Методы диагностики болезней животных

Вирусологическое исследование - комплекс методов исследования, позволяющее распознать этиологию вирусного заболевания и изучить его возбудителя.

Характер и методика взятия проб при различных вирусных болезнях неодинаковы. При взятии материала для выделения вируса следует исходить из плюрализма вирусов. Его отбирают с учетом патогенеза изучаемой инфекции, как можно быстрее после появления четких признаков болезни или не позднее 2-3 часов после смерти или убоя (наблюдается феномен посмертной аутостерилизации и посмертных изменений тканей) и быстро помещают в условия низкой температуры. Материал отправляют в лабораторию в термосе с условиями поддержания низкой температуры, в стеклянных флаконах( пробирках) с притертыми пробками, либо консервированном виде 50%-ным растровом глицерина.

Исследование необходимо начинать сразу после поступления материала. Если по каким-то причинам (отсутствие эмбрионов птиц, тканевых культур) оно откладывается, присланный материал необходимо поместить в низко -темперарурный морозильник при - 27...40...70⁰С. Сначала проводят исследо-вания, позволяющие непосредственно выявить вирус или его антигены в материале - световую, люминесцентную (метод иммунофлюоресценции), электронную микроскопию и иммуноферментный анализ.

Световая и люминесцентная микроскопия используется для обнаружения крупных вирусов (вирус оспы), выявления внутриклеточных включений ( напр. Бабеша-Негри при бешенстве), изучения цитопатогенного действия вируса на клетки (ЦПД), определения типа нуклеиновой кислоты вируса(метод флуорохромирования). Для световой микроскопии препараты из патологического материала окрашивают специальными методами: по Морозову, Маккиавелло, Рома-новскому-Гимзе - при выявлении вирионов; по Муромцеву, Манну, Туревичу и др. - при выявлении включений. Для люминесцентной микроскопии при окраске препаратов используют флуорохромы (акридин оранжевый и др.). Электронная микроскопия (используют специально приготовленные препараты) позволяет выявлять вирусные частицы в различных материалах, дифференцировать их по форме, размеру и ультраструктуре. Метод иммунофлуоресценции проводят с помощью иммунных сывороток меченных флуорохромами с целью индикации, идентификации вирусов и вирусных агентов.

Иммуноферментный анализ (ИФА) применяется в гистохимическом и твердофазном варианте, где используются антитела меченные ферментами (пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза и др.). Гистохимический вариант ИФА предназначен для идентификации вируса в патматериале или культуре клеток. Твердофазный вариант ИФА используется как для определения антигенов, так и определения антител и их титров в целях ретроспективной диагностики.

Для выделения вируса используют эмбрионы птиц, культуры клеток, лабораторных и естественно-восприимчивых животных. Подготовку вируссодержащего материала для заражения чувствительных объектов осуществляют двумя методами: с помощью обработки антибиотиками или путем стерилизующего фильтрования. Затем материал подвергают бактериологическому контролю на наличие бактерий, грибов путем посева на МПА, МПБ, МППБ, среду Сабуро и при отрицательных результатах используют для заражения. При получении отрицательных результатов проводят не менее трех пассажей на биологических объектах того же вида.

При выделении в испытуемом материале вирусного агента следующим этапом исследования является идентификация вируса (видовая и группо-специфическая) с помощью серологических методов. С этой целью используют РН, РСК, РИД, РТГАд, РЗГА, РНГА, ИФА. Данные методы позволяют выявить также и антитела в сыворотках переболевших животных. При этом необходимо иметь две пробы сыворотки крови (парные сыворотки), взятые в начале и в конце болезни (обычно через 14 дней). Хранить сыворотки необходимо в холодильнике при 4⁰ С или в замороженном виде, строго соблюдая порядок нумерации проб и соответствия записей в журнале и на пробах.

Б настоящее время в лабораториях для идентификации возбудителя используется полимеразная цепная реакция (ПЦР), позволяющая определить нуклеотидную последовательность РНК или ДНК инфекционного агента.

Результаты исследования записывают в журнал вирусологических исследований. Диагноз на инфекционную болезнь может быть поставлен при учете эпизоотологических, клинических и патологоанатомических данных и результатов лабораторных исследований.

Микологическое исследование - комплекс методов, применяемых для обнаружения и идентификации грибов в исследуемом материале.

Микологическое исследование при диагностике микозов включает микроскопию патологического материала для обнаружения возбудителя в органах и тканях больного животного, выделение чистой культуры и ее идентификацию. Б неясных случаях проверяют патогенность выделенных культур биологической пробой. Дополнительно используют серологический, аллергический, люминесцентный методы диагностики. Гистологическое исследование применяют для диагностики глубоких микозов, возбудитель которых не культивируется на питательных средах (риноспородиоз).

Отбор патологического материала при дерматомикозах производят с периферии свежих, пораженных очагов (корочки, волосы); при эпизоотическом лимфангите, споротрихозе, актиномикозе, актинобациллезе материал извлекают из невскрывшихся абсцессов, а также исследуют гранулематозные очаги после предварительной дезинфекции их; при висцеральных микозах исследуют гной, мочу, органы и ткани, соскобы со слизистых оболочек. Патологический материал помещают в стерильные чашки Петри (при дерматофитозах можно в чистые стерильные пакеты). Для лучшего выявления элементов грибов из патологического материала готовят препараты на предметном стекле в капле 10-20%-ного раствора едкого натра с последующим добавлением 50%-ного водного раствора глицерина. Микроскопируют неокрашенные препараты (реже окрашенные по Граму, лактофуксином, хлопчатобумажной синью, Романовскому- Гимзе) при малом увеличении, затем при х40. Лучшие результаты исследования дает фазово-контрастная микроскопия.

Первичную культуру возбудителей получают посевом патологического материала на агар Сабуро, сусло-агар, кровяной агар и др.(10-12 пробирок). При загрязнении посторонней микрофлорой можно применить предпосевную обработку патологического материала (70⁰ этиловым спиртом или 2-4%-ным раствором формалина 3-6 мин.) или добавить антибиотики в питательную среду. Оптимальный рН питательной среды для патогенных грибов составляет 6,0-7,2, температура культивирования 26-30⁰ С, для отдельных представителей 37⁰ С. Посевы выдерживают до 30 суток, так как первичные культуры чаще развиваются медленно (напр. Tr. verrucosum). Идентификацию культур проводят по культурально- морфологическим признакам, ферментативной активности на специальных средах. При микроскопии культур (непосредственно в чашках или препаратах) выявляют мицеальные тяжи, склероции, плодовые тела, строение и характер ветвления спорангиеносцев, конидиеносцев, форму споронгиев, расположение конидий (цепочками или одиночно), отношение к окраске. Патогенность культур проверяют заражением белых мышей, морских свинок, кроликов через скарифицированную кожу, подкожно, интраперитониально, внутривенно, ингаляционным методом.

