Морфофункциональные характеристики синусно-предсердного узла сердца крысы

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

03.03.01 - Физиология

03.03.04 - Клеточная биология, цитология, гистология

Морфофункциональные характеристики синусно-предсердного узла сердца крысы

Сутягин Павел Валентинович

Москва - 2010

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор Камкин Андрей Глебович

доктор биологических наук, профессор Пылаев Александр Сергеевич

доктор медицинских наук, профессор Гурина Ольга Юрьевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Мирзоян Рубен Симонович

доктор биологических наук, профессор Смирнов Виктор Михайлович

доктор биологических наук, профессор Кругляков Павел Павлович

Ведущая организация:

Московский Государственный Университет имени М.В. Ломоносова

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук, доцент Т.Е. Кузнецова

1. Общая характеристика работы

сердце крыса рецепторный

Актуальность исследования. К настоящему времени хорошо известно, что синусно-предсердный узел млекопитающих построен двумя основными типами клеток-водителей ритма - истинными и латентными, отличающимися друг от друга по основным характеристикам их потенциалов действия, однако проблемы морфо-функциональной организации этого образования и, особенно, нейро-гуморальной регуляции сердечного ритма до сих пор исследованы весьма фрагментарно. Кроме того, количество видов млекопитающих, у которых исследованы клетки-водители ритма, невелико. При этом подавляющая масса работ была выполнена на синусно-предсердном узле кролика [Boyett M.R. et al., 2000; Mangoni M. et Nurgeot J., 2008; Opthof T., 1988]. Морфологами за истекший период также исследованы синусно-предсердные узлы ряда видов млекопитающих, описана ультраструктура клеток, входящих в их состав, особенности пространственной организации этих образований, их кровоснабжение, нейро-тканевые взаимоотношения и распределение рецепторных структур внутри них [Павлович Е.Р., 2003; Anderson R.H., 2009; James T.N., 2002]. Методы исследования, основанные на изучении строения и параметров электрической активности ферментативно диссоциированных клеток синусно-предсердных узлов и включающие иммуногистохимические методы, внесли определенные коррективы в наши представления о функциональной значимости, распределении и экспрессии в пределах узла ионных каналов, различных типов коннексинов, рецепторов и прочих белков, обеспечивающих специфическое функционирование клеток-водителей ритма. Изучение распределения в пределах синусно-предсердных узлов кролика и мыши различных типов коннексинов выявило наличие коннексина Сх43 в центральной части. На основании этих данных и данных морфологического исследования ферментативно диссоциированных клеток был сделан вывод о протрузии рабочих атриальных кардиомиоцитов в центральную часть узла и предложена «мозаичная» модель строения синусно-предсердного узла [Verheijck E.E. et al., 1998, Vercheijck E.E. et al., 2001] в противовес сложившейся «градиентной модели» [Boyett M.R. et Dobrzynski H., 2007]. В сложившейся ситуации появилась необходимость детального электронно-микроскопического изучения взаимоотношений разных типов кардиомиоцитов в пределах узла.

В процессе жизнедеятельности организма под влиянием факторов внешней и внутренней среды постоянно происходят процессы модуляции частоты сердечных сокращений под воздействием всевозможных гуморальных факторов и импульсов автономной нервной системы. Эти изменения определяются плотностью иннервации синусно-предсердного узла, степенью равномерности (или неравномерности) иннервации разных его отделов, а также характером распределения на цитолеммах кардиомиоцитов разных частей узла рецепторных структур, способных воспринимать эти регуляторные воздействия. Однако на фоне большого числа работ, посвященных особенностям их автономной иннервации (представленности в ткани узла чувствительных, пре- и постганглионарных волокон симпатического и парасимпатического отделов вегетативной нервной системы, плотностям иннервации различных частей узла, количественной и качественной представленности нейротрансмиттеров в этих волокнах) существует незначительное число работ, посвященных количественному распределению основных рецепторных (холино- и адренорецепторных) структур в пределах синусно-предсердного узла [Beau S.L. et al., 1995; Hancock J.C. et al., 1987; Kurogouchi F. et al., 2002; Saito K. et al., 1994; Saito K. et al., 1989]. Количественные данные по распределению в ткани узла дофаминовых рецепторов и рецепторов к котрансмиттерам пептидной природы, выявленных в отростках нейроцитов автономной нервной системы, вообще отсутствуют.

Наличие артерии, проходящей через центральную часть синусно-предсердного узла, накладывает целый ряд особенностей на его архитектонику, функционирование и регуляцию деятельности. В частности, пульсовые толчки, ритмично деформирующие стенку артерии синусно-предсердного узла, оказывают модулирующее действие на работу клеток-водителей ритма [James T.N., 2003]. У наиболее часто используемых физиологами объектов исследования - кролика и морской свинки - такая артерия отсутствует, в то время как у большинства млекопитающих, в том числе человека и крысы синусные узлы организованы вокруг артерии.

Таким образом, в настоящее время проблема пространственной организации синусно-предсердного узла сердца крыс, особенностей взаимоотношений разных типов кардиомиоцитов внутри узла, морфологических основы обеспечения функционирования синусно-предсердного узла как целого и регуляции сердечной хронотропии, а также морфо-функциональных изменений в ткани синусно-предсердного узла, происходящих в процессе старения остается актуальной. Особенно важно изучение структуры и функционирования синусно-предсердного узла в процессе старения, поскольку основной контингент пациентов, обращающихся за медицинской помощью в настоящее время, - это люди пожилого возраста.

Цель исследования состояла в комплексном электрофизиологическом и морфологическом изучении клеток-водителей ритма синусно-предсердного узла сердца крыс для построения пространственной модели узла с указанием топографической локализации клеток-водителей ритма с различными формами потенциалов действия и распределением плотностей рецепторных образований к основным медиаторам автономной нервной системы, а также исследование механизмов регуляции сердечного ритма ацетилхолином и норадреналином и выявление изменений, происходящих в синусно-предсердном узле в процессе старения.

