных стадий развития. Сложные системы рассматриваются, как целое и не могут быть изучены разделением их на части, которые рассматриваются изолировано. Этим объясняется широкое использование в работе математических формул для решения поставленных задач. Наши исследования были направлены на то, чтобы из непрерывного взаимодействия множества изучаемых компонентов обеспечивающих самоорганизацию иммунной системы, направленную к достижению полезного результата (адаптация ребенка на первом году, направленная на поддержание иммунного гомеостаза и минимизацию заболеваний на первом году жизни), выбрать наиболее статистически значимое взаимодействие компонентов иммунной системы.

Результаты исследования и их обсуждение

Клиническая симптоматика герпесвирусной инфекции на первом месяце жизни характеризовалась полиморфизмом во всех группах обследованных детей (таблица 1). Анализ данных анамнеза жизни обнаружил, что у подавляющего большинства детей имел место отягощенный преморбидный фон. Так неблагоприятные факторы, обнаруженные у матерей в течение беременности, родов, патология перинатального периода, вероятно, вызывают сдвиги адаптационно-приспособительных механизмов, в том числе иммунного гомеостаза (Григорьева Е.А, 2003; Орджоникидзе Н.В. Агаронян Н.Г , 2005; Сарычев А.М. , 2005). Тяжелая форма ЦМВИ развивалась у детей, родившихся у матерей с высокой частотой регистрации угрозы прерывания беременности (62,7%), ОРВИ (34,3%), заболеваний мочевыделительной системы (31,3%), кольпита (20,9%), вегетососудистой дистонии (19,4%), фетоплацентарной недостаточности (17,9%), эндоцервицита (11,9%), преждевременных родов (34,1%), имевших большой процент выявления (35,8%) низкой оценки по шкале Апгар (4-6 баллов). К особенностям клиники следует отнести, увеличение печени (56,7%), гипотрофию (49,2%) конъюгационную желтуху (34,3%), геморрагический синдром (23,9%). Патология органов дыхания проявлялась синдромом дыхательных расстройств (61,2%), пневмонией (53,7%). Поражение нервной системы гипоксически-ишемического или гипоксически-геморрагического генеза регистрировалось у всех детей этой группы и проявлялось синдромом вегетовисцеральных дисфункций (59,7%), синдромом угнетения (58,2%), судорожным синдромом (35,8%), гидроцефалией (34,2%), атрофией дисков зрительного нерва (28,3%), пороками развития головного мозга (19,4%), микроцефалией (13,4%), менингоэнцефалитом (13,4%). К особенностям гемограммы относились лейкоцитоз (41,7%), анемия (82,1%) и тромбоцитопения (20,9%), проявлявшаяся геморрагическим синдромом.

К особенностям преморбидного фона больных со среднетяжелой формой ЦМВИ относились: высокая частота регистрации у матерей угрозы прерывания беременности (52,5%), гипоксии плода (40,0%), фетоплацентарной недостаточности (32,5%), воспалительных заболеваний мочевыделительной системы (32,3%), анемии (26,3%). Оценка уровня статистической значимости различий отдельных симптомов в зависимости от этиологии заболевания была проведена с группой детей с ЦМВИ, типичной генерализованной формой в связи с тем, что в этой группе детей зарегистрирован наибольший процент осложнений к концу первого года жизни

К особенностям клиники при среднетяжелой форме ЦМВИ следует отнести высокий процент встречаемости конъюгационной желтухи (40,0%), дисбактериоза кишечника (35,0%), гипербилирубинемии (32,5%). Неврологическая симптоматика характеризовалась высокой частотой гипоксически-ишемического поражения ЦНС (93,8%), проявляющегося гипертензионно-гидроцефальным синдромом (90,0%) и синдромом повышенной возбудимости (55,0%). К особенностям гемограммы относились моноцитоз (43,7%) и отсутствие тромбоцитопении.