Серологические реакции (агглютинации, преципитации, РСК и др), аллергические внутрикожные пробы применяют в комплексе с другими методами при диагностике преимущест-венно кандидамикоза, гистоплазмоза, эпизоотического лимфангита. Люминесцентным методом выявляют у животных микроспорию.

Для микологического исследования при диагностике микотоксикозов берут средние пробы из партий кормов, вызвавших алиментарное отравление животных. Предварительно исключают инфекционные болезни, отравления ядовитыми растениями и ядохимикатами. Используют органолептический, микологический, токсико-биологический и физико-химический методы.

При органолептическом анализе учитывают влажность, цвет, запах, иногда вкус, а также видимые поражения корма грибами. Микологическое исследование включает: первичное выделение грибов из кормов, количественный учет и дифференциацию их, выделение чистых культур грибов. Выделение токсичных вариантов грибов из исследуемых образцов корма - решающий момент в диагностике микотоксикозов. Токсичность образцов корма и культур грибов определяют кожной пробой на кроликах, простейших (инфузориях стилонихиях) и скармливанием лабораторным животным. Физико-химический анализ заключается в изоляции, качественном и количественном определении в кормах и культурах грибов афлатоксинов, микотоксина (Т-2), зеараленона (Ф-2) путем тонкослойной хроматографии в сочетании с люминесцентной микроскопией.

Диагностика паразитозов. Взятие и доставка в лабораторию проб фекалий

Рукой в резиновой перчатке берут примерно 100 г фекалий из прямой кишки животных или только что выделившихся при испражнении. Б последнем случае берут пробу с верхней части экскрементов, не соприкасавшейся с полом или почвой. Руку и пинцет после взятия каждой пробы тщательно моют. Пробы от мелких животных берут с помощью груши. Вращательными движениями наконечник груши вводят в прямую кишку. При сдавливании груши воздух входит в кишку. Затем наконечник груши вынимают. Эта манипуляция вызывает рефлекторный акт дефекации. После каждого взятия пробы наконечник груши тщательно промывают. Взятый материал регистрируют в описи сопроводительного документа.

Каждую пробу помещают в пакетик из плотной бумаги или целлофановый, нумеруют и отправляют в лабораторию с описью в сопроводительном документе. В нем указывают хозяйство, отделение или владельца животных, вид и количество их в стаде (отаре, табуне), дату взятия проб и цель исследования.

В лабораторию отправляют пробы не более суточной давности со времени их взятия. При исследовании на диктиокаулез и стронгилоидоз пробы следует доставлять в лабораторию не позже чем через 4 ч после взятия.

Если нет возможности своевременно доставить пробы в лабораторию, их можно консервировать, используя для этой цели физические и химические методы консервации.

Из физических методов наиболее распространенным и простым является воздействие низких температур. Пробы помещают в холодильник при температуре +2...-4°С, что задерживает развитие личинок.

Можно использовать и различные химические средства:

S жидкость Барбагалло (3%-ный раствор формалина в изотоническом растворе натрия хлорида). В ней пробы фекалий могут сохраняться до двух недель;

S смесь, состоящую из формалина (5 мл), глицерина (5 мл) и воды (100 мл);

S смесь, состоящую из 0,2%-ного натрия азотнокислого (1900 мл), раствора Люголя (250 мл), формалина (300 мл) и глицерина (25 мл).

Гельминтоскопия

Для обнаружения гельминтов в фекалиях их смешивают с водой (1:10) и смеси дают отстояться. Через некоторое время (не менее 5 мин) верхний слой воды сливают, а к осадку приливают новую порцию воды. Так повторяют несколько раз, что позволяет удалить большую часть посторонних веществ, а в осадке остаются паразиты и нерастворимые тяжелые части фекалий. Затем осадок исследуют макро- и микроскопически.

Макроскопическое исследование. Промытый осадок фекалий вновь разбавляют водой, небольшими порциями наливают в черную кювету и при медленном покачивании ее внимательно просматривают осадок. Можно брать осадок небольшими порциями, выливать в чашки Петри и просматривать под лупой или микроскопом. Некоторых гельминтов лучше просматривать на белом фоне. Поэтому рекомендуют одну половину кюветы окрашивать в черный цвет, другую - в белый. Так последовательно просматривают весь материал. Обнаруженных паразитов выбирают препаровальной иглой или кисточкой и фиксируют.

Микроскопическое исследование. Для обнаружения мелких форм паразитов отмытый осадок исследуют в бактериологических чашках с помощью штативной лупы (6-10-кратное увеличение).

Гельминтоовоскопия

Оборудование и средства. Для проведения гельминтоовоскопии необходимо следующее оборудование и материалы: микроскоп биологический (МБИ) или микроскоп биологический стереоскопический (МБС), предметные и покровные стекла, бактериологические чашки, пинцеты, ножницы, стеклянные палочки, фарфоровые ступки и пестики, стаканчики из стекла или синтетического материала с верхним диаметром 4-5 см (мензурки в форме усеченного конуса на 50 мл), можно использовать баночки Флоринского, ситечки с металлической или покровной сеткой (кусочки чулочной ткани или марли) с величиной сторон ячеек 0,25-0,3 мм, центрифужные пробирки, центрифуга до 2 тыс. об/мин, металлические петли с диаметром кольца 5-8 мм, спиртовая или газовая горелка, флотационные растворы, десенсиметр для проверки плотности флотационных растворов, глицерин, молочная кислота, глазные пипетки, целлофановая пленка.

Приготовление флотационных растворов. Насыщенный раствор натрия хлорида (NaCl). Б эмалированное ведро с кипящей водой порциями кладут соль, постоянно помешивая деревянной лопаточкой до полного растворения. Соль добавляют до тех пор, пока она не начинает выпадать в осадок. Для приготовления раствора требуется 420 г соли на 1 л воды. Б горячем виде раствор фильтруют через марлю. При остывании раствора кристаллы хлорида натрия выпадают в осадок, что свидетельствует о плотности насыщенного раствора, равной 1,18-1,20.