В задачи исследования входило:

- получить количественные показатели электрической активности клеток-водителей ритма синусно-предсердного узла сердца крыс;

- картировать распределение клеток-водителей ритма вдоль артерии синусно-предсердного узла и определить топографические ориентиры местоположения доминантного пейсмекерного региона;

- установить пространственное взаиморасположение разных типов клеток-водителей ритма и рабочих атриальных кардиомиоцитов в области синусно-предсердного узла;

- исследовать и количественно оценить эффект передвижения доминантного пейсмекерного региона in vitro в ответ на введение возрастающих концентраций норадреналина;

- исследовать влияние in vitro возрастающих концентраций ацетилхолина на эффект передвижения доминантного пейсмекерного региона;

- авторадиографически исследовать распределение плотностей рецепторных структур, ответственных за связывание ацетилхолина, норадреналина, дофамина и энкефалинов в ткани центральной части синусно-предсердного узла;

- построить пространственную морфофункциональную схему синусно-предсердного узла сердца крысы с указанием локализации клеток-водителей ритма с разными формами потенциалов действия и распределением плотностей рецепторных структур;

- установить характер морфофункциональных изменений, происходящих в синусно-предсердном узле в процессе старения.

Научную новизну работы определяют следующие результаты проведенных исследований:

- показана топография распределения разных типов клеток-водителей ритма вдоль артерии синусно-предсердного узла;

- установлены закономерности пространственного взаиморасположения различных типов клеток-водителей ритма и рабочих атриальных кардиомиоцитов в области синусно-предсердного узла;

- уточнены характеристики электрической активности клеток-водителей ритма синусно-предсердного узла сердца крыс;

- выявлены морфологические ориентиры местоположения доминантного пейсмекерного региона (местоположения истинных клеток-водителей ритма);

- определены параметры передвижения доминантного пейсмекерного региона в ответ на введение возрастающих концентраций норадреналина;

- определены параметры передвижения доминантного пейсмекерного региона в ответ на введение возрастающих концентраций ацетилхолина;

- показано распределение плотностей М-холинорецепторов, в-адренорецепторов, дофаминовых и опиоидных рецепторов в центральной части синусно-предсердного узла;

- установлена связь между передвижением доминантного пейсмекерного региона в ответ на введение норадреналина и ацетилхолина и распределением плотностей рецепторов к этим медиаторам;

- построена пространственная схема организации синусно-предсердного узла крыс, впервые включающая как особенности взаиморасположения различных морфофункциональных типов клеток-водителей ритма и рабочих атриальных кардиомиоцитов, так и закономерности распределения рецепторных структур к основным медиаторам автономной нервной системы в топографически определенной области, занятой этим образованием проводящей системы сердца;

- выявлены ранее неизвестные закономерности морфо-функциональных изменений, происходящих в синусно-предсердном узле в процессе старения.

Научно-практическую значимость исследования составляют уточненные количественные характеристики потенциалов действия клеток-водителей ритма синусно-предсердного узла сердца крыс, топография распределения клеток-водителей ритма с различными типами потенциалов действия в пределах узла, наличие точного морфологического ориентира доминантного пейсмекерного региона, характеристики распределения рецепторных структур в пределах узла и морфо-функциональные механизмы, лежащие в основе регуляции сердечного ритма. Наличие морфо-функциональной модели синусно-предсердного узла сердца крыс в совокупности с количественными характеристиками элементов ее составляющих, в том числе и в стареющем организме, создает научно-практическую базу для работы с препаратами синусно-предсердного узла сердца крыс в иммуногистохимических исследованиях, фармакологических испытаниях кардиотропных препаратов и дальнейших исследованиях в области механизмов пейсмекинга и возникновения аритмий. Ряд результатов работы - цитофизиологические характеристики клеток-водителей ритма, нейро-тканевые взаимоотношения и межклеточные взаимодействия в пределах синусно-предсердного узла - существенно дополняют представления об устройстве и функционировании синусно-предсердного узла.

Положения, выносимые на защиту:

1. Синусно-предсердный узел сердца крыс состоит из истинных и латентных клеток-водителей ритма с присущими им характеристиками электрической активности, топографией распределения вдоль артерии синусного узла и особенностями их взаиморасположения, как в ткани самого узла, так и относительно окружающих узел рабочих атриальных кардиомиоцитов.

2. В пределах синусно-предсердного узла сердца крыс можно выделить центральную и периферическую части. Центральная часть синусно-предсердного узла сердца крыс состоит из двух областей, отделенных друг от друга артерией синусно-предсердного узла, - латеральной и медиальной, отличающихся друг от друга функциональными и морфологическими показателями. Периферическая часть построена латентными клетками-водителями ритма с формами потенциалов действия, представляющими собой разнообразные переходные формы между потенциалами действия истинных клеток-водителей ритма и рядом расположенными рабочими атриальными кардиомиоцитами.

3. Латеральная область центральной части синусно-предсердного узла состоит из морфологически однотипных клеток, электрофизиологически представляющих собой истинные клетки-водители ритма, формирующие доминантный пейсмекерный регион (функциональное ядро синусно-предсердного узла) и латентные клетки-водители ритма, строящие функциональный хвост синусно-предсердного узла, формы потенциалов действия которых однотипны по форме и различаются только степенью плавности перехода из фазы медленной диастолической деполяризации в фазу начального быстрого подъема потенциала и крутизной нарастания потенциала в фазе начального быстрого подъема потенциала.

4. Медиальная область центральной части синусно-предсердного узла сердца крыс, состоящая преимущественно из латентных клеток-водителей ритма, характеризуется мощным скоплением дофаминовых рецепторов в зоне напротив доминантного пейсмекерного региона, указывающем, соответственно, на скопление в этом месте автономных постганглионарных волокон и место отхождения ветви артерии синусно-предсердного узла. Высокое ветвление артерии синусно-предсердного узла всегда определяет локализацию доминантного пейсмекерного региона.

