Регуляція гістаміном апоптозу лімфоїдних клітин

Размещено на http://www.allbest.ru/

Міністерство охорони здоров'я України

Донецький державний медичний університет ім. М. Горького

Науково-дослідний інститут травматології та ортопедії

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук

Регуляція гістаміном апоптозу лімфоїдних клітин

14.03.08 - імунологія та алергологія

Ястремська Ірина Анатоліївна

Донецьк - 2007

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми визначається необхідністю вивчення нових підходів щодо регуляції функцій імунної системи. Відомо, що апоптозу належить особливе значення в підтримці гомеостазу клітин імунної системи. Порушення цього феномену призводить до лімфопроліферації та імунодефіцитів. Апоптоз імуноцитів у людини є універсальним інструментом регуляції імунної відповіді (Ярилин А.А., 2001). Вивчення механізмів регуляції даного процесу дозволить певним чином впливати на нього з метою регуляції чи корекції. Насьогодні важливим питанням є визначення ролі ендогенних біологічно-активних речовин у біорегуляції багатоклітинного організму та вивчення їх функціональної активності в умовах патології. Такі речовини відносяться до медіаторної ланки системи біорегуляції і беруть участь у механізмах міжгенних взаємодій на рівні популяцій спеціалізованих клітин.

Тому перспективним є дослідження ефектів потужного біогенного аміну гістаміну, провідна роль якого в патофізіології запалення та алергічних реакціях неодноразово доведена (Weltman Joel K., 2000; Bachert C., 2002; Macglashan D., 2003). Нещодавно з'ясувалося, що гістамін також регулятор багатьох істотних подій в імунній відповіді (Jutel M. et al., 2002). Він впливає на дозрівання дендритних клітин та їхню T-поляризуючу здатність, змінює активацію, поляризацію, хемотаксис та ефекторні функції клітин, модулює баланс Th1/Th2-клітин, регулює функції алерген-специфічних T-клітини в алергічних імунних відповідях (Akdis C.A., 2003; Idzko M., 2002). Гістамін має важливий вплив на індукцію й підтримання периферичної толерантності, розвиток аутоімунітету й раку (Kunzmann S., 2003). Гістамін реалізує свої функції за допомогою чотирьох субтипів рецепторів, індукує декілька систем сигнальної трансдукції: фосфоліпазну та аденілатциклазну системи (Church M.K., 2004). Ці системи беруть безпосередню участь у реалізації програм апоптозу лімфоїдних клітин (Кайдашев І.П., 2004).

Але крім класичних ефектів, які реалізуються на рівні органу, гістамін прямо чи опосередковано впливає на функціональний стан імуноцитів, що обумовлює його імуномодулюючі ефекти та додаткові, неспецифічні ефекти антигістамінних препаратів (Бережная Н.М., 2000).

В останній час, серед неспецифічних ефектів Н-блокаторів була виявлена їх здатність впливати на функціональну активність імунокомпетентних клітин та модулювати імунну відповідь, що призвело до необхідності проведення систематизованого вивчення гістаміну та селективних блокаторів його рецепторів на процеси апоптозу лімфоїдних клітин для поглиблення знань про функціонування імунної системи.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дана робота є самостійним фрагментом планової науково-дослідної роботи центральної науково-дослідної лабораторії ВДНЗУ "УМСА" "Регуляція процесів апоптозу лімфоїдних клітин при розвитку алергічних захворювань", № держреєстрації 0102U001583, що фінансується МОЗ України.

Мета і задачі дослідження. Дослідити роль гістаміну в регуляції апоптозу лімфоїдних клітин шляхом використання гістаміну та селективних блокаторів його рецепторів за фізіологічних умов та при розвитку алергічного запалення в експерименті для поглиблення знань про регуляцію функціонування імунної системи.

У відповідності з метою роботи були висунуті наступні задачі:

1. Визначити базальний рівень апоптозу лімфоїдних клітин (лімфоцити, тимоцити, спленоцити, мононуклеари периферійної крові) у здорових щурів.

2. Вивчити перебіг процесів апоптозу лімфоїдних клітин при введенні гістаміну щурам.

3. Вивчити рівень апоптозу лімфоїдних клітин при введенні щурам селективних блокаторів гістамінових рецепторів (H1R, H2R, H3R).

4. Визначити рівень апоптозу лімфоїдних клітин при розвитку алергічного запалення на експериментальній моделі бронхіальної астми у щурів.

5. Вивчити апоптоз лімфоїдних клітин при розвитку алергічного запалення та введенні селективних блокаторів гістамінових рецепторів (H1R, H2R) щурам.

Об'єкт дослідження - гістамінергічна регуляція процесів апоптозу лімфоїдних клітин.

Предмет дослідження - регуляція процесів апоптозу лімфоїдних клітин (лімфоцитів, тимоцитів, спленоцитів та мононуклеарів периферійної крові) гістаміном та селективними блокаторами гістамінових рецепторів (H1R, H2R, H3R) у здорових тварин та при розвитку алергічного запалення.

Методи дослідження. Вирішення поставленої мети досягнуто за допомогою використання гістаміну та селективних блокаторів гістамінових рецепторів (H1R, H2R, H3R) у тварин за фізіологічних умов та при розвитку алергічного запалення на моделі експериментальної бронхіальної астми. Процеси апоптозу у відповідності до стадій його розвитку визначали методом проточної лазерної цитофлюорометрії з використанням аннексину V-FITC та РI, та морфологічним методом забарвлення за Май-Грюнвальдом-Романовським-Гімзою.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше досліджені та проаналізовані окремі аспекти ролі гістаміну в регуляції апоптозу лімфоїдних клітин на різних стадіях апоптотичного процесу та особливостей його розвитку в окремих субпопуляціях - тимоцитах, спленоцитах, лімфоцитах периферійної крові та лімфатичних вузлів. Вивчена дія сучасних селективних антигістамінних препаратів - дезлоратадину, фамотидіну та тіопераміду - на перебіг апоптозу лімфоїдних клітин. Досліджена участь гістамінових рецепторів Н1, Н2 та Н3 в модуляції процесів апоптозу лімфоїдних клітин.

Отримані нові дані щодо перебігу процесів апоптозу лімфоїдних клітин при розвитку алергічного запалення. Встановлено, що селективні блокатори Н1- та Н2- гістамінових рецепторів здатні модулювати апоптоз лімфоїдних клітин при алергічному запаленні. Проведено аналіз впливу селективних блокаторів гістамінових рецепторів дезлоратадину та фамотидіну на апоптоз при експериментальній бронхіальній астмі. Вперше досліджена дія сучасного селективного Н3-блокатору тіопераміду на апоптоз лімфоїдних клітин в експериментах in vitro та in vivo. Отримані нові дані щодо існування гістамінових рецепторів Н3 на поверхні лімфоїдних клітин та їх участі в модуляції апоптотичних процесів.