Раствор свинца нитрата (азотнокислого свинца) (Pb(NO3)2). Соль растворяют в горячей воде порциями при подогревании и постоянном помешивании до полного растворения. На 1 л воды требуется 650 г соли. Фильтровать раствор не обязательно. Плотность насыщенного раствора 1,5. Он обладает высокой флотационной способностью. Однако уже через 24 ч после приготовления плотность несколько падает за счет выпадения частиц соли в осадок. Поэтому перед употреблением раствор подогревают с размешиванием осадка. Плотность уточняют десенси метром.

Нитрат свинца - соль тяжелого металла, при работе с ним следует соблюдать осторожность.

Раствор аммония нитрата (NH4NO3) готовят так же, как и предыдущий раствор. На 1 л воды расходуют 1500 г гранулированного порошка аммониевой селитры. Плотность раствора нитрата аммония должна быть 1,5.

Раствор натрия нитрата (NaNO3) готовят путем добавления на 1 л воды 1 кг азотнокислого натрия. Плотность раствора равна 1,381,40.

Раствор цинка сульфата (ZnSO4-7H2O) приготавливают при добавлении на 1 л воды 400 г сернокислого цинка. Его плотность равна 1,24.

Раствор натрия тиосульфата (Na2S203-5H20) с плотностью 1,4 готовят путем добавления к 1 л воды 1750 г вещества.

Раствор магния сульфата (MgSO4) с плотностью 1,26-1,28 готовят путем добавления 920 г соли ya 1 л воды.

Методы седиментации

Метод последовательных промываний применяют для диагностики трематодозов. Пробу фекалий (3-5 г) кладут в стаканчик или фарфоровую ступку, заливают небольшим количеством воды и, размешивая стеклянной палочкой (в ступке пестиком), добавляют воду до 50-100 мл. Смесь фильтруют через ситечко или марлю (1 слой) и отстаивают 3-5 мин. Затем верхний слой сливают, а к осадку добавляют такое же количество воды и процедуру повторяют до тех пор, пока надосадочный слой не будет прозрачным. Верхний слой сливают, а осадок порциями разливают в чашки Петри или на предметное стекло и микроскопируют.

Модификация метода по Т.Г. Никулину. Учитывая, что при последовательном сливании надосадочной жидкости происходит взмучивание, осадок и часть яиц трематод могут быть слиты. Т.Г. Никулин предложил отсасывать надосадочную жидкость грушей. При массовых исследованиях на наконечник груши надевают кружок из картона (ограничитель). Поскольку во всех пробах в стаканчиках остается одинаковое количество осадка и он не взмучивается, результаты исследований являются более достоверными.

Метод седиментации с целлофановыми пленками по Г.А. Котельникову и В.М. Хренову предложен для диагностики фасциолеза и дикроцелиоза жвачных, аскариоза и трихоцефалеза свиней. Из гидрофильного целлофана толщиной 22 мкм нарезают прямоугольные кусочки 2x3 см и помещают их на 24 ч в бактериологическую чашку с 50%-ным раствором молочной кислоты или глицерина на одни сутки.

После приготовления целлофановых пленок берут пробу фекалий массой 2 г и размешивают в стаканчике с небольшим количеством воды. Взвесь фильтруют через металлическое ситечко или марлю (1 слой) в чистый стакан емкостью 50 мл, отстаивают 15 мин, сливают надосадочную жидкость, а к осадку добавляют 35-40 мл водопроводной воды, опять отстаивают 5 мин, надосадочную жидкость сливают, осадок переносят на предметное стекло и покрывают целлофановой пленкой. Через 8-10 мин проводят микроскопию препарата. Раствор молочной кислоты или глицерина просветляет препарат, а пленка предохраняет его от высыхания.

Флотационно-седиментационный метод Н.В. Демидова применяют для диагностики фасциолеза. Пробу фекалий (от крупного рогатого скота - 5 г, от овец - 3 г) помещают в большой стакан, заливают доверху насыщенным раствором натрия хлорида и тщательно размешивают стеклянной палочкой до получения равномерной взвеси. Взвесь отстаивают 15-20 мин, затем чайной ложечкой или совочком удаляют всплывшие па поверхность грубые частицы. Жидкость отсасывают грушей (при массовом исследовании допускается сливание), оставляя 20-30 мл ее над осадком, к осадку доливают воду до полного объема стакана и тщательно размешивают палочкой. Взвесь фильтруют в большие стаканы, фильтрат отстаивают в течение 5 мин (для фильтрации используют марлю или металлическое ситечко с ячейками 0,25 мм), жидкость из стаканов отсасывают, оставляя на дне 15-20 мл осадка. Осадок перемешивают в конических стаканчиках, большие стаканы прополаскивают водой и выливают, смыв в маленькие, взвесь отстаивают в конических стаканчиках 3-5 мин, а жидкость отсасывают. Эту процедуру повторяют до просветления надосадочной жидкости, затем осадок переносят на предметное стекло и микроскопируют.

Методы флотации

Метод Фюллеборна. В стакане емкостью 200 мл размешивают 810 г свежих фекалий с 20-кратным объемом насыщенного раствора натрия хлорида. После тщательного размешивания смесь фильтруют через металлическое или капроновое ситечко (можно через марлю) в другой чистый стакан емкостью 100 мл и оставляют на 45-60 мин. Затем проволочной петлей с поверхности взвеси берут 3-6 капель и наносят на хорошо обезжиренное предметное стекло, покрывают покровным стеклом и микроскопируют.

Метод Дарлинга. Пробу свежих фекалий массой 5 г смешивают в стакане с водой в соотношении 1:10 и через ситечко или марлю процеживают в другой чистый стакан. Фильтрат отстаивают 5 мин, верхний слой жидкости сливают, не взмучивая осадка, а осадок с небольшим количеством оставшейся жидкости (10 мл) переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют 2 мин при скорости 1500 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, а к осадку приливают жидкость Дарлиига (глицерин, смешанный в равных частях с насыщенным раствором хлорида натрия). Пробирку встряхивают или размешивают палочкой, чтобы осадок смешался с флотационной жидкостью, повторно центрифугируют в течение 2 мин при скорости 1500 об/мин. При наличии в пробе фекалий яиц гельминтов они всплывают на поверхность жидкости в центрифужной пробирке. Гельминтологической петлей берут 3-4 капли с поверхности взвеси, наносят на предметное стекло и микроскопируют.