5. Процессы регуляции сердечного ритма медиаторами автономной нервной системы осуществляются в пределах латеральной области центральной части синусно-предсердного узла и сопровождаются сменой лидирующей группы клеток-водителей ритма (передвижением доминантного пейсмекерного региона) на новую, клетки которой обладают иными характеристиками электрической активности.

6. Распределение плотностей М-холинорецепторов, в-адренорецепторов, дофаминовых и опиоидных рецепторов в латеральной зоне центральной части синусно-предсердного узла носит общий характер. Указанный характер распределения плотностей рецепторов определяет направление и степень передвижения доминантного пейсмекерного региона.

7. Процессы старения в организме крыс приводят к увеличению линейных размеров синусно-предсердного узла, миграции доминантного пейсмекерного региона вниз по артерии синусно-предсердного узла, увеличению диаметров, как клеток-водителей ритма, так и окружающих рабочих атриальных кардиомиоцитов, урежению собственной частоты генерации потенциалов действия истинными клетками-водителями ритма и увеличению ширины пика потенциалов действия истинных и латентных клеток-водителей ритма.

Апробация работы. Материалы работы были представлены на: Юбилейной научной конференции «Фундаментальные и прикладные аспекты современной морфологии» (Санкт-Петербург, 1997); Всероссийской научной конференции по патологической анатомии памяти И.К. Есиповой и В.Н. Галанкина (Москва, 2001); Научно-практической конференции «Медико-биологические науки для теоретической и клинической медицины» (Москва, 2003); IV конгрессе Международной ассоциации морфологов (Уфа, 2002); Научно-практической конференции «Медико-биологические науки для теоретической и клинической медицины» (Москва, 2003); . III российской научной конференции « Роль природных факторов и туризма в формировании здоровья населения» (Уфа, 2005); VI Общероссийской научной конференции с международным участием «Успехи современного естествознания» (Сочи, 2005); IV научной конференции «Проблемы морфологии. Теоретические и клинические аспекты» (Астрахань, 2005); Международной конференции «Структурные преобразования органов и тканей на этапах онтогенеза в норме и при воздействии антропогенных факторов. Экология и здоровье человека» (Астрахань, 2007); Научно-практической конференции с международным участием, посвященная 85-летию со дня рождения доктора медицинских наук, профессора Степанова Петра Федоровича (Смоленск, 2009); совместная научно-практической конференции коллективов кафедр морфологии МБФ, фундаментальной и прикладной физиологии МБФ, гистологии и эмбриологии лечебного факультета РГМУ и кафедры гистологии ММА им. И.М. Сеченова (Москва, 14 апреля 2010).

Внедрение результатов исследования. Результаты диссертации внедрены в учебный процесс на кафедрах: физиологии человека и животных биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, фундаментальной и прикладной физиологии медико-биологического факультета ГОУ ВПО РГМУ Росздрава, гистологии, цитологии и эмбриологии ГОУ ВПО «Мордовский государственный университет» и морфологии медико-биологического факультета ГОУ ВПО РГМУ Росздрава.

По теме диссертации получено авторское свидетельство: «Устройство для исследования образца переживаемой ткани. (Патент RU 2063704, выдан 20. 07. 1996, Бюл. № 20). Автор участвовал с указанным устройством в выставке «Научные разработки и медицинская техника вчера и сегодня» и удостоен нагрудного знака «УЧАСТНИК ВВЦ» (Свидетельство № 18, постановление от 7.04.2000 № 24). Камера использовалась в 2007 году в совместных исследованиях с сотрудниками “Division of Cardiovascular and Endocrine Sciences. University of Manchester” (руководитель - prof. M.R. Boyett).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 29 научных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из одного тома и содержит следующие разделы: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследования и их обсуждение», «Заключение», «Выводы», «Практические рекомендации» и «Список литературы». Работа изложена на 362 страницах и включает в себя 4 таблицы и 91 иллюстрацию. Список литературы состоит из 607 источников, из которых 43 - отечественных и 564 - иностранных.

2. Материалы и методы исследований

Объект исследования. В экспериментах использовали самцов крыс линии «Вистар». Все исследованные животные были получены из вивариев, где содержались в пластиковых клетках с металлическими решетками, получали стандартное питание и квалифицированный ветеринарный уход - протокол Этического Комитета РГМУ № 50 от 20 июня 2005 года. Весь экспериментальный материал в диссертации получен на 204 животных.

Условно экспериментальные крысы были подразделены на три группы:

1. Молодые, возрастом около 1.5-2 месяцев, массой тела 119±14 граммов (P < 0.05), в количестве 141 особь.

2. Взрослые, возрастом 3 месяца, массой тела 328±9 граммов (P < 0.05), в количестве 32 особь.

3. Старые, возрастом 24 месяца, массой тела 653±30 граммов (P < 0.05), в количестве 31 особь.

Исследование сердечной функции с использованием внеклеточных отведений. У крыс, анестезированных кетамином (100 мг/кг массы тела) и ксилазином (5 мг/кг массы тела) записывали поверхностную электрокардиограмму. После этого животных анестезировали фенобарбиталом (50 мг/кг массы тела) и изготавливали препарат изолированного сердца по Лангендорфу, перфузируемый раствором Кребса-Рингера, уравновешенным смесью 95% О₂ и 5% СО₂ до рН = 7.4. Регистрирующие крючкообразные хлорсеребряные электроды прикрепляли к левому желудочку и правому ушку. Сигнал от них поступал на входы электрокардиографа. К правому ушку также прикрепляли стимулирующие биполярные электроды. Собственный сердечный ритм in vitro определяли после записи, по меньшей мере, 60 последовательных сердечных циклов. Время восстановления синусно-предсердного узла (ВВСПУ) определялось в условиях электрической стимуляции предсердий в течение 10 секунд с частотой стимулирующих импульсов, превышающей на 2 Hz собственный сердечный ритм. ВВСПУ измерялся как интервал времени между окончанием последнего стимулирующего стимула и началом первой спонтанной Р-волны. С целью учета индивидуальных различий между животными в собственных сердечных ритмах ВВСПУ нормализовали вычитанием из него периода следования сердечных сокращений Т_сл. Нормализованное ВВСПУ называется корректированным ВВСПУ (ВВСПУ_К). Итак, ВВСПУ_К = ВВСПУ - Т_сл.