Таблица 1

Характеристика и частота клинических симптомов у детей с герпесвирусной инфекцией на первом месяце жизни

* - различия с показателями больных группы 1.1 статистически обоснованы при p < 0,05

Анализ анамнеза, клинических проявлений и иммунного статуса у детей с инфекцией, вызванной вирусом простого герпеса, показал, что заболевание развивалось у детей из группы риска с отягощенным преморбидным фоном. У матерей отмечались воспалительные заболевания мочевыделительной системы (22,9%), ОРВИ (22,9%), кольпит (17,1%), самопроизвольные выкидыши (14,3%) и неразвивающиеся беременности (14,3%). В этой клинической группе у матерей отмечался высокий процент гипоксии плода (48,6%) и фетоплацентарной недостаточности (20,0%). Диагностированы симптомы вторичного иммунодефицита, клиническими маркерами которого явились лихорадка (22,9%), менингоэнцефалит (14,2%), геморрагический синдром (11,4%), лимфаденит (11,4%),. К особенностям гемограммы относились моноцитоз (34,3%), тромбоцитопения (17,4%), явившаяся одной из причин геморрагического синдрома и сопоставимые по уровню с показателями пациентов с тяжелой формой ЦМВИ. Эпштейна-Барр вирусная инфекция развивалась у детей, матери которых имели отягощенный акушерско-гинекологический анамнез: кольпит (23,0%), самопроизвольные выкидыши (10,3%), неразвивающиеся беременности (10,3%), эндоцервицит (10,2%). Осложнения во время беременности были представлены высокой частотой гипоксии плода (46,2%), фетоплацентарной недостаточности (33,3%), раннего (30,8%) и позднего (23,1%) гестозов, многоводия (20,5%). Одна треть детей в этой группе родилась преждевременно и имела низкую массу при рождении, у 20,5% больных оценка по шкале Апгар составила 4-6 баллов. Клиническими особенностями в этой группе явилась высокая частота выявления врожденных пороков сердца (ДМПП - 48,7%; ДМЖП - 53,8%), пневмонии (41,0%), гидроцефалии (23,0%). Со стороны гемограммы превалировал моноцитоз (69,2%). Большинство обследованных детей с герпесвирусной инфекцией имели различную неврологическую симптоматику, структура которой представлена в таблице 2. В отличие от детей с тяжелой формой ЦМВИ, в группе детей со среднетяжелой формой ЦМВИ достоверно реже отмечались судороги (p< 0,0001), синдром угнетения (p< 0,0001), мышечная гипотония (p< 0,0004).

При проведении нейросонографии установлено (таблицы 3, 4), что на первом месяце при герпесвирусных инфекциях эхографические изменения регистрировались у всех наблюдаемых детей, однако степень их выраженности зависела от этиологии и тяжести заболевания. Расширение желудочков отмечались с высокой частотой во всех группах на первом месяце жизни, независимо от этиологии заболевания.

Таблица 2

Частота встречаемости основных неврологических симптомов и синдромов на первом месяце жизни

* - различия с показателями больных группы 1.1 статистически обоснованы при p< 0,05

У детей с тяжелой формой ЦМВИ на первом месяце значительно чаще (58,2%), чем в группах с ЦМВИ, среднетяжелой формой (35,0%), инфекцией, вызванной вирусом простого герпеса I и II типов (20,0%) и Эпштейна-Барр вирусной инфекцией (41,0%), отмечались расширение межполушарной щели (58,2%; p<0,03; p<0,001; p<0,05).

Таблица 3

Показатели нейросонограммы у детей с разной степенью тяжести ЦМВИ

Примечание: в числителе - абсолютные значения, в знаменателе - относительные значения (в %),* - различия с показателями в сроке 1 мес. статист. обоснованы при p<0,05

Увеличение желудочкового индекса, повышение эхогенности паренхимы мозга с одинаковой частотой встречались во всех группах больных за исключением среднетяжелой формой ЦМВИ. Во всех группах с высокой частотой обнаруживались псевдокисты. Максимальная частота патологических эхографических изменений отмечалась в первые 3 месяца во всех группах с последующим постепенным уменьшением их выявления к концу года. К концу первого года жизни в группах детей с тяжелой формой ЦМВИ наиболее часто по сравнению с первым месяцем жизни сохранялось расширение межполушарной щели. В группах детей с инфекцией, вызванной вирусом простого герпеса, и Эпштейна-Барр вирусной инфекцией эти изменения к концу первого года жизни практически купировались.

Нами было использовано несколько диагностических методов для постановки диагноза герпесвирусной инфекции. В группе детей с тяжелой формой ЦМВИ диагноз подтверждался у 31,4% больных положительным результатом ПЦР крови, у 68,8% - положительным результатом ПЦР мочи, что сочеталось с нарастанием титра анти - ЦМВ- IgG через 3 месяца от начала заболевания.