Метод И.А. Щербовича выполняют по такой же методике, как и Дарлинга, но в качестве флотационной жидкости используют насыщенные растворы натрия гипосульфита или магния сульфата . Поскольку плотность указанных растворов выше, чем плотность жидкости Дарлинга, метод Щербовича используют для диагностики гельминтозов, яйца возбудителей которых имеют больший удельный вес (метастронгилез свиней, трихоцефалез, макраканторинхоз и др.).

Метод Г.А. Котельникова и В.М. Хренова наиболее эффективен при диагностике нематодозов, эймериозов и других паразитозов животных. Он выполняется в двух вариантах.

Суть первого варианта состоит в том, что пробу фекалий массой 3 г кладут в стаканчик, добавляют раствор аммиачной селитры и тщательно размешивают стеклянной палочкой. Затем порциями доливают раствор соли до 50 мл. Полученную взвесь фильтруют через металлическое или капроновое ситечко в другой стаканчик и дают отстояться в течение 10 мин. При диагностике стронгилятозов достаточно, чтобы взвесь отстоялась в течение 3-5 мин. После этого гельминтологической петлей с поверхности взвеси снимают 3-6 капель с разных мест, переносят их на предметное стекло и микроскопируют.

Второй вариант - метод флотации с аммиачной селитрой и с центрифугированием - это модификация метода Дарлинга при использовании в качестве флотационной жидкости насыщенного раствора аммиачной селитры. Он оказывается очень эффективным при диагностике ряда цестодозов, аскаридатозов, стронгилятозов и других паразитов.

Гельминтоларвоскопия

Оборудование и средства. Термостат, центрифуга, микроскоп биологический (МБИ) или микроскоп биологический стереоскопический (МБС), аппарат Бермана, чашки бактериологические, баночки Флоринского, часовые и предметные стекла, пипетки глазные, марля, вата, 0,1%-ный водный раствор метиленового синего, насыщенный раствор цинка сульфата, центрифужные пробирки, пинцеты, ножнички, топкая мягкая проволока, конические стаканчики, стеклянные палочки, раствор Люголя.

Метод Бермана. Пробы свежих фекалий (10 г) помещают завернутыми в марлю или на металлическую сетку в воронку аппарата Бермана. Предварительно резиновую трубку, присоединенную к воронке, закрывают зажимом и в воронку заливают воду комнатной температуры (35-38°С). Фекалии мелких жвачных оставляют в воронке на 4-6 ч, крупного рогатого скота и лошадей - на 10-12 ч. За это время личинки диктиокаулюсов выползают из пробы фекалий в воду и постепенно опускаются по трубке вниз к зажиму. По истечении указанного времени зажим открывают и жидкость из нижней части трубки осторожно сливают в бактериологическую чашку и исследуют под микроскопом.

Метод Бермана-Орлова является модификацией метода Бермана. Б аппарате Бермана на конец резиновой трубки зажим не устанавливают, а плотно присоединяют пробирку. При помещении в воронку с теплой водой фекалий личинки гельминтов оседают на дно пробирки. По истечении необходимого срока (для мелкого рогатого скота - 4-6 ч, для крупного рогатого скота и лошадей - 10-12 ч) пробирку отсоединяют от резиновой трубки, жидкость аккуратно сливают или отсасывают пипеткой, а осадок помещают на предметное стекло или чашку Петри и микроскопируют.

Метод И.А. Щербовича. Пробу фекалий (8-10 г) помещают на кусочек марли, концы которой закручивают тонкой мягкой проволокой и подвешивают в стакан с водой температурой 35-38°С. Пробы фекалий мелких животных и лошадей выдерживают в течение 3 ч, крупного рогатого скота - 12 ч. Затем пробу фекалий из стакана извлекают, воду осторожно (не взболтать) сливают, осадок помещают в центрифужную пробирку и центрифугируют в течение 1 мин со скоростью 1000 об/мин. Надосадочную жидкость в пробирке сливают, осадок переносят на предметное стекло и микроскопируют.

Метод Вайда. На предметное или часовое стекло кладут несколько шариков свежевыделенных фекалий овец или коз и добавляют небольшое количество воды температурой около 40°С. Если шарики помещают на предметное стекло, достаточно нескольких капель воды. Через 40 мин шарики удаляют, оставшуюся жидкость на стекле исследуют под микроскопом па наличие личинок. Методика эффективна при условии, если фекалии плотные. Применяют для диагностики диктиокаулеза, мюллериоза, протостронгилеза, цистокаулеза овец и коз.

Флотация с раствором цинка сульфата - избирательный экспресс-метод диагностики диктиокаулеза по Котельникову и Хренову. Пробы фекалий (по 5 г) овец и коз кладут в стаканчик с раствором цинка сульфата, в течение 1-2 мин энергично разгоняют по кругу, не растирая и не размешивая. Не менее чем через 5-10 мин пробы вынимают пинцетом, взвесь оставляют на 10-15 мин. Затем металлической петлей снимают 6 капель с поверхности жидкости, переносят на предметное стекло и микроскопируют.

Пробы от овец полужидкой консистенции и пробы от телят (5 г) также помещают в стаканчики с раствором цинка сульфата и выдерживают 20-30 мин без разгонки и размешивания. Затем фекалии удаляют, через несколько минут снимают металлической петлей 6 капель с поверхности пленки и микроскопируют. Личинки диктиокаулюсов в поверхностной пленке сохраняют подвижность до 3 ч. Метод обладает избирательностью в отношении личинок диктиокаулюсов. Личинки стронгилят пищеварительного тракта и стронгилоидов деформируются и разрушаются в течение 1-2 мин, личинки мюллериусов свертываются спирально и напоминают пузырьки воздуха.

Культивирование личинок гельминтов

Культивирование личинок гельминтов заключается в создании для их яиц таких условий, при которых они могли бы развиться до формирования инвазионных стадий личинок. По особенностям структуры инвазионных личинок определяют родовую, а иногда и видовую их принадлежность.