Метод регистрации электрической активности клеток синусно-предсердного узла сердца крысы. Под нембуталовым наркозом (40 мг/кг массы тела) у крыс выделяли участок правого предсердия, содержащий переднюю стенку, верхнюю и нижнюю полые вены и правое ушко. Маркером синусно-предсердного узла служила его артерия, стенки которой окрашивали 0.01% раствором трипанового синего на растворе Хенкса. Затем препарат закрепляли и помещали в проточную термостатируемую кювету оригинальной конструкции объемом 10 мл, заполненную раствором Кребса-Рингера, уравновешенного смесью 5% СО₂ и 95% О₂ до рН = 7.4. Регистрация электрической активности кардиомиоцитов синусно-предсердного узла проводилась с помощью общепринятых стеклянных микроэлектродов, заполненных 3М KCl с диаметром кончика не более 0.5 мкм и сопротивлением до 60 мОм. Введение микроэлектродов ткань синусно-предсердного узла осуществлялось при помощи микроманипулятора КМ-1 под контролем микроскопа. В части экспериментов регистрирующая система состояла из усилителя постоянного тока УПТ-2 и двухлучевого запоминающего осциллографа С8-14. Кривые потенциалов действия кардиомиоцитов синусно-предсердного узла на экране осциллографа снимались на фотопленку с помощью фотоаппарата. В других (более поздних) экспериментах электрические сигналы c усилителя постоянного тока оцифровывались на 5 кГц с использованием Digidata 1322A A/D converter (Axon Instruments Inc., Union city, USA) и обрабатывались с использованием программы Axoscope (ver. 10).

Обработка данных электрофизиологических исследований. На зарегистрированных кривых потенциалов действия измерялись общепринятые в электрофизиологии кардиомиоцитов параметры: максимальный диастолический потенциал (МДП); реверсия потенциала выше нулевой линии - овершут (ОШ); амплитуда потенциала действия (АПД = МДП + ОШ); относительный порог самовозбуждения мембраны (ОПСМ) -потенциал, при котором фаза медленной диастолической деполяризации (фаза 4) переходит в фазу начального быстрого подъема потенциала (фазу 0); период следования (Т_сл) - временной интервал между двумя последовательными потенциалами действия. Кроме указанных параметров регистрировались также ШП₂₅ - ширина пика на уровне 25% АПД, ШП₈₅ - ширина пика на уровне 85% АПД, крутизна нарастания потенциала в фазе 4 (КНПф4) и крутизна нарастания потенциала в фазе 0 (КНПф0), которая рассчитывалась как dV/dT_max в фазах 4 и 0, соответственно. Частота следования потенциалов действия (ЧСПД) рассчитывалась по следующей формуле:

ЧСПД = 1/Т_сл.

Окрашивание гистологических срезов. Для гистологического исследования использовали как замороженные, так и заключенные в парафин препараты правых предсердий, с которых изготавливались срезы толщиной ?10 µm (плоскость среза ориентировалась параллельно или перпендикулярно crista terminalis). Оба типа срезов затем окрашивались трехцветной окраской по Массону.

Метод электронной микроскопии. Морфология клеток-водителей ритма изучалась на молодых животных. Обработка материала проводилась традиционным способом, после чего образцы заливали в Эпон-812 или Аралдит. Ультратонкие срезы окрашивали уранилацетатом и цитратом свинца по Рейнольдсу и просматривали в электронных микроскопах Hitachi HU-11E-2, Hitachi HU-12 и BS 500 при увеличениях от 3.2 до 31 тысяч.

Метод изучения передвижения доминантного пейсмекерного региона в ответ на введение в культуральную среду норадреналина и ацетилхолина. Местоположение доминантного пейсмекерного региона (места локализации группы истинных клеток-водителей ритма) определяли с помощью стеклянных микроэлектродов и фиксировали по шкале линейки, вставленной в объектив микроскопа. После обнаружения доминантного пейсмекерного региона в кювету последовательно (через 15-минутные отмывки) вводили растворы норадреналина битартрата (“Serva”) в возрастающих концентрациях (мг/мл): 0.6х10^-4, 1.2х10^-4 и 1.8х10^-4 (1-ая серия экспериментов). Во время каждого введения определяли местоположение доминантного пейсмекерного региона. В ходе эксперимента также регистрировали базальный уровень частоты следования потенциалов действия и его изменения при введении норадреналина в разных концентрациях. Чтобы исключить возможные артефакты, связанные с многократным введением норадреналина в кювету, была предпринята 2-ая серия экспериментов, в которой норадреналин вводили однократно в концентрациях (мг/мл): 1.2х10^-4, 1.8х10^-4 и 3.6х10^-4. Ход экспериментов с использованием ацетилхолина в 1-ой серии полостью повторял таковой для норадреналина. Выбранные концентрации для ацетилхолина составляли 25х10^-4, 50х10^-4 и 75х10^-4 мг/мл. 2-ая серия экспериментов с ацетилхолином проводилась с этими ж концентрациями, но между последующими введениями ацетилхолина использовались промежуточные 15-минутные отмывки.