Таблица 4

Показатели нейросонограммы у детей с герпесвирусной инфекцией с учетом этиологии заболевания

Примечание: в числителе - абсолютные значения, в знаменателе - относительные значения (в %).

* - различия с показателями в сроке 1 месяца статистически обоснованы при p < 0,05

Среднетяжелая форма ЦМВИ сопровождалась положительным результатом ПЦР крови у 13,8% детей и ПЦР мочи у 80,0% детей, обнаружением анти - ЦМВ- IgM у 7,8% больных, что в сопоставлении с серологическим исследованием методом ИФА, выявившим нарастание уровней специфических антител класса IgG через 3 месяца от начала заболевания, позволило подтвердить диагноз ЦМВИ. У детей с инфекцией, вызванной вирусом простого герпеса I и II типа, диагноз был подтвержден положительным результатом ПЦР крови у 14,3% детей, обнаружением у 54,3% больных специфических противовирусных IgM и IgG антител в спинномозговой жидкости, выявлением специфических антител класса IgM в сыворотке крови у 5,7% детей, положительным результатом ПЦР мочи - у 39,3% детей, и нарастанием титров специфических IgG в динамике через 3 месяца у 26% пациентов. У детей с Эпштейна-Барр вирусной инфекцией диагноз подтверждался положительным результатом ПЦР крови у 12,8% детей, ПЦР мочи - у 71,4% детей в сочетании с нарастанием титров специфических IgG-антител, а также обнаружением у 16% пациентов специфических противовирусных IgG-антител в спинномозговой жидкости,

Поскольку тяжесть течения и исход заболеваний, вызванных герпесвирусами, определяются состоянием их иммунной системы, нами проведено изучение показателей клеточного и гуморального звеньев иммунитета в зависимости от вида возбудителя герпесвирусной инфекции (рис. 1). Проведенные исследования выявили, что в группе детей с тяжелой формой ЦМВИ отмечалось достоверное снижение относительного количества Т-лимфоцитов, экспрессирующих на своей мембране CD3+[66,0 (61,05-74,6)%] по сравнению с контрольной группой [80,5 (70,2-87,9)%] (p= 0,002). При этом отмечалось снижение относительного количества Т-хелперов (CD4+лимфоцитов) - 41,6 (35,48-56,73)% по сравнению с контрольной группой [61,52 (52,65-70,45); p= 0,001] и группой детей с Эпштейна-Барр вирусной инфекцией [53,10 (46,43-65,08); p=0,001] и увеличение относительного количества В-лимфоцитов (CD20) - 18,55 (10,0-25,9)% по сравнению с контрольной группой [6,01 (3,5-11,6)%, p= 0,0001], с группой детей с ЦМВИ, среднетяжелой формой [18,2 (8,40-22,40)%, p = 0,003], с инфекцией, вызванной вирусом простого герпеса [11,25 (7,08-13,33)%; p= 0,0003] и Эпштейна-Барр вирусной инфекцией [6,90 (4,13-11,35)%; p= 0,0001].

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 1 Показатели клеточного и гуморального звеньев иммунной системы при герпесвирусной инфекции в сравнении между клиническими группами.

При анализе результатов исследования у детей с герпесвирусной инфекцией (рис.2) выявлено снижение относительного количества активированных клеток с маркерами активации CD3+CD28+ у детей с ЦМВИ, тяжелой формой [50,55 (46,80 - 60,20)%; p= 0,04] по сравнению с контрольной группой [68,10 (42,05-8,50)%], ЦМВИ среднетяжелой формой [52,35 (47,18-59,95)%; p= 0,002] и инфекцией, вызванной вирусом простого герпеса [64,60 (59,10-78,43)%]; p= 0,03].

В то же время Эпштейна-Барр вирусная инфекция у детей не сопровождалась существенными отличиями в содержании лимфоцитов CD3+CD28+. Являясь важнейшим компонентом контактного взаимодействия иммунокомпетентных клеток между собой, молекула активации CD3+CD28+ обеспечивает активацию Т-хелпера (CD4). Более выраженное снижение числа клеток в сыворотке крови с маркерами CD3+CD28+ при ЦМВИ, тяжелой форме вызывало угнетение клеточного звена иммунитета, что являлось одной из причин более тяжелого течения заболевания у пациентов этой группы.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 2. Относительный уровень клеток с маркерами активации CD3+CD28+ при герпесвирусной инфекции в сравнении между клинической группой.