Культивирование стронгилят жвачных по методу A.M. Петрова и В.Г. Гагарина состоит в том, что в бактериологические чашки или в стаканчики кладут по 10 г свежих фекалий животных, увлажняют и помещают в термостат при температуре 27-30°С на 7-10 дней. Ежедневно фекалии перемешивают (с целью аэрации) и при необходимости увлажняют. После указанного срока пробы фекалий помещают в аппарат Бермана и из них выделяют личинок стронгилят. Помещают личинок на предметное стекло и микроскопируют с целью дифференциальной диагностики.

Для лучшей аэрации фекалий разработана методика культивирования личинок стронгилят в фекалиях с добавлением в них прокаленных древесных опилок. Соотношение фекалий к опилкам составляет 3:1-5:1. Остальной режим культивирования личинок стронгилят сохраняется таким же, как описано выше. Определение личинок до рода проводится по П.А.Полякову.

Культивирование личинок стронгилят лошадей по П.А. Величкину. В стакан емкостью 100 мл помещают 50 г свежих фекалий лошадей и ставят их в термостат при температуре 25- 27°С. Стаканы сверху обвязывают чистым бинтом, марлей или плотной бумагой, в которой делают небольшое отверстие для аэрации. Срок культивирования личинок 6-7 дней. При культивировании личинок при комнатной температуре (20-22°С) они достигают третьей стадии через 9-10 дней. При температуре ниже 8°С развитие их не происходит. При необходимости фекалии увлажняют и периодически перемешивают.

Для выделения личинок стронгилят лошадей П.А. Величкин рекомендует после окончания срока культивирования пробу фекалий завернуть в марлю и поместить в стакан емкостью 200 мл с теплой (35-36°С) водой. Для предупреждения соприкосновения пробы фекалий с дном стакана в него помещают предметное стекло или металлическую сетку. Спустя 2-3 ч пробу удаляют, верхний слой жидкости сливают, а осадок помещают в бактериологические чашки и микроскопируют. Для лучшей дифференциации личинок их необходимо обездвижить, для чего к осадку в чашку добавляют 8-10 капель раствора Люголя. Личинки стронгилят лошадей покрыты гофрированным чехлом, имеют длинный хвостовой конец. Личинки свободноживущих нематод гофрированного чехлика лишены и у них короткие хвостовые концы. Родовую принадлежность стронгилят лошадей определяют по внутренней структуре личинок. Определение родов и видов личинок стронгилят лошадей проводят по А.М.Петрову и В.Н.Гагарину.

Культивирование личинок стронгилоидесов по Т.И. Поповой проводят в обычных стеклянных стаканчиках, в которые помещают 50-100 г фекалий и выдерживают в течение 1-2 дней при температуре 20-23°С. Вышедшие из яиц личинки стронгилоидесов мигрируют на стенку стакана, образуя серо-белые скопления, которые могут сохраняться до 1 мес. Личинки стронгилоидесов из этих колоний можно использовать для экспериментального заражения животных.

Посмертная диагностика гельминтозов

Полное гельминтологическое вскрытие животных по К.И. Скрябину проводят в тех случаях, когда необходимо иметь полную картину заражения гельминтами всех органов и тканей животных. Для этого перед вскрытием трупа тщательно осматривают его кожные покровы и слизистые оболочки на наличие гельминтов. По правилам обычной секционной техники от трупа отделяют все органы, не нарушая их связи друг с другом. Всю кровь из серозных полостей собирают в кюветы для последующего промывания и исследования. Серозные покровы полостей тщательно осматривают. Затем извлекают спинной и головной мозг, вскрывают конъюнктивальные мешки, синовиальные и носовые полости, лобные пазухи и исследуют их содержимое. Извлеченные органы помещают в отдельную посуду (ведра, кастрюли, кюветы). Изучение их ведется мокрым или сухим способом.

При мокром способе проводят многократное промывание водой или изотоническим раствором натрия хлорида содержимого полостей различных органов с целью выделения гельминтов; исследование содержимого различных отделов желудочно- кишечного тракта методом последовательных промываний и просмотр отмытого материала (матриксов) поочередно на белом и черном фоне; компрессионное исследование слизистых оболочек всех органов; размозжение тканей различных органов между стеклянными пластинками; размозжение тканей отдельных органов с последующим последовательным промыванием их и изучением отмытого матрикса с помощью лупы.

Сухой способ - это раздавливание органов между стеклами до прозрачности и просмотр их под лупой без вскрытия и промывания. Его используют при изучении мелких животных (моллюсков, членистоногих и др.).

Полное гельминтологическое вскрытие очень трудоемко, требует значительных затрат времени и поэтому применяется главным образом при научных исследованиях.

Неполное гельминтологическое вскрытие часто проводят при патологоанатомическом вскрытии трупов животных. При этом из органов и тканей трупа извлекают заметных невооруженным глазом гельминтов или крупные личинки, определяют и подсчитывают их количество. При паразитировании мелких гельминтов или личинок этот метод малоэффективен.

Интенсивность поражения крупными гельминтами неполным гельминтологическим вскрытием учитывают лишь

приблизительно, отмечая слабое поражение (+), среднее (++) и сильное (+++).

Метод порционных гельминтологических вскрытий. Ввиду громоздкости метода полных гельминтологических вскрытий Р.С. Шульцем предложено матриксы из органов исследовать не полностью, а лишь одну четвертую их часть. Можно брать одну пятую, одну десятую часть и т.д. Для этого приготовленный обычным способом матрикс помещают в измерительный цилиндр, тщательно взбалтывают и соответствующую часть отливают в другую посуду. Эту часть исследуют обычными способами, т.е. матрикс просматривают на черном и белом фоне, а также под лупой. Всех обнаруженных паразитов извлекают, подсчитывают, их количество умножают на число частей матрикса (на 4, 5, 10 и т. д.).

Особенности гельминтологического вскрытия птиц. У птиц ощипывают перья и тщательно исследуют поверхность кожи. После снятия кожи и осмотра подкожной клетчатки труп кладут на спину так, чтобы видны были все внутренности, и исследуют отдельные органы. Способом соскоба исследуют слизистую фабрициевой сумки, зоба, железистого желудка, яйцевода. Мышечный желудок вскрывают ножницами вдоль одной из его боковых суженных сторон. Двумя пальцами левой руки захватывают край разрезанной кутикулы и медленно отделяют ее от собственно слизистой оболочки. Внимательно осматривают обнаженную слизистую оболочку и внутреннюю поверхность отделенной кутикулы. Почки исследуют компрессионным методом.