Авторадиографическое исследование относительных плотностей связывания ³H-DHA, ³H-QNB, ³H-дофамина и ³H-DAGO в центральной части синусно-предсердного узла сердца крыс. В ходе электрофизиологического эксперимента после обнаружения доминантного пейсмекерного региона стеклянный микроэлектрод оставляли в ткани, а культивационную среду в кювете меняли на промывочную. Состав сред и техника проведения реакций связывания лигандов использовались в соответствии с методиками, успешно примененными В.В. Глинкиной [Глинкина В.В., 1990; Ярыгин В.Н., и др., 1990] для исследования вегетативных ганглиев. По окончании процесса связывания в кювету вводили 4% раствор глютарового альдегида на буфере Миллонига и фиксировали препарат в течение 2 часов. Участок правого предсердия, содержащий область синусно-предсердного узла постфиксировали в 1% OsO₄ на буфере Миллонига, дегидратировали и заливали в Эпон-812. Авторадиографическое исследование плотности распределения тритиевой метки проводили на последовательных срезах толщиной 3 мкм, окрашенных 1% метиленовым синим, в темноте покрытых фотографической эмульсией Amersham LM-1. Высушенные срезы выдерживались при 4 ⁰С. По истечении года проводили стандартный процесс проявления в проявителе D-19 (Kodak). Анализ изображения проводился на измерительном микроскопе Люмам-И-3 с увеличением объектива 40. Изображение с объектива проецировалось на видеокамеру, размеры поля зрения в которой составляли 26.5 х 32.5 мкм². Денситометрические измерения проводились в непосредственной близости от стенки артерии синусно-предсердного узла, а для ³H-дофамина - также и непосредственно в стенке сосуда, с шагом 0.05 мм вверх и вниз вдоль артерии от местоположения доминантного пейсмекерного региона. Для сравнения измеряли плотность авторадиографической метки в ткани рядом расположенного перинодального атриального рабочего миокарда. Захваченные видеокамерой изображения с использованием устройства “AverMedia EZCapture 2.5” подвергались компьютерному анализу с использованием программы “Adobe Photoshop 5.0”. Результатом служило процентное содержание площади поля зрения, занятое зернами авторадиографической метки. Относительная плотность указанной метки рассчитывалась как отношение процентного содержания площади, занятой меткой в текущем поле зрения, к таковой, максимальной для данного среза. Далее для каждого среза строили графики распределения относительной плотности авторадиографической метки вдоль артерии синусно-предсердного узла.

Статистическая обработка данных. Все результаты оценивались по t-критерию Стьюдента с использованием программы SigmaStat. Различия считались значимыми на уровне P<0.05. Подробный отчет по количеству крыс разных возрастов, использованных в сериях экспериментов, приведен в Таблице 1.

Таблица 1. Таблица учета экспериментальных животных

Результаты исследования и их обсуждение

Электрофизиологические характеристики клеток-водителей ритма синусно-предсердного узла сердца крыс. Синусно-предсердный узел сердца крыс построен истинными и латентными клетками-водителями ритма.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 1. Форма кривой потенциала действия истинной клетки-водителя ритма (а) и один из вариантов (б) распределения электрофизиологических типов клеток вдоль артерии синусно-предсердного узла.

Условные обозначения: а) 4, 0, 3 - фазы потенциала действия; б) 1 - верхняя граница синусно-предсердного узла (-0.23±0.05 мм; p<0.05; n = 17); 2 - местоположение истинных клеток-водителей ритма; 3 - нижняя граница центральной части синусно-предсердного узла (около 0.3 мм); 4 - нижняя граница синусно-предсердного узла (0.7±0.10 мм; p<0.05; n = 17);

Количественные характеристики потенциалов действия клеток-водителей ритма синусно-предсердного узла сердца крыс и рабочих атриальных кардиомиоцитов, полученные с помощью аналого-цифрового преобразователя и компьютера приведены в Таблице 2.

Таблица 2. Параметры электрической активности (М±м) истинных клеток-водителей ритма (n = 61, P < 0.05), латентных клеток-водителей ритма сино-атриального узла сердца крыс (n = 126, P < 0.05) и рабочих перинодальных кардиомиоцитов правого предсердия крыс (n = 168, P < 0.05)

Истинные клетки-водители ритма синусно-предсердного узла сердца крыс характеризуются наличием фазы медленной диастолической деполяризации (фаза 4), плавным переходом из фазы медленной диастолической деполяризации в фазу начального быстрого подъема потенциала (фаза 0) и низкой скоростью начального быстрого подъема потенциала (Рис. 1). Форма потенциала действия истинных клеток-водителей ритма синусно-предсердного узла сердца крыс сходна с таковой у других исследованных млекопитающих - в течение реполяризации фазы 1, 2 и 3 сливаются в единую фазу (3). Как видно из Таблицы 2, помимо указанных характеристик истинные клетки-водители ритма характеризуются также низкими значениями максимального диастолического потенциала и амплитуды потенциала действия, близкой к нулю реверсией потенциала и значительной шириной пика потенциала действия.

Латентные клетки-водители ритма синусно-предсердного узла сердца крыс также имеют диастолический подъем, но переход из фазы 4 в фазу 0 становится резким, при этом увеличивается скорость нарастания потенциала в фазе 0 (Рис. 1, б; Таблица 2).

Синусно-предсердный узел со всех сторон окружен рабочей атриальной мускулатурой (Рис. 1, б; Таблица 2). Фаза 4 у атриальных кардиомиоцитов называется фазой покоя, поскольку медленный диастолический подъем как у истинных и латентных клеток-водителей ритма у них отсутствует. Формы потенциалов действия атриальных кардиомиоцитов различаются в разных регионах предсердия.

Сравнительный анализ электрофизиологических характеристик показывает, что латентные клетки-водители ритма имеют промежуточные характеристики между истинными клетками-водителями ритма и рядом расположенными рабочими атриальными кардиомиоцитами. При этом, здесь прослеживается четкая закономерность: чем дальше латентный пейсмекер располагается от центральной части узла, тем больше амплитуда его потенциала действия, максимальный диастолический потенциал, реверсия потенциала и тем меньше ширина пика потенциала действия.

Топографически синусно-предсердный узел сердца крыс располагается вдоль артерии синусно-предсердного узла, которая по своему диаметру и ее tunica media включает только 2 - 3 слоя гладких мышечных клеток.

Витальное окрашивание трипановым синим позволило отчетливо фиксировать ход артерии синусно-предсердного узла. Всего в процессе исследований выявлено 4 варианта хода этой артерии (Рис. 2).