Практичне значення одержаних результатів. Представлені автором в дисертаційній роботі отримані результати, що стосуються моделюючої дії селективних блокаторів рецепторів гістаміну - дезлоратадину, фамотидіну та тіопераміду на апоптоз лімфоїдних клітин, перспективні в практичному відношенні, оскільки можуть бути використані на практиці з метою патогенетично обґрунтованої терапії у хворих з різноманітною патологією, що викликана порушеннями процесів апоптозу, зокрема при бронхіальній астмі, та при станах, що потребують його корекції.

Розроблено спосіб індукції апоптозу лімфоїдних клітин, спосіб корекції функціонального стану лімфоїдних клітин та спосіб корекції апоптозу лімфоїдних клітин при бронхіальній астмі, отримано три деклараційних патенту України на корисну модель.

Особистий внесок здобувача. Робота проведена на базі Центральної науково-дослідної лабораторії Вищого державного закладу України "Українська медична стоматологічна академія". Дисертантом самостійно проведено патентно-інформаційний пошук, підбір та аналіз вітчизняних та зарубіжних літературних даних. Самостійно виконані цитофлюорометричні та морфологічні методи досліджень. Аналіз всього отриманого фактичного матеріалу, розробка основних положень і висновків роботи у відповідності до мети і задач дослідження також належить дисертанту.

Апробація результатів дисертації. Матеріали роботи повідомлені на 3-й науково-практичній конференції "Винахідництво і раціоналізаторство, інноваційна діяльність. Проблеми та перспективи - 2005" (м. Полтава, 2005); VII науково-практичній конференції "Актуальные вопросы клинической лабораторной иммунопатологии и аллергологии" (м. Київ, 2005); 62-й підсумковій конференції Американської академії алергології, астми та імунології (AAAAI, Маямі Біч, Флорида, 2006); VIII науково-практичній звітньо-виборчій конференції Українського товариства спеціалістів з імунології, алергології та імунореабілітації "Сучасні аспекти діагностики та лікування імуно- та алергопатології" (м. Київ, 2006); науково-практичній конференції "Сучасні методи діагностики та лікування алергічних захворювань" (м. Київ, 2006); підсумковій конференції Американського коледжу алергології, астми та імунології (ACAAI, Філадельфія, 2006); на засіданні апробаційної ради №1 Вищого державного навчального закладу України "Українська медична стоматологічна академія" (витяг з протоколу №13 від 22.06.2006) та на засіданні апробаційного семінару за спеціальністю 14.03.08 - імунологія та алергологія Донецького державного медичного університету ім. М. Горького МОЗ України (протокол №6 від 19.10.2006).

Публікації. За темою дисертації надруковано 13 робіт: 4 - статті у фахових виданнях журналів, 6 тез доповідей, отримано 3 патенти України на корисну модель.

Структура і обсяг дисертації. Дисертація викладена на 140 сторінках комп'ютерного тексту, містить 29 малюнків і 7 таблиці. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, матеріалів і методів дослідження, 4 розділів результатів власних досліджень, 172 літературних джерел, з яких 53 є вітчизняними і 119 - зарубіжними.

Основний зміст роботи

Матеріали і методи дослідження. Групування дослідів. Для вирішення поставлених у роботі завдань були проведені експериментальні дослідження на 104 самцях щурів лінії Вістар віком 6-7 місяців, з масою тіла 250 - 300 г.; на 12 самцях мишей лінії BALB/c, віком 20 тижднів, масою 20 г. та мононуклеарах периферійної крові людини.

Лабораторних тварин утримували в умовах акредитованого віварію ВДНЗУ "Українська медична стоматологічна академія" на типовому раціоні годування (раціон 3.2 згідно наказу 1179 про нормативи годування лабораторних тварин в закладах охорони здоров'я) у відповідності з "Стандартными правилами по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)". Всі маніпуляції з тваринами проводились за дозволом Комісії з етичних питань та біоетики (протокол №12 від 19.01.2004).

З метою вивчення in vivo впливу гістаміну на процеси апоптозу лімфоїдних клітин щурів (лімфоцитів, тимоцитів, спленоцитів, мононуклеарів периферійної крові) були використані гістамін, селективні блокатори гістамінових рецепторів (HR1, HR2 та HR3) та експериментальна модель бронхіальної астми. Для досягнення поставлених у роботі задач тварини були розподілені на наступні серії дослідів.

І серія - дослідження базального рівня апоптозу лімфоїдних клітин у здорових щурів та рівня апоптозу після застосування гістаміну та селективних блокаторів гістамінових рецепторів HR1 та HR2 : 1 група - інтактна щурі (n = 10); 2 група - дослідження апоптозу лімфоїдних клітин після введення гістаміну щурам (n = 10); 3 група - дослідження апоптозу лімфоїдних клітин після введення селективного блокатору гістамінових рецепторів HR1: мінімальної дози (n = 6), середньої (n = 6) та максимальної дози (n = 6); 4 група - дослідження апоптозу лімфоїдних клітин після введення селективного блокатору гістамінових рецепторів HR2 - мінімальної дози (n = 6), середньої (n = 6) та максимальної дози (n = 6).

ІІ серія - дослідження впливу HR3-блокатора на рівень апоптозу лімфоїдних клітин: 1 - в експерименті in vivo на мишах : а) інтактні миші (n = 6), б) піддослідні (n = 6); 2 - в експерименті in vitro на мононуклеарах периферійної крові людини.

ІІІ серія - дослідження рівню апоптозу лімфоїдних клітин при розвитку алергічного запалення на моделі експериментальної бронхіальної астми та введення селективних блокаторів гістамінових рецепторів HR1 та HR2: 1 група - дослідження рівню апоптозу лімфоїдних клітин при розвитку алергічного запалення (n = 10); 2 група - дослідження апоптозу лімфоїдних клітин при розвитку алергічного запалення та введення селективного блокатору гістамінових рецепторів HR1 тваринам (n = 10); 3 група - дослідження апоптозу лімфоїдних клітин при розвитку алергічного запалення та введення селективного блокатору гістамінових рецепторів HR2 тваринам (n = 10).

Дію гістаміну визначали шляхом введення гістаміну дигідрохлориду (Sigma, США) в дозах 0,001, 0,01 та 0,1 мкг/кг маси тіла щурам підшкірно з інтервалом 24 години протягом 1, 5 та 10 днів. В якості блокатору H1R було застосовано дезлоратадин ("Еріус", Шерінг-Плау, США) в дозах 0,007 мг/кг, 0,07 мг/кг та 0,7 мг/кг маси тіла протягом 10 днів. В якості блокатору H2R був використаний фамотидін (КМП, Україна) в дозах 0,06 мг/кг, 0,6 мг/кг та 6 мг/кг маси тіла протягом 10 днів. Блокатори HR вводили перорально з інтервалом 24 години. Дози препаратів підбирались на основі середньотерапевтичних доз у перерахунку на 1 кг маси тіла.