Консервирование гельминтов

Гельминтов, собранных для длительного хранения, необходимо консервировать.

Трематод и цестод вначале кладут в проточную воду и держат до их гибели. Затем их осторожно прессуют в 70%-ном спирте 30- 40 мин в бактериологической чашке между предметными стеклами. Хранят трематод и цестод в 70%-ном этиловом спирте.

Нематод обычно промывают в воде. Филярий и легочных нематод промывают только в изотоническом растворе натрия хлорида. Хранят нематод в жидкости Барбагалло (3%-ный раствор формалина в изотоническом растворе хлорида натрия).

Акантоцефал (скребней), добытых при вскрытии, сначала помещают в воду, затем путем слабого прессования их передних концов выдавливают хоботок, чтобы зафиксировать его в вытянутом положении. Фиксируют акантоцефал в 70%-ном этиловом спирте.

Ларвоцист цестод (цистицерков, ценурусов, эхинококков, альвеококков) фиксируют жидкостью Барбагалло. Органы, пораженные гельминтами, фиксируют в 10%-ном растворе формалина.

Во всех случаях количество фиксирующей жидкости должно в 20 раз превышать объем фиксируемого материала.

Хранение и пересылка гельминтологического материала

Законсервированный и этикетированный материал хранят в плотно закупоренной посуде. Пробирки с гельминтами помещают в большую банку с притертой пробкой, наполненную консервирующей жидкостью. Пробирки можно ставить в несколько ярусов, перекладывая их слоем ваты. В таком виде гельминты сохраняются длительное время.

Пересылать гельминтологический материал можно в пробирках или банках, хорошо упакованных в деревянные ящики. Патологоанатомические препараты, фиксированные в 10%-ном растворе формалина, можно пересылать без жидкости. Орган, извлеченный из фиксирующей жидкости, заворачивают во влажную вату или марлю, помещают в целлофановый пакет, а затем упаковывают в плотный ящик.

Методы выявления и исследования простейших. Пироплазмиды

Для выявления пироплазмид исследуют мазки крови от животных, больных или подозреваемых в заболевании. Б случае гибели или вынужденного убоя больных животных мазки можно готовить из содержимого сосудов мозга, селезенки, печени, почек, легких и пораженных лимфатических узлов. Мазки готовят только из органов свежих трупов, так как в них паразиты быстро лизируются, особенно при высокой температуре окружающей среды. Б необходимых случаях принимают меры для исключения инфекционных болезней.

Используют хорошо обезжиренные стекла. Кровь для исследования лучше всего брать из периферических сосудов ушной раковины. Место взятия подготавливают путем выстригания волосяного покрова, затем проводят дезинфекцию и обезжиривание этиловым спиртом, спиртом-эфиром. Инъекцию проводят иглой или подрезают ножницами кончик уха.

Каплю крови в диаметре не более 2-3 мм, выступающую на месте прокола, наносят на край обезжиренного предметного стекла и делают мазок. Очень важно мазок подготовить с первой капли крови, т.к. в ней значительно больше пораженных пироплазмидами эритроцитов. Следующий мазок необходимо готовить из свежей капли крови после удаления сгустка с места инъекции.

Изготовление мазков необходимо проводить в период повышения температуры тела животных и появления первых клинических признаков, до введения специфических препаратов. Мазки просушивают на воздухе 10-20 мин, избегая воздействия прямых солнечных лучей и ограничивая доступ мух. Затем их подписывают иглой или простым карандашом, указывая вид и номер животного, дату и место взятия.

Для фиксации используют метиловый спирт, которым заливают мазки крови на 3-5 мин, после этого стекла вынимают и высушивают 15-20 мин.

Можно фиксировать смесью равных частей абсолютного этилового спирта и эфира или только этиловым спиртом 15-20 мин.

Хорошо подготовленный мазок должен быть равномерным и тонким. Б толстых мазках эритроциты и находящиеся в них паразиты обнаруживаются с большим трудом.

Окраску можно производить по Романовскому-Гимзе. Для приготовления рабочего раствора краски на 1 мл дистиллированной воды добавляют 1-3 капли основного раствора краски. Рабочий раствор лучше всего подслаивать под стекло с мазком. Б этих случаях на мазке не остается микрочастиц нерастворившейся краски, что облегчает при микроскопии поиск кольцевидных форм пироплазмид и дифференциальную диагностику. Длительность прокрашивания мазков составляет 3040 мин. По истечении этого срока краску смывают, мазок промывают дистиллированной водой, высушивают и исследуют с использованием микроскопа. Качество окраски зависит от рН среды (оптимальной средой является 6,8-7,0). Правильно окрашенные мазки имеют розовый цвет с фиолетовым оттенком. Эритроциты окрашиваются в розовый цвет, протоплазма лимфоцитов - в синий, их ядра - в темно-фиолетовый, протоплазма паразитов - в голубой, кусочки хроматина - в темно- красный или красный цвет.

Исследуют мазки под микроскопом с иммерсионной системой.

Диагностика эймериозов и изоспорозов

Для выявления наличия ооцист эймерий и изоспор из фекалий, содержимого кишечника и другого материала используется несколько методов.

Метод нативного мазка наиболее простой и легко выполнимый в любых условиях, не требующий специальной аппаратуры и реактивов для обнаружения ооцист.

На чистое предметное стекло пипеткой наносят 2-4 капли чистой воды (дистиллированной, водопроводной), к ним добавляют небольшое количество фекалий и перемешивают. Мазок накрывают покровным стеклом и исследуют под малым (х 8,10) и средним (х 40) объективом . Вместо фекалий можно исследовать таким же образом соскобы оболочек кишечника.

При небольшой степени заражения ооцист выявить таким методом трудно, однако при высоком заражении он дает возможность сравнительно достоверно определить интенсивность инвазии.

Более точные результаты получают при использовании различных растворов, имеющих большой удельный вес. Б таких растворах ооцисты через некоторое время всплывают на поверхность.

Наиболее распространенными флотационными методами являются следующие: методы Фюллеборна, Дарлинга, Щербовича, Котельникова и Хренова и др. (см. Гельминтоовоскопия).