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 2. Варианты взаиморасположения истинных клеток-водителей ритма (звездочки), латентных клеток-водителей ритма (белые кружки) и рабочих атриальных кардиомиоцитов (черные точки) в привязке к артерии синусно-предсердного узла (АСПУ) на схеме передней поверхности правого предсердия.

а - отсутствие ветвления АСПУ, б - каудальное ветвление АСПУ, в - краниальное ветвление АСПУ (вариант отхождения более мелкого ствола от АСПУ), г - краниальное ветвление АСПУ (равное деление артерии), д - вариант расположения доминантного пейсмекерного региона в области каудального ветвления АСПУ. Обозначения: ПКрПВ - правая краниальная полая вена, КаПВ - каудальная полая вена, ПУ - правое ушко, стрелки - вспомогательные истинные КВР, стрелка с двойным хвостом - доминантный пейсмекерный регион.

Отсутствие видимого ветвления (Рис. 2,а) или каудальное ветвление (Рис. 2,б) (варианты, суммарно составляющие порядка 35% случаев) не указывало на положение доминантного пейсмекерного региона, которое в этих случаях определялось только электрофизиологически. Напротив, краниальное ветвление артерии, включающее варианты отхождения более мелкого ствола (Рис. 2,в) и равномерного деления артерии (Рис. 2,г) совпадало с электрофизиологически определяемым местом доминантного пейсмекерного региона (суммарно, порядка 65% случаев). В нескольких экспериментах доминантный пейсмекерный регион находился несколько выше дихотомии, но не более чем на 0.2 мм.

Одномерный анализ распределения клеток-водителей ритма с различными формами кривых потенциалов действия вдоль артерии синусно-предсердного узла выявил высокую степень полиморфности этих кривых (Рис. 1,б). Центральная часть синусно-предсердного узла представлена доминантным пейсмекерным регионом, включающим истинные клетки-водители ритма с формой потенциала действия, описанной ранее (Рис. 1,а,б), и латентных клеток-водителей ритма с точно такой же формой потенциала действия, отличающейся от формы потенциала действия истинной клетки-водителя ритма резким характером перехода из фазы 4 в фазу 0 и более высокими значениями крутизны нарастания потенциала в фазе 0 (Рис. 1,б - на 0.2 мм ниже нулевой точки). Вверх и вниз от центральной части синусно-предсердного узла вдоль артерии располагаются латентные клетки-водители ритма, формируя периферическую часть узла, окружающую центральную, причем в нижнем направлении узел вытянут гораздо больше, чем в верхнем. В среднем длина синусно-предсердного узла молодых крыс составляет около 0.9 мм, при этом центральная часть узла имеет длину около 0.3 мм.

Дальнейший, более подробный, двумерный анализ распределения клеток-водителей ритма и рабочих атриальных кардиомиоцитов (Рис. 2) подтвердил ранее полученные результаты, особенно в той части, что истинные и латентные клетки-водители ритма расположены в непосредственной близости к артерии синусно-предсердного узла. В ходе этих исследований было также показано, что в редких (единичных) случаях доминантный пейсмекерный регион располагается в месте низкого ветвления артерии синусно-предсердного узла (Рис. 2, д). Столь низкое (по ходу артерии синусно-предсердного узла) расположение доминантного пейсмекерного региона (стрелка с двойным хвостом) сопровождается несколькими значительно удаленными друг от друга очагами локализации вспомогательных истинных клеток-водителей ритма выше по ходу артерии. Не исключено, что такое мультифокальное расположение истинных клеток-водителей ритма может служить причиной возникновения аритмии.

Морфологическое обеспечение функционирования синусно-предсердного узла сердца крыс. «Градиентная» модель устройства узла против «мозаичной», доводы «за» и «против». В свое время на основании большого накопленного фактического электрофизиологического и морфологического материала сложилась «градиентная» модели синусно-предсердного узла [Boyett M.R. et al., 2000, Dobrzynski H. et al., 2007, Mangoni M.E. et Nurgeot J., 2008, Masson-Pevet M. et al., 1984]. Согласно этой модели имеется прогрессивный переход в размерах и электрических свойствах клеток-водителей ритма между центром синусно-предсердного узла и его периферией. Клетки центральной части синусно-предсердного узла - мелкие по размерам, и имеют собственную частоту генерации потенциалов действия и скорость нарастания потенциала в фазе 0 меньшие, чем у клеток периферии узла, которые, напротив, имеют более высокие показатели собственной частоты генерации потенциалов действия, крутизны нарастания потенциала в фазе 0 и промежуточные электрофизиологические характеристики между «чистыми» клетками-водителями ритма и рабочими предсердными кардиомиоцитами. Морфологически, при удалении от центральной части синусно-предсердного узла в клетках переходного типа в цитоплазме нарастает объемная доля миофибрилл, они становятся мощнее, длиннее и постепенно ориентируются вдоль длинной оси клетки. Форма клетки из веретенообразной трансформируется в цилиндрическую. В цитоплазме появляются цистерны саркоплазматического ретикулюма, а затем их объемная доля значительно возрастает к периферии. То же самое происходит и с Т-трубочками.

Другая модель устройства (условно назовем ее «мозаичной») была предложена E.E. Verheijck et al. [Verheijck E.E. et al., 1998, Verheijck E.E. et al., 2001]. Исследование морфологических и электрофизиологических характеристик ферментативно диссоциированных кардиомиоцитов синусно-предсердного узла сердца кролика выявило наличие трех морфологически различимых типов клеток, обладающих пейсмекерной активностью и различающихся собственными частотами генерации потенциалов действия и конфигурациями потенциалов действия. Четвертый тип клеток пейсмекерной активностью не обладал, и по морфологическим характеристикам и по параметрам потенциалов действия представлял собой рабочие предсердные кардиомиоциты. В противоположность «градиентной» модели здесь отсутствует преимущественность расположения мелких клеток в центральной части синусно-предсердного узла - все указанные клеточные типы, обладающие пейсмекерной активностью, равномерно распределены по объему узла. При этом, во всех частях синусно-предсердного узла эти клетки контактировали с рабочими предсердными кардиомиоцитами: минимальный процент рабочих кардиомиоцитов наблюдался в центре узла, к периферии доля рабочих кардиомиоцитов возрастала. Аналогичные результаты (по выраженности коннексинов Сх45, Сх40 и Сх43) были получены и на мышах.