Дію блокатора НR3 визначали шляхом введення тіопераміду ("Thioperamide maleate", Sigma-RBI, Germany) мишам в дозі 10 мг/кг маси тіла (n=6) інтраперітонеально протягом 10 днів. Для експерименту in vitro використовували суспензію лімфоцитів, яку отримували з периферійної гепаринізованої венозної крові здорової людини шляхом центрифугування в одноступеневому градієнті щільності фікол-верографіні (1,077 г/мл). Лімфоцити у кінцевій концентрації 106/мл інкубували у середовищі Ігла з глютаміном (Sigma, США), 10% інактивованою телячою сироваткою ("Bio Mark Inc", Львів, Україна), 100 мкг/мл гентаміцином сульфат (ГНЦЛС, Україна) при 370С з тіоперамідом в концентраціях 1 µM, 10 µM та 100 µM в двох паралелях 24, 48 та 72 год.

Для дослідження апоптозу лімфоїдних клітин при розвитку алергічного запалення у піддослідних щурів була відтворена експериментальна модель бронхіальної астми. Щури були сенсибілізовані внутрішньоочеревинним введенням 0,5мг овальбуміну/10 мг гідроокису алюмінію (CSL, Parkville, Australia) в 0,9% стерильному фізіологічному розчині. На 12, 14, 16, та 18 день всі групи були аероалергізовані овальбуміном в дозі 10 мг/мл в об'ємі 700 см3 з діаметром часточок аерозолю 10 мкм при максимальному розпиленні рідини 0,4 мл/хв протягом 15 хв 3 рази з інтервалом 30 хв. за допомогою інгалятора ультразвукового "Муссон-2" (ФГУП "Алмаз", г. Ростов-на-Дону, Россия). Через 24 години після останнього впливу аерозолю у щурів спостерігались ознаки бронхіальної астми.

У експериментальних тварин після забою під тіопенталовим наркозом забирали тимус, селезінку, периферичні лімфатичні вузли та кров з правого шлуночка серця з подальшим отриманням суспензії клітин за стандартними методиками та проведенням морфологічних та імунологічних досліджень.

Методи досліджень. Для виконання поставлених перед нами задач були використані методи, що характеризують процеси апоптозу лімфоїдних клітин у відповідності до стадій його розвитку (1 стадія - індукція апоптозу, механізми стимуляції; 2 стадія - внутрішньоклітинне сигналізування після ліганд рецепторного зв'язування; 3 стадія - апоптоз).

Методом проточної лазерної цитофлюорометрії (ПЛЦ) з використанням FITC-аннексину V та барвника пропідіуму йодиду (РІ) визначали експресію апоптотичних маркерів лімфоїдних клітин.

Клітини доводили до концентрації 105 в 100 мкл, відмивали в 0,5 ml Heppes - буфера (10 mM Hepes (NaOH, pH 7,4), 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM Mg Cl2, 1,8 mM CaCl2) при 1,5 тис.об./хв. 5 хв. Надосад зливали, клітини ретельно ресуспендували та інкубували в темноті при кімнатній температурі по 10 хв. з додаванням 5 мкл Annexin V-FITC та 10 мкл PI-buffer. Після додавали 1 ml Heppes - буфера та аналізуючи проби на проточному цитофлюориметрі EPIX LX-MCL (Beckman Coulter, США).

Оцінка кінцевих стадій апоптозу (конденсації хроматину й фрагментації ядра) включала морфологічні методи - забарвлення цитоцентрифужних препаратів за Май-Грюнвальдом-Романовським-Гімзою. Комплексна оцінка апоптозу включала відсотковий вміст клітин, що знаходяться в стадії апоптозу.

Суспензії лімфоїдних клітин отримували із органів піддослідних тварин за стандартними методиками. Кількість клітин у суспензії підраховували в камері Горєва та доводили до концентрації 2?106 клітин в 1 мл додаванням ФСБ за правилами розведення. Життєздатність клітин в тесті з трипановим синім в середньому складала 91%.

Із клітинних суспензій готували цитоцентрифужні препарати шляхом осадження клітин до 800 об/хв на центрифузі РС-1, які після фіксації 5 хвилин у 70% метанолі і висушуванні на повітрі, далі використовували для цитологічних досліджень.

Досліджували морфологічні зміни при апоптозі: гіперхромність ядер, конденсацію й фрагментацію хроматину, використовуючи класичне забарвлення за Май-Грюнвальдом-Романовським-Гімзою за допомогою бінокулярного мікроскопу "Биолам Р11", (Ломо, Росія).

Розраховували кількість клітин із морфологічними ознаками апоптозу як відсоток клітин із наявністю конденсації й фрагментації хроматину на 100 лімфоцитів.

Для дослідження функціональної активності клітин імунної відповіді використовували методику, основану на проточній лазерній цитометрії (ПЛЦ). Задача ПЛЦ - ідентифікація субпопуляцій клітин, визначення частоти їх спіткання та отримання різних кількісних характеристик субпопуляцій. ПЛЦ опирається на вимірювання деяких властивостей клітин в "проточній системі". Переваги використаного нами методу пов'язані з можливістю дослідження метаболізму окремо взятої клітини, а також з відносною простотою, швидкістю та точністю методу ПЛЦ. Було застосоване двохкольорове забарвлення за допомогою аннексіну V міченого FITС (виробництва Caltag, США), зв'язаного з фосфатидилсерином, що з'являється на поверхні клітин, залучених в апоптоз, а також за допомогою флюорисцентного барвника (РІ). Рівень апоптозу лімфоцитів визначали, аналізуючи проби на проточному цитофлюориметрі EPIX LX-MCL (Beckman Coulter, США), використовуючи програму "System IITM software". Для збудження флюоресценції використовували аргоновий лазер з довжиною хвилі 488 нм. Додатково до флюорисцентних параметрів проводили реєстрацію прямого та бокового світлорозсіювання клітин, що дозволяло виключати з аналізу конгломерати клітин та їх уламки. Підрахунок клітин проводили протягом 120 секунд, при цьому кількість проаналізованих клітин в пробі складала від 3 до 4 тис.

Статистичну оцінку отриманих результатів експерименту проводили за допомогою параметричних та непараметричних методів статистичного аналізу програм "STATISTICA", "MedStat", які дозволяють безпосередньо оцінювати генеральну сукупність вибірок, їх загальні властивості і перевіряти гіпотези щодо них. При цьому обчислення середньої арифметичної (М), середньоквадратичного відхилення (m), вірогідності отриманих результатів проводили за допомогою t-критеріїв Стьюдента. Перевагу в статистичному підході надавали непараметричним методам, ґрунтуючись на їх потужності при невеликих вибірках, можливості застосування при порівнянні вибірок, уникаючи обчислення характеру розподілу величин (Пилипенко М.І. та ін., 2000; Лях Ю.Є. та ін., 2006).