Исследование эймериид в пораженных органах. Для исследования на наличие эймериид у животных отбирают кусочки тонкого и толстого кишечника, у кроликов, кроме того, печень, у гусей также почки. Материал помещают в фиксирующую жидкость - 10%-ный раствор формалина или 96%-ный этиловый спирт. Лучше всего использовать нейтральный формалин, для приготовления которого используют порошок углекислого кальция (мел), 10% его добавляют к объему формалина и дают отстояться 5-6 дней, затем хранят с осадком.

Фиксацию материала лучше производить в стеклянной посуде. Б зимнее время в качестве фиксирующей жидкости лучше использовать этиловый спирт. Ее, независимо от времени года, рекомендуется через сутки заменять. Если в одну банку помещают кусочки органов от разных животных, их рекомендуется завернуть в марлевые мешочки. Внутрь банки с фиксирующим материалом помещают бумажную этикетку, на которой графитным карандашом указывают вид животного, его номер и дату взятия материала.

Приготовленные гистологические срезы лучше всего окрашивать гематоксилин-эозином.

При необходимости сохранения ооцист эймериид на длительное время используют 5%-ный раствор формалина, 0,1%-ный раствор калия двухромовокислого , жидкость Барбагалло (3%-ный раствор формалина на изотоническом растворе натрия хлорида ).

Токсоплазмы

Для выделения токсоплазм используют органы павших животных: головной мозг, лимфатические узлы, печень, селезенку, легкие, плаценту и органы абортированного плода. Вначале готовят мазки-отпечатки из пораженных органов, которые фиксируют метиловым спиртом (этиловым) и окрашивают по Романовскому-Гимзе. Отбор органов и приготовление мазков производят не позже 2-3 часов после убоя или падежа животных. Указанным способом выделить токсоплазм удается не всегда.

Более эффективным способом является постановка биопробы на белых мышах.

Для этого отобранный материал из внутренних органов растирают с небольшим количеством изотонического раствора натрия хлорида и полученную суспензию вводят 3-5 белым мышам внутрибрюшинно по 0,5 мл. Б положительных случаях на 5-7 день развивается болезнь, при которой в брюшной полости накапливается экссудат, содержащий большое количество токсоплазм. При отрицательной биопробе, а также для накопления токсоплазм можно проводить 3-5 «слепых пассажей» путем введения суспензии головного мозга мышам от зараженных ранее белых мышей новой партии мышам.

Методическими указаниями по лабораторным исследованиям на токсоплазмоз животных, утвержденными 21.01.84, рекомендуется для обогащения материала цистами применять метод искусственного переваривания в желудочном соке. Патматериал (лимфоузлы, продолговатый мозг абортированного плода) измельчают, 50 г фарша помещают в колбу емкостью 1 литр и заливают 10 объемами искусственного желудочного сока. Колбу помещают в термостат при температуре 37°С на 1,5 часа. Полученную массу фильтруют через марлю, затем фильтрат центрифугируют при 2 тыс. об./мин. в течение 15 минут. После удаления надосадочной жидкости осадок ресуспензируют в двойном объеме изотонического раствора с добавлением антибиотиков (пенициллин, стрептомицин по 1 тыс. ЕД на 1л суспензии). Суспензию в дозе 0,3 мл вводят внутрибрюшинно 3-5 белым мышам.

Для обнаружения токсоплазм готовят мазки из содержимого брюшной полости или мазки-отпечатки из головного мозга, фиксируют, затем окрашивают по Романовскому-Гимзе.

Наличие возбудителя в организме животных может быть подтверждено путем использования РСК (РДСК), которую ставят в соответствии с «Временным наставлением по применению токсоплазмозного антигена Каз.НИВИ и института зоологии АН Каз.ССР в реакции связывания комплемента РСК (РДСК) для серологической диагностики токсоплазмоза и токсоплазмоносительства у животных».

Саркоцисты

Для обнаружения саркоцист исследуют у овец шейную часть пищевода, скелетные мышцы. Находят макроцисты величиной с просяное зерно и больше.

У свиней их можно обнаружить в мышцах диафрагмы, межреберных и др. Саркоцисты освобождают от окружающей ткани, на предметном стекле разрушают в 2-3 каплях изотонического раствора натрия хлорида, затем каплю суспензии микроскопируют при среднем увеличении микроскопа с опущенным конденсором. В положительных случаях обнаруживают банановидные (серповидные) мерозоиты. Обнаружение микроцист производят путем исследования срезов величиной с овсяное зерно с мышц пищевода, диафрагмы, сердца, скелета. Срезы исследуют в раздавленном в компрессории виде под малым увеличением микроскопа. Их можно окрашивать по Романовскому-Гимзе, генцианвиолетом, метиленовой синью и др. Саркоцист можно также обнаружить и при гистологическом исследовании пораженных тканей. Отобранные кусочки ткани фиксируют в 10% растворе нейтрального формалина. Гистосрезы готовят общепринятыми методами, а окрашивают гематоксилин- эозином.



Трихомонады

Выделение трихомонад производят путем микроскопического и культурального исследования патологического материала (истечения и смывы из половых органов, околоплодная жидкость, соскобы с плаценты, содержимое сычуга абортированного плода, секрет придаточных половых желез, спермы).

Для обнаружения подвижных трихомонад наносят на предметное стекло патологический материал в виде толстого мазка или делают раздавленную каплю и микроскопируют вначале под малым, затем средним увеличением микроскопа при затененном поле зрения микроскопа. Мазок можно окрашивать по Романовскому-Гимзе с предварительной фиксацией в метиловом спирте.

Посевы исследуемого материала производят на специальные питательные среды (среда Петровского) в количестве 0,3-0,5 мл из осадка пробы. Материал помещают в термостат при 37⁰С и исследуют на 3, 5, 7 и 10 день. Уже через 24-46 часов может наблюдаться рост трихомонад.

Вышеуказанные методы используются для выделения трихомонад при поражении половых органов у крупного рогатого скота.

У свиней, птиц трихомонады обитают в кишечнике и некоторых других органах. Для выделения паразитов используют соскобы с пораженных органов и исследуют нативным мазком.

Имеются данные о том, что и эти трихомонады хорошо растут на искусственных питательных средах.