Наши исследования двумерного распределения кардиомиоцитов с различными типами электрической активности на передней стенке правого предсердия показали, что зачастую между истинными и латентными клетками-водителями ритма практически на всех препаратах обнаруживаются кардиомиоциты с потенциалами действия, типичными для рабочих предсердных кардиомиоцитов (Рис. 2). Указанные выше наши электрофизиологические находки, формально согласующиеся с данными Verheijck E.E. et al., привели нас к необходимости более подробного исследования морфологической организации синусно-предсердного узла.

Подробный электронно-микроскопический анализ области синусно-предсердного узла сердца молодых крыс показал, что центральная часть узла представлена типичными нодальными клетками, которые представляют собой одноядерные клетки веретеновидной формы. Преимущественное направление их длинной оси - перпендикулярно оси артерии синусно-предсердного узла. Отличительной чертой этих клеток является наличие обширных участков «пустой» цитоплазмы, т.е. участков, в которых электронно-микроскопически не выявляется каких-либо оформленных структур, кроме отдельных свободных полирибосом или гранул гликогена. Сократительный аппарат в клетках центральной части узла представлен скудно: объемная доля миофибрилл мала, миофибриллы - короткие, обычно состоят всего из нескольких саркомеров, их ориентация не связана с длинной осью клетки. Типичные нодальные клетки преимущественно формируют соединения по типу «конец в конец». В этих местах наиболее представлены fasciae adherentes. Между ними обязательно обнаруживаются нексусы, их количество мало, и они имеют крайне малые размеры. Кроме того, в клетках центральной части узла полностью отсутствуют Т-трубочки и цистерны саркоплазматического ретикулюма.

Периферическая часть узла построена двумя морфологическими типами латентных клеток-водителей ритма - светлыми и темными, причем в непосредственной близости от типичных нодальных клеток могут располагаться как светлый, так и темный тип. По своим ультраструктурным показателям светлые латентные клетки-водители ритма стоят ближе к типичным нодальным клеткам, в то время как темные - к рабочим атриальным кардиомиоцитам. Оба клеточных типа контактируют с типичными нодальными клетками, находясь при этом в тесном соседстве. Не исключено, что они формируют параллельные независимые пути передачи возбуждения от истинных клеток-водителей ритма к рабочим атриальным кардиомиоцитам. По своей морфологии указанные клеточные в значительной степени соответствуют переходному клеточному типу.

Ближе к границе синусно-предсердного узла и рабочего предсердного миокарда располагаются латентные клетки-водители ритма, которые уже имеют цилиндрическую форму и преимущественное направление миофибрилл вдоль длинной оси клетки. Они все содержат уже значительное число специфических атриальных гранул и формируют боковые контакты. Однако, их диаметр невелик - 5-7 мкм, в их цитоплазме часто встречаются разнонаправленные миофибриллы, особенно, в околоядерной зоне. Граница узла представлена латентными клетками-водителями ритма, морфологически неотличимыми от рабочих атриальных кардиомиоцитов. Диаметр этих клеток достигает 10 мкм, их цитоплазма содержит плотно упакованные миофибриллы, направленные вдоль длинной оси клетки.

В завершение рассмотрения морфологических типов клеток, формирующих синусно-предсердный узел сердца крыс, следует совершенно определенно сказать, что ни в одном из исследованных нами препаратов, нами не было обнаружено никаких признаков присутствия рабочих атриальных кардиомиоцитов среди типичных нодальных клеток или даже среди клеток переходного типа. Действительно, мы видели взаимопроникновение пучков типичных нодальных клеток и клеток переходного типа, а также пучков клеток переходного типа и рабочих атриальных кардиомиоцитов, но при этом всегда сохраняется закономерность связей: типичные нодальные клетки > клетки переходного типа > рабочие атриальные кардиомиоциты. Отмеченные нами типичные потенциалы действия рабочих атриальных кардиомиоцитов на двумерной карте правого предсердия в действительности же наблюдались от тонкого субэпикардиального листка рабочего предсердного миокарда, снаружи прикрывающего синусно-предсердный узел и состоящего из двух - трех слоев типичных рабочих атриальных кардиомиоцитов.

Таким образом, проведенное нами подробное морфологическое исследование синусно-предсердного узла сердца крыс не выявило никаких доказательств в пользу «мозаичной» модели устройства синусно-предсердного узла сердца крыс. Напротив, все приведенные данные свидетельствуют в пользу «градиентной» модели.

Морфологические особенности артерии синусно-предсердного узла сердца крыс. Артерия синусно-предсердного узла сердца крыс гистологически представляет собой мелкую артерию: эндотелий - непрерывного типа, подэндотелиальный слой - без особенностей, средняя оболочка обычно представлена 2-3 слоями гладких мышечных клеток, t. adventitia образована рыхлой соединительной тканью. Важнейшей особенностью строения артерии в центральной части синусно-предсердного узла является наличие соединений между гладкими мышечными клетками t. media артерии и типичными нодальными кардиомиоцитами, строящими центральную часть узла. При этом кардиомиоциты образуют короткие выросты в направлении гладких мышечных клеток. В области соединений базальные мембраны контактирующих клеток сливаются.