Результати досліджень та їх обговорення

Під час аналізу процесів апоптозу лімфоїдних клітин, враховуючи різні стадії його розвитку, із застосуванням комплексний підходу - визначення експресії апоптотичних маркерів методом ПЛЦ та забарвлення препаратів за МГРГ морфологічним методом (Кайдашев І.П. та ін., 2000), була виявлена наявність клітин, експресуючих на своїй поверхні фосфатиділсерін та клітини з конденсацієї хроматину та фрагментацією ядра. Незважаючи на те, що показники апоптозу мали певний рівень коливань, в цілому отримані дані співпадали з рівнем апоптозу лімфоцитів за даними літератури (Кайдашев І.П. та співав., 2003).

Кількість лімфоцитів на початковій стадії апоптозу становила в середньому 7,7±2,2%, тимоцитів - 9,0±3,9%, спленоцитів - 11,7±2,0% та мононуклеарів периферійної крові 11,7±2,8% відповідно.

Виявилася незначна кількість некротизованих клітин, які загинули внаслідок апоптозу, що склала для лімфоцитів в середньому 2,1±1,9%, тимоцитів - 4,7±4,1%, спленоцитів - 3,0±2,5% та мононуклеарів периферійної крові 3,8±3,1% відповідно.

Клітини з конденсацією хроматину та фрагментацією ядра склали: для лімфоцитів в середньому 9,2±1,8%, тимоцитів - 8,0±2,3%, спленоцитів - 10,0±2,5% та мононуклеарів периферійної крові 10,6±1,9% відповідно.

В теперішній час стало відомо, що невеликий відсоток імунокомпетентних клітин може знаходитися на різних стадіях апоптозу. Цей фізіологічний процес притаманий як клітинам інтактного тимусу, так і мононуклеарам периферійної крові (МНПК) (Кайдашев І.П. та співав., 2003). Отже, в лімфоїдних клітинах існує базальний рівень апоптозу, що, ймовірно, пов'язано з фізіологічною загибеллю імунокомпетентних клітин.

При вивченні дії гістаміну на процеси апоптозу лімфоїдних клітин (лімфоцитів, тимоцитів, спленоцитів та мононуклеарів периферійної крові) у щурів було з'ясовано, що гістамін в дозі 0,1 мкг/кг викликав збільшення кількості клітин, що знаходились на різних стадіях апоптозу, в усіх субклітинних популяціях. Лімфоцити та тимоцити щурів виявилися більш чутливими до гістамін-індукованого апоптозу на ранніх стадіях, ніж спленоцити та мононуклеари. Всі субклітинні популяції показали достовірні зміни прискорення апоптозу на пізніх стадіях процесу (морфологічний метод).

Оцінка апоптозу в різних клітинних популяціях в тесті з аннексином, пропідіумом йодидом та забарвленні за Май-Грюнвальдом демонструє єдину закономірність перебігу процесу апоптозу лімфоїдних клітин у тварин після введення гістаміну. Цікаво, що конденсація хроматину та фрагментація ядра достовірно переважала над анексинV-реактивністю клітин. Іншими словами, ми реєстрували більший відсоток клітин в пізніх стадіях апоптозу. Хоча тест з анексином вважається більш чутливим та реєструє відносно ранню загибель клітин, можна припустити, що гістамін значно прискорював процеси, що призводять до руйнування ядерного матеріалу. Такими механізмами можуть бути критичне зниження трансмембранного електричного потенціалу мітохондрій, вихід в цитоплазму цитохрома С, активація ефекторних каспаз та нуклеаз, що пов'язані з незворотною загибеллю клітини (Zamzami N., Kroemer G., 2003).

Відомо, що взаємодія гістаміну з НR1 веде до активації фосфоліпази-С, збільшенню концентрації інозитолтрифосфата і мобілізації внутрішньоклітинного Ca2+. Зв'язування гістаміну с НR2 стимулює аденілатциклазу, призводячи до зростання рівня цАМФ усередині клітини. Взаємодія гістаміну з НR2 призводить до пригнічення ряду імунологічних функцій: стимуляція CD8+ супресорних Т-лімфоцитів (Т-Лф) веде до пригнічення синтезу антитіл, гальмуванню проліферації Т-Лф, ослабленню опосередкованої Т-Лф цитотоксичності і пригніченню вироблення цитокинов. Гістамін пригнічує виділення ІЛ-12 (Th1 цитокін) і стимулює секрецію ІЛ-10 (Th2 цитокін) (Weltman Joel K., 2000). Можливо припущення, що індукція апоптозу гістаміном пов'язана саме із змінами внутрішньоклітинного кальцію та рівня цАМФ усередині клітини.

В літературних джерелах нами знайдені поодинокі повідомлення про те, що висока концентрація гістаміну в локальному запальному та алергічному вогнищі індукує апоптоз нейтрофілів людини. В експерименті in vitro було визначено, що медіатори цього процесу - активатори каспаз та протеїнкінази С-дельта (Hur J. et all., 2003).

В цілому, перевага конденсації та фрагментації, при відносно незначному підвищенні кількості анексин-позитивних клітин на початковій стадії апоптозу та значному показнику Ан+ПІ+клітин (тобто клітин, що загинули в результаті апоптозу) вказує на закономірну послідовність загибелі лімфоїдних клітин при гістамін-індукованому апоптозі.

Гістамін - потужний біогенний амін, що виробляється тучними клітинами і базофілами, є основним медіатором алергічних реакцій та регулює чимало подій в імунній відповіді (Weltman Joel K., 2000). Гістамін бере участь в регуляції дозрівання клітин імунної системи та змінює їхню активацію, поляризацію, хемотаксис і ефекторні функції (Akdis C.A., Blaser K., 2003). Гістамін також регулює дозрівання дендритних клітин і змінює їхню T- поляризуючу здатність (Idzko M. et al., 2002; Jutel M. et. al., 2002).

Гістамін індукує декілька систем сигнальної трансдукції: фосфоліпазну та аденілатциклазну, які беруть безпосередню участь в реалізації програм апоптозу лімфоїдних клітин (Кайдашев І.П. та ін., 2004), та реалізує свої функції за допомогою чотирьох субтипів рецепторів (Church M.K., 2004). Гістамінові рецептори експресовані не тільки на поверхні нейтрофілів, але майже на всіх клітинах імунної системи - базофілах, еозинофілах, опасистих клітинах, макрофагах, епітеліальних клітинах, ендотеліальних клітинах, лімфоцитах (Bachert C., 2002; Scheider E. et. al., 2002), отже, ймовірно, модулюють і функції імунокомпетентних клітин.

При з'ясувані впливу блокатора Н1-гістамінових рецепторів дезлоратадину на процеси апоптозу лімфоїдних клітин в мінімальній, середній та максимальній дозах - 0,007 мг/кг, 0,07 мг/кг та 0,7 мг/кг маси тіла, який тварини отримували перорально з інтервалом 24 години протягом 10 діб, було показано, лімфоцити та тимоцити щурів відповідали незначним збільшенням відсотку клітин на ранніх стадіях апоптозу, достовірним збільшенням відсотку клітин з морфологічними ознаками апоптозу за рахунок конденсації хроматину та дозозалежного зменшення відсотку апоптотичних клітин на пізніх стадіях процесу. Таким чином, з підвищенням дози селективного Н1-блокатору дезлоратадину зменшувався відсоток залучених в апоптоз клітин та зростав відсоток апоптотичних клітин на пізніх стадіях процесу.