Не менее значимые изменения выявлены при определении клеток с маркерами активации CD20+CD40+ (рис.3). Отмечено их достоверное увеличение по сравнению с контрольной группой [5,90 (3,15 - 11,45)%] в группах детей с тяжелой формой ЦМВИ [18,20 (10,60-27,95)%; p= 0,0001], среднетяжелой формой ЦМВИ [18,30 (11,85-23,60)%; p= 0,0003]. Установлено, что в группе детей с тяжелой формой ЦМВИ уровень CD20+CD40+ был достоверно выше, чем в группах детей с инфекцией, вызванной вирусом простого герпеса [10,95 (6,88-13,05)%; p= 0,0001] и с Эпштейна-Барр вирусной инфекцией [7,20 (4,86-14,20)%; p = 0,0001].

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 3. Относительный уровень клеток с маркерами активацииCD20+CD40+ при герпесвирусной инфекции в сравнении между клинической группой.

У больных с герпесвирусной инфекцией имело место повышение на лимфоцитах экспрессии CD95, свидетельствующее о нарастании готовности лимфоцитов к апоптозу (рис.4). Анализ процессов их активации у обследованных нами больных выявил, что при инфекции, вызванной вирусом простого герпеса, отмечено достоверное повышение экспрессии CD95 на первом месяце жизни [10,85 (6,95-14,05)%] по сравнению с контрольной группой [2,4 (1,8-3,4)%; p= 0,001] и группами детей с ЦМВИ, тяжелой [2,70 (1,93-4,30)%; p= 0,0001] и среднетяжелой формами [2,90 (1,30-7,90)%; p= 0,0001]. При Эпштейна-Барр вирусной инфекции имело место увеличение лимфоцитов, экспрессирующих CD95+ [3,70 (2,30-11,50)%] по отношению к контрольной группе (p= 0,05) и группам больных с ЦМВИ (p= 0,001), но в значительно меньшей степени, чем при инфекции, вызванной вирусом простого герпеса. Индуцированный апоптоз может служить как защитный механизм элиминации вирус-инфицированных клеток. Во всех исследуемых группах (рис.5) отмечено снижение относительного количества клеток с маркерами активации CD 69 по сравнению с контрольной группой - 2,05 (1,28-2,88)%: ЦМВИ, тяжелая форма - 0,75 (0,33-1,77)%, p= 0,0001; ЦМВИ, среднетяжелая форма - 0,85 (0,33-2,85)%, p= 0,001; инфекция, вызванная вирусом простого герпеса - 1,60 (0,85-5,75)%, p= 0,001; Эпштейна-Барр вирусная инфекция - 1,10 (0,90-1,30), p= 0,05.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 4. Содержание относительного количества клеток с маркерами активации CD3+CD95+ при герпесвирусной инфекции в сравнении между группами

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 5. Содержание относительного количества CD3+CD69+ при герпесвирусной инфекции в сравнении между группами

Следует отметить также снижение процессов активации, документируемое уменьшением относительного количества клеток, экспрессирующих CD71(рис. 6) в группах детей с тяжелой [0,40 (0,17-1,23)%] и среднетяжелой [0,35 (0,12-1,35)%] формой ЦМВИ при сравнении с контрольной группой [1,85 (1,33-2,34)%; p= 0,05 и p= 0,0001 соответственно]. Также установлено снижение этого показателя в сыворотке крови и в группе детей с Эпштейна-Барр вирусной инфекцией [0,80 (0,1-1,8)%] по сравнению с контрольной группой (p = 0,01). Таким образом, снижение уровня маркеров активации (CD69, CD71) лимфоцитов свидетельствует о дефектах процессов активации при герпесвирусной инфекции и, следовательно, иммунной защиты.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 6. Содержание относительного количества CD3+CD71+ при герпесвирусной инфекции в сравнении между группами