Рецепторный профиль центральной части синусно-предсердного узла. Подробный анализ данных литературы, проведенный в главе «Обзор литературы» выявил отсутствие каких-либо указаний на неравномерность плотности иннервации со стороны всех исследованных нервных проводников ткани синусно-предсердных узлов млекопитающих и, в частности, крысы. Поскольку иннервация синусно-предсердного узла носит довольно равномерный характер, нами была предпринята попытка попробовать связать эффекты, вызванные процессами регуляции сердечной хронотропии, с выраженностью ряда наиболее характерных для этой области рецепторов и их распределением в периартериальной зоне артерии синусного узла. С этой целью нами было предпринято количественное светооптическое авторадиографическое исследование распределения адрено- и холинорецепторных структур, а также мест связывания дофамина и DAGO в центральной части синусно-предсердного узла сердца крыс.

в-адренорецепторы. Распределение количества катехоламиновых рецепторов в латеральной области (Рис. 3) центральной части синусно-предсердного узла неоднородно вдоль артерии. Наименьшее число рецепторов характерно для местоположения доминантного пейсмекерного региона при отсутствии медиаторных влияний (это место обозначено нами как функциональное ядро синусно-предсердного узла). Вниз вдоль артерии синусно-предсердного узла (по ходу кровотока) наблюдается плавное нарастание плотности мечения катехоламиновых рецепторов до максимальных значений с некоторым последующим снижением, тогда как вверх вдоль артерии синусно-предсердного узла количество рецепторов резко возрастает до практически максимальных значений. Относительное число мест связывания ³Н-DHA в периартериальной области значительно превосходит таковое, измеренное в ткани перинодального атриального миокарда (30 ± 13% от максимального, P < 0.05). В медиальной области (Рис. 3) центральной части синусно-предсердного узла распределение мест связывания ³Н-DHA имело обратный характер: в области, противоположной доминантному пейсмекерному региону (в функциональном ядре) наблюдался пик связывания этого лиганда с постепенным уменьшением числа мест связывания в краниальном и каудальном направлениях.

Действие норадреналина на электрофизиологические параметры клеток синусно-предсердного узла. Зависимость смещения доминантного пейсмекерного региона в ответ на введение норадреналина носит линейный характер в области низких концентраций медиатора с последующей тенденцией к выходу на плато в области более высоких концентраций, аппроксиматически стремясь к значению передвижения доминантного пейсмекерного региона в 0.3 мм. Степень (длина) перемещения доминантного пейсмекерного региона показывает хорошую степень совпадения для последовательных и однократных введений норадреналина. Ранее, в процессе исследования распределения клеток-водителей ритма вдоль артерии синусно-предсердного узла нами было показано, что центральная часть узла, построенная истинными и латентными клетками-водителями ритма, имеющими идентичную форму потенциала действия (отличия - в плавности перехода из фазы 4 в фазу 0), также имеет длину порядка 0.3 мм (Рис. 1). Таким образом, передвижение доминантного пейсмекерного региона в ответ на введение катехоламинов происходит только в пределах центральной части синусно-предсердного узла.

М-холинорецепторы. Относительная плотность М-холинергических рецепторов имела характер распределения в пределах латеральной области центральной части синусно-предсердного узла, аналогичный таковому для адренергической рецепции. Минимальное значение наблюдалось в области функционального ядра синусно-предсердного узла с последующим плавным возрастанием вниз по артерии синусно-предсердного узла и резким - вверх. Относительное количество мест связывания ³Н-QNB в ткани перинодального атриального рабочего миокарда правого предсердия крыс составило 81 ± 10% от максимального (P<0.05). Медиальная область по связыванию ³Н-QNB представляется достаточно однородным образованием, количественно мало отличающимся от перинодального атриального миокарда. Уровень связывания ³Н-QNB в этой области был даже несколько ниже, чем в латеральной области и окружающем атриальном миокарде.

Действие ацетилхолина на электрофизиологические параметры клеток синусно-предсердного узла. Введение в культивационную среду ацетилхолина в возрастающих концентрациях вызывало нелинейное урежение частоты следования потенциалов действия с выходом на некоторый конечный уровень. Следует отметить, что трехкратная концентрация ацетилхолина в 18 случаях из 26 через некоторое время после начала введения приводила к аритмизации препарата и дальнейшей невозможности точно определять частоту следования потенциалов действия.

Введение в культуральную среду ацетилхолина в 11 экспериментах из 13 (в случае последовательного введения ацетилхолина в возрастающих концентрациях) не приводило к передвижению доминантного пейсмекерного региона. В 2 экспериментах из 13 при введении ацетилхолина в культуральную среду произошло перемещение доминантного пейсмекерного региона в краниальном направлении (на 0.05 и 0.12 мм). В экспериментах с однократным введением ацетилхолина передвижения доминантного пейсмекерного региона не происходило.

Таким образом, введение ацетилхолина в культуральную среду не приводит к перемещению доминантного пейсмекерного региона. В том случае, когда доминантный пейсмекерный регион по каким-либо причинам находился вне функционального ядра, введение ацетилхолина возвращало его в исходное положение.

Опиоидные рецепторы. Для исследования распределения м-опиоидных рецепторов в пределах синусного узла нами был выбран меченый по тритию лиганд - ³H-DAGO, который, по общему мнению исследователей, является их селективным агонистом. Относительная плотность опиоидных рецепторов имела аналогичный характер распределения в пределах латеральной области центральной части синусно-предсердного узла с таковым для адренергической рецепции. Минимальное связывание лиганда наблюдалось в месте функционального ядра с тенденцией повышения плотности связывания, как в краниальном, так и в каудальном направлениях. Напротив, медиальная область характеризовалась довольно однородным распределением метки, причем уровень мечения мало отличался от такового для рядом расположенного перинодального миокарда (относительная плотность - 76±16% от максимального, P<0.05). Следует отметить, что общий уровень мечения ³H-DAGO был вообще относительно невысоким в сравнении с мечением ³H-QNB, ³H-DHA и ³H-дофамина. Это может быть результатом или общего низкого количества м-опиоидных рецепторов в ткани синусно-предсердного узла, как впрочем и в миокарде правого предсердия в целом, или даже возможным отсутствием этих рецепторов и результатом кросс-связывания ³H-DAGO с д- и/или к-опиоидными рецепторами.