При дослідженні спленоцитів та МНПК щурів з'ясувалося, що препарат призводить до дозозалежного зменшення відсоток апоптотичних клітин на ранніх та пізніх стадіях процесу та незначного збільшення відсотку клітин з морфологічними ознаками апоптозу за рахунок конденсації хроматину. Таким чином, з підвищенням дози селективного Н1-блокатору дезлоратадину зменшувався відсоток залучених в апоптоз спленоцитів та МНПК та зростав відсоток апоптотичних клітин на пізніх стадіях процесу, що говорить про інгібіруючий вплив Н1 блокади на апоптоз.

Таким чином, результати дослідження процесів апоптозу лімфоїдних клітин у щурів при застосуванні селективного блокатору H1-гістамінових рецепторів дезлоратадину проказали, що препарат викликав модуляцію апоптозу в усіх клітинних субпопуляціях як на ранніх, так і на пізніх стадіях апоптотичного процесу. Процес виявився дозозалежним: з підвищенням дози препарату зменшувався відсоток залучених в апоптоз клітин. Дезлоратадин призводив до дозозалежної інгібіції ранніх та пізніх стадій апоптозу спленоцитів і МНПК, та пізніх стадій апоптозу лімфоцитів і тимоцитів.

З метою визначення ролі гістамінових рецепторів II типу в регуляції процесів апоптозу лімфоїдних клітин було застосовано селективний Н2-блокатор фамотидін в мінімальній, середній та максимальній дозах, який тварини отримували per os протягом 10 діб. Отримані результати порівнювали з показниками в інтактгній групі.

Результати дослідження процесів апоптозу ЛК при застосуванні фамотидіну проказали, що препарат викликав індукцію апоптозу в усіх клітинних субпопуляціях. Процес виявився дозозалежним: з підвищенням дози препарату зростав відсоток залучених в апоптоз клітин. Фамотидін призводив до індукції апоптозу як на ранніх, так і на пізніх стадіях апоптотичного процесу. Найбільш чутливими до фамотидін-індукованого апоптозу виявилися лімфоцити з фракції мононуклеарів периферійної крові.

До теперішнього часу панувала думка, що гістамінові рецептори постійно знаходяться в межах мембрани клітини в стані повного спокою. Однак, завдяки нещодавнім дослідженням стало відомо, що подібно до більшості інших рецепторів, пов'язаних з G-білком (GPCRs), Н-рецептори існують в рівновазі між їхніми бездіяльними та активними конформаціями (Bakker R.A. et. al., 2002). Антигістамінні препарати можуть взаємодіяти з рецепторами двома можливими шляхами. Діючи як зворотні агоністи, вони з'єднуються з та стабілізують бездіяльну ділянку рецептора, зсуваючи рівновагу до пасивного стану. Таким чином, їх ефекти також залежать від концентрації. Альтернативно, антигістаміни можуть діяти як нейтральні антагоністи. Нейтральний антагоніст з'єднується однаково добре і з активними і з пасивними конформаціями Н-рецептора. Роблячи це, він не заторкує конститутивну активність рецептора, але дійсно стикається із зв'язуванням агоніста.

Оскільки в нашому експерименті не були використані агоністи гістаміна, можливо припущення, що фамотидін діяв як зворотній агоніст, зсуваючи рівновагу Н2-рецепторів до бездіяльного стану. При цьому Н1-гістамінові рецептори залишалися "включеними". Більшість відомих ефектів гістаміна проявляється при його дії на Н1-рецептор (Grant J.Andrew, 2000). Можливо, що апоптоз-індукуюча дія фамотидіну повязана з впливом ендогенного гістаміна, взаємодіючого з Н1-рецептором.

Дія Н2-блокаторів, скоріше за все, опосередкована через мембранні структури живих клітин. При цьому спостерігається специфічне блокування ділянок плазматичної мембрани, що сприймають різноманітні стимули. Механізми такої дії проявляються в присутності іонів кальцію (Хомерики С.Г., Хомерики Н.М., 2002).

Як відомо, за допомогою іонів кальцію регулюється активність протеїнкінази С - представника родини серін/треонін кіназ (Shtonda В.B. et. al., 1999), котрій належить провідна роль в реалізації процесів апоптозу. Показано, що активація протеїнкінази С призводить до пізнього фосфорилювання цитоплазматичних та ядерних білків - факторів виживання, що призводить до апоптозу.

Існування чисельних Ca2+ - залежних систем індукції апоптозу визначає одну з ключових ролей кальцію, як вторинного месенджера деяких видів клітинної загибелі. Була доведена роль кальцію в глюкокортикоїдному та опосередкованому через Т-клітинний рецептор апоптозі. Встановлено, що при значному підвищенні рівня кальцію в клітині активується ендонуклеаза. В процесі деградації геному показана участь ендонуклеазної та ендопротеолітичної активності. Фіналом цього процесу є деградація ДНК під дією ендогенних Ca2+ та Mg2+-залежних ендонуклеаз (Сухих Т.Г. и др., 2000). З'ясовано, що Ca2+ та Mg2+-залежна ендонуклеазна активність максимальна в тимусі та нирках. Вважають, що кальцій, як універсальний вторинний месенджер, відіграє важливу роль в реалізації програмованої клітинної загибелі.

Можливо припущення, що індукція апоптозу фамотидіном пов'язана зі змінами концентрації внутрішньоклітинного кальцію та активацією протеїнкінази С.

Таким чином, результати дослідження процесів апоптозу лімфоїдних клітин у щурів при застосуванні селективного блокатору H2-гістамінових рецепторів фамотидіну проказали, що препарат викликав індукцію апоптозу в усіх клітинних субпопуляціях. Процес виявився дозозалежним: з підвищенням дози препарату зростав відсоток залучених в апоптоз клітин. Фамотидін призводив до індукції апоптозу як на ранніх, так і на пізніх стадіях апоптотичного процесу. Найбільш чутливими до фамотидін-індукованого апоптозу виявилися лімфоцити з фракції мононуклеарів периферійної крові.

Застосування Н3-блокатору тіопераміду в дозі 10 мг/кг маси тіла мишам інтраперітонеально протягом 10 днів призвело до значних змін показників апоптозу. Так, відсоток клітин початкової стадії ймовірно зменшився у МНПК до 1,5%, С - 0,5%. Достовірно збільшився відсоток клітин пізньої стадії апоптозу: МНПК - 5%, С - 6,5%.

Таким чином, блокада HR3 призвела до модуляції апоптозу ЛК, уповільнюючи початок вступу в апоптоз, але прискорюючи безпосередньо процес програмованої загибелі клітин.