Балантидии

Выделение балантидий производят путем исследования свежевыде-ленных фекалий или взятых из прямой кишки животного. Материал необходимо подвергнуть исследованию не позднее 2-3 часов после его взятия. Трупы свиней на наличие балантидий исследуют в течение 5-6 часов после смерти животного. Б более поздние сроки балантидий обнаружить не удается в связи с их лизисом. По некоторым данным (А.И.Федоров, 1980) трупы следует подвергать исследованию на обнаружение балантидий в течение 1,5-2 часов после убоя или гибели поросят.

Микроскопическое исследование фекалий лучше всего провести непосредственно на ферме, используя метод нативного мазка. Для этого берут небольшое количество фекалий, помещают на предметное стекло и равномерно перемешивают с равным количеством теплого изотонического раствора натрия хлорида или дистиллированной воды (температура не более 37,0°С), накрывают покровным стеклом и просматривают мазок под малым увеличением микроскопа. Б положительных случаях обнаруживают вегетативные формы и цисты балантидий. Под микроскопом отчетливо видны крупные, быстро передвигающиеся при помощи ресничек паразиты.

При необходимости гистологического исследования отбирают кусочки стенок толстого и тонкого кишечника, желудка, лимфоузлов, паренхиматозных органов и фиксируют в 10% растворе формалина. Гистосрезы окрашивают гематоксилин- эозином.

Обследование животных с целью обнаружения паразитических клещей

Для обнаружения чесоточных клещей делают соскобы кожи. С этой целью путем осмотра на животном находят свежие чесоточные поражения и на границе здоровой и больной ткани брюшистым скальпелем соскабливают (до крови) верхний слой кожи. Если там нет выраженных очагов поражения, соскобы делают со складок или уплотненной кожи, где могут находиться чесоточные клещи.

У крупного рогатого скота, свиней, лошадей, овец соскобы делают более глубокие. У птиц их делают под роговыми чешуйками передней поверхности конечностей, с кожи и перьев. С этой целью роговые чешуйки выщипывают.

Если предполагается немедленное исследование, соскобы помещают в чашку Петри, если позже - их хранят в пробирке, которую обязательно плотно зарывают резиновыми пробками.

Исследование неподвижных чесоточных клещей. Соскобы кожи помещают в чашку Петри, стеклянный стаканчик или в пробирку и заливают 10 частями 10%-ного раствора натрия или калия гидроокиси и подогревают в течение 10-15 минут до температуры 80-90⁰С. После этого соскобы небольшими порциями переносят на предметное стекло, материал тщательно расщепляют препаровальными иглами, накрывают покровным стеклом и микроскопируют.

Метод Г.З. Шика. Соскоб в количестве 1 г помещают в центрифужную пробирку, заливают 1- мл 10%-ного раствора калия гидроокиси, помешивая подогревают до температуры 50-60⁰С в течение 20 мин, а затем центрифугируют. Жидкость из пробирки сливают, а осадок переносят на предметное стекло и микроскопируют.

Метод Н.Н.Богданова. Соскобы с кожи помещают на черную бумагу, подогревают до 28-30⁰С. Под действием тепла паразиты выползают из соскобов, их собирают с помощью препаровальной иглы, помещают на предметное стекло и исследуют с помощью микроскопа.

Метод А.В. Алфимовой. Соскобы кожи помещают в чашку Петри и ставят в термостат при температуре 37-40⁰С. Через 5 минут чашку Петри из термостата вынимают и влажной кисточкой со дна собирают двигающихся клещей, помещают на предметное стекло и микроскопируют.

Исследование клещей демодекс. Осматривают и пальпируют кожу больного животного. При обнаружении бугорков (величиной до горошины и более) шерсть над ним выстригают и поверхность обрабатывают этиловым спиртом. Бугорок прокалывают стерильной иглой для взятия крови. Содержимое из иглы извлекают мандреном, помещают на предметное стекло, добавляют несколько капель воды или глицерина, препарат покрывают стеклом и микроскопируют.

Сбор и консервирование насекомых

С целью определения видового состава, численного соотношения и изучения биологических особенностей насекомых осуществляют сбор или отлов их на теле или вне тела животного.

Способы сборы насекомых на теле животных. Наиболее эффективным способом отлова насекомых на животных является сбор их с тела в дни и часы интенсивного нападения или при постоянном обитании эктопаразитов. Однако этот способ не позволяет полностью выявить видовой состав тех или иных групп и видов насекомых и практически абсолютно исключает сбор самцов комаров, мошек, мокрецов и других, которые на животных не нападают, так как питаются растительными соками. Поэтому отлов насекомых необходимо проводить в помещениях или местах их наибольшего скопления. Для отлова насекомых используют в основном энтомологический сачок. Спокойно сидящих крупных двукрылых насекомых берут непосредственно пальцами рук, стараясь не травмировать насекомое, или пинцетом.

Для отлова мелких насекомых, мокрецов, комаров, мошек, москитов можно применять пробирки или всасывающие устройства - эксгаустеры. Бласоедов, пухопероедов, вшей, блох собирают на теле хозяина с учетом их локализации. До начала сбора тело животного увлажняют одним из инсектицидов, а затем при помощи жесткой кисточки или плотным гребешком, пинцетом вычесывают насекомых в воронку, закрепленную в пробирке, или на бумагу.

Личинок оводов, куколок кровососок собирают, учитывая их локализацию в тканях, органах, полостях тела хозяина.

Сбор насекомых вне тела хозяина. Отлов слепней, оводов, мух производят энтомологическим сачком около животных, на приманочных заборах, на шкурах или возле трупов павших животных. Мух-коровниц отлавливают над коровяками, на пастбище, а домашних мух - в помещениях для скота, молочных блоках. Возможно применение различных мухоловок, а для гематофагов использую чучелообразную ловушку К.В.Скуфьина.

Для получения взрослых оводов их выращивают из зрелых личинок в садках или стеклянных банках на слое сухого песка при температуре 18-25°С. После окукливания через 20-30 дней вылупляются имаго оводов.

Консервирование насекомых в жидкостях. При сборе насекомых используются консервирующие жидкости, в которых хранят власоедов, блох, мокрецов, мошек, москитов, личинок или отсеченные головы и другие фрагменты мух для приготовления постоянных препаратов. Используется 70°-ный этиловый спирт, 5%- ный водный раствор формалина или 3%-ный раствор формалина на 0,85%-ном изотоническом растворе натрия хлорида (жидкость Барбагалло). Объем жидкости должен в 10-20 раз превышать объемное количество насекомых, и ее необходимо сменить через сутки после погружения материала.