Одним из патогенетических механизмов, обусловливающих развитие герпесвирусной инфекции, являются нарушения в системе цитокинов, при этом ведущее значение имеет система интерферона (Ройт А. и др., 2000). В настоящем исследовании была проведена сравнительная оценка уровней ИФН - б, ИФН - , ИЛ -2, ИЛ- 4, ФНО - б в сыворотке крови у детей с герпесвирусной инфекцией. Уровень ИФН - б в сыворотке крови у детей с тяжелой формой ЦМВИ [12,7 (6,6-19,2) пг/мл], среднетяжелой формой ЦМВИ[14,7 (6,8 -24,9) пг/мл] и Эпштейна-Барр вирусной инфекцией [15,4 (4,0-28,2) пг/мл] был достоверно выше, чем в группе контроля [9,6 (6,3 -15,4) пг/мл; p = 0,006; p= 0,006; p = 0,04 соответственно]. Исследование динамики уровней сывороточного ИФН - б после проведенного лечения в возрасте 3 месяцев показало достоверное снижение его концентрации только в группе детей с ЦМВИ, типичной генерализованной формой [11,2 (2,5-21,4) пг/мл; p = 0,001]. В других группах снижение этого показателя наблюдалось лишь к 6 месяцу жизни (p < 0,05). Во всех группах больных, за исключением Эпштейна-Барр вирусной инфекции, уровень ИФН - был ниже в начале заболевания на первом месяце жизни по сравнению с контрольной группой [497,9 (209,9 - 581,9) пг/мл]. Так, при ЦМВИ, тяжелой форме он составил 408,5 (220,5-620,5) пг/мл, p = 0,0001; при ЦМВИ, среднетяжелой форме - 87,8 (62,0 - 236,1 пг/мл; p = 0,003; при инфекции, вызванной вирусом простого герпеса - 50,0 (12,7 - 51,4) пг/мл, p = 0,03. У детей с Эпштейна-Барр вирусной инфекцией на первом месяце жизни достоверного снижения ИФН - г не отмечалось [384,7 (121,9 - 536,8) пг/мл], что свидетельствует о его своевременном включении в процесс противовирусной защиты.

У всех детей в обследуемых группах на первом месяце жизни отмечалось достоверное повышение в сыворотке крови по сравнению с контрольной группой уровня ИЛ-2. Наиболее высокой концентрация ИЛ-2 отмечалась в группе детей с ЦМВИ, типичной генерализованной формой [292,9 (134,6 - 463,0) пг/мл] по сравнению с пациентами с ЦМВИ, среднетяжелой формой [139,6 (95,1-286,0) пг/мл; p< 0,001], инфекцией, вызванной вирусом простого герпеса [116,8 (66,4-118,0); пг/мл p< 0,0001] и Эпштейна-Барр вирусной инфекцией [124,4 (54,5 - 107,6) пг/мл; p< 0,0001]. Исследование динамики уровней сывороточного ИЛ-2 после проведенного лечения показало достоверное снижение его концентрации к 3 месяцам (p< 0,001) в группах детей с ЦМВИ. В группе детей с Эпштейна-Барр вирусной инфекцией концентрация ИЛ-2 в сыворотке крови повышалась в возрасте одного месяца по сравнению с контрольной группой (p< 0,05), но в отличие от детей с ЦМВИ оставалась на этом уровне без тенденции к снижению до 6 месяцев. Исследование уровня противовоспалительного цитокина ИЛ-4 свидетельствовало о достоверном повышении его во всех исследуемых группах за исключением Эпштейна-Барр вирусной инфекции, на первом месяце жизни по сравнению с контрольной группой: ЦМВИ, тяжелая форма - 70,5 (42,9-113,4) пг/мл, p< 0,01; ЦМВИ, среднетяжелая форма - 92,2 (49,3-167,1) пг/мл, p< 0,007; инфекция, вызванная вирусом простого герпеса - 71,4 (60,2-71,8) пг/мл, p< 0,007. При анализе характера изменений ФНО - б было установлено, что у новорожденных в начале заболевания уровень ФНО - б в сыворотке крови достоверно повышался в группах детей с тяжелой [24,4 (5,9-45,7) пг/мл] и среднетяжелой [35,8 (9,3-78,8) пг/мл] в сравнении с контрольной группой [7,7 (5,9-17,2) пг/мл; p = 0,002 и p = 0,0001 соответственно]. Проведенные исследования не выявили статистически значимых различий в уровне ФНО - б у больных с инфекцией, вызванной вирусом простого герпеса и Эпштейна-Барр вирусной инфекцией и пациентов группы контроля.