Дослідження впливу HR3-блокатора на рівень апоптозу лімфоїдних клітин в експерименті in vitro шляхом інкубації мононуклеарів периферійної крові людини у кінцевій концентрації 106/мл у поживному середовищі із стерильним забуференим фізіологічним розчином (контроль) та з тіоперамідом в концентраціях 1 µM, 10 µM та 100 µM в двох паралелях 24, 48 та 72 год показало наступне.

Через 24 години інкубації клітин з тіоперамідом препарат призвів до дозозалежного ймовірного зменшення відсотку клітин як початкової, так і кінцевої стадії апоптозу. При дослідженні через 48 годин інкубації було з'ясовано, що тіоперамід призвід до дозозалежного ймовірного зменшення відсотку клітин кінцевої стадії апоптозу. Відсоток апоптотичних клітин при застосуванні тіопераміду в дозі 1 µM зменшився, при застосуванні тіопераміду в дозі 10 µM збільшувався, а при застосуванні тіопераміду в дозі 100 µM знову зменшувався. Через 72 години інкубації клітин з тіоперамідом препарат призвів до дозозалежного ймовірного збільшення відсотку клітин на початковій стадії апоптозу, та зменшення відсотку клітин на кінцевій стадії апоптозу.

При порівнянні даних експериментів in vivo та in vitro видно, що тіоперамід по-різному впливає на процеси апоптозу ЛК в організмі та на відокремлені клітини. В організмі Н3 блокатор уповільнює початок вступу в апоптоз, але прискорює безпосередньо процес програмованої загибелі клітин. І навпаки, в ізольованих клітинах через 24 години інкубації клітин з тіоперамідом препарат призводить до дозозалежного ймовірного збільшення відсотку клітин на початковій стадії апоптозу, та зменшення відсотку клітин на кінцевій стадії апоптозу.

Можна припустити, що дія препарату на рівень апоптозу лімфоїдних клітин, ізольованих від будь-яких інших впливів, в експерименті in vitro пов'язана з безпосереднім впливом Н3-блокатору на клітини, оскільки зміни апоптозу залежали як від дози, так і від часу інкубації.

Відомо, що Н3 рецептор являється пресинаптичним рецептором для гістаміну і виражений переважно в центральній нервовій системі. Він функціонує переважно як ауторецептор, модулюючи синтез та вивільнення гістаміну нервовими синапсами. Також відомо, що при стимуляції Н3-рецепторів гальмується вивільнення із нервових закінчень деяких медіаторів, включаючи гістамін. Можна припустити, що в нашому експерименті in vivo блокада гістамінових рецептори Н3 призвела до посиленого синтезу гістаміну, який вплинув на апоптоз шляхом прискорення пізніх стадій процесу.

Відомо, що Н3 рецептори експресуються в постгангліонарних холінергічних нервах бронхів, а їх стимуляція відіграє захисну роль від надмірної бронхообструкції (Drutel G. et al., 2001). Існують дані, які свідчать про гетерогенність активності Н3 рецепторів, що обумовлює індукцію інших амінонейротрансміттерів, включаючи норадреналін, допамін, серотонін та ацетилхолін.

На поверхні еозинофілів відмічена експресія Н3 рецептора, який за своєю характеристикою та функцією відрізняється від такого в центральній нервовій системі і приймає участь в регуляції хемотаксису еозинофілів (Buckland K.F. et al., 2003; P. Ling et al., 2004).

Узагальнюючи дані літератури та отримані результати наших досліджень дозволяють міркувати, що блокада Н3-гістамінових рецепторів задіяна в регуляції апоптотичних процесів лімфоцитів, що відкриває нам ще один шлях для дослідження складних механізмів програмованой загибелі імунокомпетентних клітин та нових можливостей терапевтичних втручань.

Сьогодні порушення процесів апоптозу розглядають як важливий фактор патогенезу атопічної бронхіальної астми. Достатньо факторів підтверджує, що накопичення активованих лімфоцитів у дихальних шляхах спричинене пригніченням апоптозу клітин та призводить до пролонгації і хронізації запальних процесів у хворих на БА. Однак, механізми стійкості лімфоцитів до апоптозу залишаються до кінця не з'ясованими.

Визначаючи зміни апоптотичних процесів при розвитку алергічного запалення на експериментальній моделі бронхіальної астми, викликаної сенсибілізацією тварин до овальбуміну, спостерігали збільшення відсотку клітини на початковій стадії апоптозу та вірогідне зменшення відсотку клітин на пізніх стадіях апоптозу.

В літературі повідомлено, що в опитах на мишах, попередньо сенсибілізованих овальбуміном (ОVA), після інгаляції розрішальної дози антигену, кількість еозинофілів в легенях досягало максимуму до 3-7го дня та поверталося до нормальних значень лише до 14 доби. Інгаляція ОVA супроводжувалася підвищенням кількості CD4+ Т-лімфоцитів. Кількість еозинофілів, що мали ознаки апоптозу, залишалось стабільним на протязі 3 днів з моменту провокації та досягало максимуму до 7 доби. Морфологічні зміни у даного типу клітин також свідчило на користь апоптотичних процесів, що відбувалися в них. Так, у гранулоцитів спостерігалися ознаки конденсації ядерного хроматину, а навкруги апоптотуючих еозинофілів спостерігалися апоптотичні тільця, що прглиналися тканинними макрофагами (Kodama T. et al., 1998).

Наведені дані свідчать про те, що шляхом запуску процесів апоптозу в нормі відбувається елімінація з тканин клітин, що мігрували із циркуляторного русла.

Виходячі з цього, можна припустити, що наявність при атопічних захворюваннях в органах-мішенях тривало-існуючих клітин регуляторного та ефекторгого ланцюгів може бути обумовлено не лише підвищеною міграцією останніх а тканини, але і гальмуванням їх елімінації внаслідок порушення процесів апоптозу.

З літературних джерел відомо, що при АБА відбувається суттєва затримка апоптозу як лімфоцитів, так і нейтрофілів (Минеев В.Н. та ін., 2003). Феномен затримки апоптозу як лімфоцитів, так і еозинофілів описаний раніше при АБА та при еозинофільному бронхіті (Kankaanranta H. et al., 2000). Порушення апоптозу цих клітин чи зростання їх життєздатності вважають важливим, ключовим фактором патогенезу при АБА.

Відомо також, що лімфоцити синтезують широкий спектр біологічно-активних речовин та цитокінів (IL-3, IL-5 та ін.), які сприяють міграції в тканини еозинофілів, що обумовлюють тривалий характер перебігу АБА (Бойчук С.В. та ін., 2001).

Механізми, що лежать в основі затримки апоптозу лімфоїдних клітин при АБА, досі нез'ясовані, але можливо припущення, що при АБА порушується процес між індукторами апоптозу, та факторами, що сприяють виживанню клітин.

Літературні джерела повідомляють, що фрагментація ДНК у лімфоцитів хворих БА відбувається на більш пізніх строках в порівнянні з лімфоцитами донорів, спостерігається у меншого відсотка клітин та корелює зі зниженням рівнів мітохондріального потенціалу (МП) (Бойчук С.В. та ін., 2002). Досліджено, що Лф з нормальним рівнем МП практично не експресують на своїй поверхні фосфатиділсерін. Зниження рівнів МП Лф передує появі ФС на клітинній поверхні (Бойчук С.В. та ін., 2003). Але припускають, що наявність дефектів в каскаді реакцій відбувається після залучення мітохондрій в процесс апоптозу.

Підвищена стійкість ДНК лімфоцитів при БА може бути обумовлена кількісними та якісними змінами в біологічно-активних речовинах (БАР), що вивільняються з мітохондрій після зниження їх трансмембранного потенціалу. До цих речовин відносяться апоптоз-індукуючий фактор, цитохром С, керамід, каспази 2 та 9 та ін. Ці БАР призводять до наступної активації каспаз або безпосередньо викликають апоптотичні зміни клітинного ядра. Враховуючи широкий спектр БАР, що поступають в цитоплазму після підвищення проникливості мітохондріальної мембрани, неможливо точно визначити, який саме дефект лежить в основі підвищеної стійкості Лф до процесів апоптозу. Крім того, більш пізня фрагментація ДНК лімфоцитів при БА може бути обумовлена змінами активності різноманітних типів ДНК-аз, що безпосередньо розщеплюють ДНК та забезпечують третю, заключну стадію апоптозу - стадію деградації. Вивільнення з мітохондрій апоптогенних факторів, наприклад, цитохрому С, блокується гіперекспресією при БА білка bcl-2 (Бойчук С.В. та ін., 2002, 2003).

В експериментах встановлена інгібіторна дія сироватки хворих на АБА на апоптоз МНПК хворих на АБА і здорових людей, індукованого зв'язуванням молекул CD95 та до Fas-індукованого апоптозу при незначному зниженні експресії Bcl-2 та підвищенні експресії p53 (Мамонтова Т.В., Кайдашев І.П., 2004; 2005).

Під час експериментальних досліджень загострення бронхіальної астми, викликаної фізичним навантаженям або інгаляцією алергенами, відмічено підвищення рівня гістаміну в циркулюючій крові, а також доведена його роль в механізмах розвитку бронхообструкції. Є дані, що у хворих під час приступів значно вищій рівень нейромедіатору в бронхоальвеолярній рідині, ніж під час ремісії захворювання (Kay A.B., 2001). Подібно попереднім дослідженням, інгаляції алергенів у сенсибілізованих хворих алергічним ринітом призводили до підвищення рівня гістаміну в носовому секреті, що обґрунтовує ключову роль нейромедіатору в патофізіології даного захворювання (Togias A., 2000). У хворих з холодовою кропив'янкою після охолодження шкіри крижаною водою відмічалося швидке підвищеня рівня гістаміну в плазмі крові вже через 2 хвилини, максимальні зміни - через 5 хвилин, а через 15-20 хвилин після проби - повернення до початкового рівня. При цьому підвищення медіатору відмічалось як у пошкоджених, так і в здорових ділянках шкіри, порівнюючи зі здоровими особами. Отримані результати підтверджують провідну роль медіатору при алергічному запаленні у хворих з хронічною кропив'янкою (Friedmann P.S., 1999).

За літературними даними результати досліджень вітчизняних та зарубіжних дослідників Н рецепторів, які експресуються на поверхні більшості клітин, а тому числі і на імуноцитах, свідчать про більш широку та критичну роль гістаміну при алергічному запаленні (Кайдашев І.П., Куценко Н.Л., 2004). Виникає припущення, що антигістамінні препарати мають більш розширений вплив на ефекти клітин імунної відповіді та на процеси алергічного запалення.

Для дослідження впливу селективного Н1-блокатора гістамінових рецепторів на апоптоз лімфоїдних клітин при атопії був застосований дезлоратадин в дозі 0,07 мг/кг маси тіла тварини перорально з інтервалом 24 години протягом 10 днів з моменту появи проявів бронхіальної астми.

Незважаючи на зростаючу кількість доказів про прямі та опосередковані ефекти гістаміну на функціональну активність імунокомпетентних клітин залишаються домінуючими припущення про те, що більшість з вивчених протизапальних ефектів нових антигістамінних препаратів є результатом їх взаємодії з Н1 рецепторами, а не з іншими негістаміновими рецепторами (Church M.K., 1999).

Результати проведених досліджень зарубіжними вченими свідчать, що більшість протизапальних ефектів цих препаратів, враховуючи їх структуру та катіонну активність, не обумовлені зв'язуванням з Н1 рецепторами та блокадою передачі сигналу, а є неспецифічними. Отримані дані базуються на іонній асоціації антигістамінних препаратів з клітиними мембранами, на пригніченні активності мембранно-зв'язаних ферментів та на підставі зменшення концентрації зв'язаного Са2+.

У нещодавніх повідомленнях знову були охарактеризовані основні механізми та клінічна доцільність протизапальних ефектів антигістамінних препаратів, ґрунтуючись на сучасних даних (Church M.K., 2001). Проведені дослідження SV40-фіксованих клітин показали, що транзиторна експресія Н1 рецепторів клітин людського організму є результатом агоніст-незалежної активації біохімічного каскаду з залученням вторинного месенджера ІФ3. ця активація Н1 рецепторів пригнічується під час впливу деяких Н1-антигістамінних препаратів. Таким чином, ці дані вказують на наявність рівноваги між активними та неактивними формами Н1 рецепторів (Leurs R. et. al., 2002).

Гістамін, взаємодіючи з рецепторами, виконує роль агоніста. Він поєднується з активними ділянками рецепторів та стабілізує їх, таким чином зсуваючи рівновагу в бік активізованих форм Н рецепторів (Bakker R.A. et. al., 2000). Таким способом гістамін дозозалежно стимулює функцію клітин.

На відміну цьому, антигістамінні препарати можуть взаємодіяти з рецепторами двома можливими шляхами. Діючи як зворотні агоністи, вони з'єднуються з неактивними формами рецептора та стабілізують його, призводячи до зсуву рівноваги в бік неактивних форм. При цьому, їх ефекти також залежать від концентрації. Крім того, Н1 антигістамінні препарати, виступаючи в ролі зворотніх агоністів, можуть мати пригнічуючи ефекти навіть при відсутності зворотньорегулюючоговпливу гістаміну на активність рецепторів. Як відомо, усі вивчені на сьогоднішній день Н1-антигістаміни (включаючи цетирізін, лоратадин) є зворотніми антагоністами.

Альтернативно, антигістаміни можуть діяти як нейтральні антагоністи. Нейтральний антагоніст з'єднується однаково добре і з активними, і з пасивними конформаціями Н-рецептора. Роблячи це, вони не заторкують конститутивну активність рецептора, але дійсно перешкоджають взаємодії агоністів. Представником нейтральних агоністів є Н2-антагоніст - бурімамід. Серед Н1-антагоністів на сьогоднішній ден не ідентифіковані нейтральні антагоністи (Bakker R.A. et. al., 2002).

Є дані, які свідчать про стимулюючі ефекти гістаміну та блокуючи ефекти Н1-антигістамінних препаратів на активність розповсюдженого фактору транскрипції NF-кв, ?кий з'єднується з промоторами багатьох генів і в результаті цього регулює продукцію значної кількості прозапальних цитокінів та адгезивних молекул, включаючи внутрішньоклітинну адгезивну молекулу-1 (Bakker R.A. et. al., 2001). Як Н1-рецепція, так і регуляція цитокінів і адгезивних білків фактором NF-kB задіяні при алергічних станах (Arnold R., Rihoux J., Konig W. Cetirizine counter-regulates interleukin-8 release from human epithelial cells (A549) // Clin. Exp. Allergy. - 1999. - Vol. 29. - P.1681-1691.). Існує думка, що Н1-блокатори пригнічують передачу Ca2+-залежних сигналів, перешкоджаючи надходженню Ca2+ в клітину та пригнічують активність транскрипційних факторів NF-_kB, NF-АТ, АР-1, що задіяні в синтезі цитокінів (Graziano Frank M. et. al., 2000).

Таким чином, враховуючи агоніст-незалежну активацію в результаті стимуляції NF-kB під впливом антигістамінних препаратів та зворотньорегуляторний вплив низьких концентрацій деяких Н1 антигістамінів на експресію цього транскрипційного фактору паралельно з пригніченням синтезу прозапальних цитокінів (ІЛ -1в, ІЛ-6, ІЛ-8, ФНП-б та ГК-КСФ) проти алергічні/протизапальні ефекти цих препаратів обумовлені як рецептор залежними, так і рецепторнезалежними механізмами. Порівнюючи їх, відмічено, що рецепторнезалежні механізми протизапальних ефектів потребують більш високих концентрацій антигістамінних препаратів (Bachert C., 2002).

Доклінічні дослідження селективного блокатора гістамінових рецепторів Н1 дезлоратадину показали, що він пригнічує активність більшості медіаторів, які беруть участь у розвитку алергічного запалення, включаючи цитокіни і хемокіни, а також зменшує експресію молекул адгезії. Відмічено, що дезлоратадин в низьких (мікромолярних) концентраціях пригнічує вивільнення первинних (гістаміну, триптази) та вторинних (простагландіну D2, лейкотрієнуD4) медіаторів з тучних клітин легень та шкіри людини. Відомо, що під впливом препарату зменшується продукція інтерлейкінів 4, 6, 8, 13, фактору некрозу пухлини б, гранулоцитарно-макрофагального колонієстимулюючого фактору мастоцитами та базофілами in vitro. Є дані, що дезлоратадин пригнічує вивільнення хемокіну RANTES із епітелію поліпів носу, а також зменшує експресію адгезивних молекул (Р-селектину, ICAM-1) епітелію дихальних шляхів у хворих бронхіальною астмою (Kreutner W. et. al., 2000).

В результаті застосування дезлоратадину у щурів з БА відмічалися зміни апоптотичного процесу всіх субпопуляцій ЛК. Так, % клітин на початковій стадії апоптозу (АнV+) вірогідно зменшився у порівнянні з показниками при БА та вірогідно не відрізнявся від показників в інтактній групі. Вірогідно збільшився % клітин на пізній стадії (АнV+ПЙ+) та % клітин з морфологічними ознаками апоптозу в порівнянні з показниками при БА. Але при порівнянні з інтактною групою відсоток клітин на пізніх стадіях апоптозу після застосування дезлоратадину залишався вірогідно зменшеним. Таким чином, дезлоратадин призвів до корекції апоптотичних процесів при АБА та наблизив показники до відповідних у здорових щурів. Найбільш чутливими виявилися спленоцити та лімфоцити.

Дослідження застосування фамотидіну в дозі 0,6 мг/кг маси тіла тварини перорально з інтервалом 24 години протягом 10 днів з моменту появи проявів бронхіальної астми у щурів, показали зміни апоптозу на всіх стадіях в усіх субпопуляціях ЛК. Фамотидін призвів до корекції апоптотичних процесів при АБА та наблизив показники до відповідних у здорових щурів. Кількість лімфоцитів на всіх стадіях апоптозу після застосування фамотидіну вірогідно не відрізнялася від показників в інтактній групі. Спленоцити та МНПК на початковій стадії виявився найбільш чутливими.

Зв'язаний з G білком Н2 гістаміновий рецептор також належить до GPCRs. Його активація призводить до модуляції клітинної відповіді в результаті підвищення вмісту циклічної аденозинмонофосфорної кислоти (цАМФ) усередині клітини (Del Valle J., Gantz I., 2001).

Активація Н2 рецепторів гістаміном особливо важлива при стимуляції секреції шлункового соку парієтальними клітинами, а також пов'язане з цим підсилення секреції слизу в дихальних шляхах, затруднене носове дихання та послаблення гладеньких м'язів дистальних відділів дихальних шляхів (Bachert C. 2002).

Взаємодія гістаміну з НR2 призводить до пригнічення ряду імунологічних функцій: стимуляція CD8+ супресорних Т-лімфоцитів (Т-Лф) веде до пригнічення синтезу антитіл, гальмуванню проліферації Т-Лф, ослабленню опосередкованої Т-лімфоцитотоксичності і гнобленню вироблення цитокинов. Гістамін пригнічує виділення ІЛ-12 (Th1 цитокін) і стимулює секрецію ІЛ-10 (Th2 цитокін) (Weltman Joel K., 2000).

А.К. Moharana та співавт. вивчали роль H1- і H2-рецепторів гістаміна в нейро-імунному регулюванні у щурів. Тільки антагоністи H2-рецептора заподіювали статистично істотне збільшення і гуморальної і клітинної імунної відповіді, у той час як блокатори H1-рецептора були не в змозі змінити те ж саме. Таким чином, H2-рецептори, напевно, відіграють головну роль у гістамінергічних механізмах, задіяних в імуномодуляції на рівні імунокомпетентних клітин. Вони активні у периферичних тканинах так само, як у центральних структурах нервової системи, що задіяні в центральному регулювання нейроімунної взаємодії (Moharana A.K. et. al., 2000).

Гістамін підсилює відповіді T1-типу, через H1R гістаміновий рецептор, тоді як відповіді і Th1- і Th2-типу, негативно регулюються H2R через активацію різних біохімічних внутрішньоклітинних сигналів (Jutel M. et. al., 2001).

Гістамін, взаємодіючи з лімфоцитами, які експресують переважно Н2 рецептори, стимулює синтез та вивільнення фактору хемотаксису лімфоцитів, а під час взаємодії з Н1 експресуючими лімфоцитами - до вивільнення 2 видів факторів гальмуючих міграцію лімфоцитів (Bachert C., 2002). Ці результати призвели до висновку, що синтез факторів гальмуючих міграцію лімфоцитів відіграє важливу роль у затримці ефекторних Т лімфоцитів в зоні запалення та, відповідно, у підсиленні процесів запалення.