Вплив стресу на вроджену та набуту поведінку щурів за умов дії засобів з антиоксидантними властивостями

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Вплив стресу на вроджену та набуту поведінку щурів за умов дії засобів з антиоксидантними властивостями

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. У наш час стрес розглядається як загальнобіологічний сформований в результаті еволюції феномен генетично детермінованої адаптивної реакції, спрямованої на успішне виживання в умовах мінливості зовнішнього середовища. Адаптивна відповідь є неспецифічною, тобто має відносну незалежність реакцій від характеру впливу зовнішніх або внутрішніх чинників. Водночас стрес складає нерозривну єдність зі специфічними реакціями, що відбуваються на усіх рівнях організації - від молекулярного до рівня організму. Стресова відповідь значною мірою залежить від індивідуальної реактивності людини та тварин і визначається станом їх нейрогуморальних регуляторних механізмів [Г. Селье, 1982; Greenberg et al., 2002]. Численними дослідженнями показано залежність стрес-резистентності за умов впливу різноманітних чинників від таких індивідуальних властивостей, як тип вищої нервової діяльності (ВНД) [D. Wrona et al., 2006], сила нервової системи [J. Strelau, 1996; Bellani et al., 2005], вихідний рівень активації [О.И. Родионова и др., 2003; D.W. Pfaff et al., 2007], емоційна лабільність та тривожність [Г.Г. Аракелов и др., 1997; P.J. Conrad, 2006]. Залишається актуальним дослідження поведінкового компоненту стрес-відповіді, оскільки у розвитку адаптивної реакції стрес-асоційовані когнітивні процеси та поведінкові реакції набувають вирішального значення з огляду на їх спрямованість на оцінку ризику та можливості успішного пристосування, а також на реалізацію відповідних адаптивних поведінкових стратегій.

Вважається, що стрес є неспецифічним компонентом багатьох неінфекційних захворювань, у тому числі патологій центральної нервової системи (ЦНС) [A. Trentani et al., 2005; R.B. Leistad, 2007]. Активація вільнорадикального окиснення (ВРО) є загальною ланкою патогенезу та одним з найважливіших проявів відповіді організму на стрес [В.А. Барабой, 2006; K.G. Karageuzyan, 2005]. Значні стресові навантаження призводять до збільшення інтенсивності ВРО та порушення функціонування антиоксидантних систем організму, що призводить до змін складу, структури та проникності мембран, та як наслідок, функціонального стану організму в цілому [Ю.А. Зозуля, 2000; В.А. Барабой, 2006]. Біохімічні та фізіологічні особливості тканини головного мозку (підвищений вміст ненасичених жирних кислот у мембранах, інтенсивний метаболізм) обумовлюють її особливу вразливість до активації вільнорадикальних процесів [А.А. Болдырев, 2001; В.А. Барабой, 2006]. З огляду на це важливе значення у профілактиці та лікуванні різноманітних стрес-обумовлених порушень мають терапевтичні підходи контролю процесів ВРО шляхом введення екзогенних антиоксидантів (АО). Є думка про обґрунтованість включення АО у антистресову терапію будь-якої етіології [В.А Барабой, 2006; E. Sahin, S. Gumuslu, 2004], це підтверджується повідомленнями про зменшення вираженості стресових ефектів in vivo при застосуванні засобів з антиоксидантними властивостями [S. Manikandan et al., 2005; K. Tsiakitzis et al., 2005]. Разом з тим, є необхідним всебічне вивчення дії АО, зокрема особливостей їх впливу на стан функціональної активності центральної нервової системи.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано в рамках науково-дослідних робіт Київського національного університету імені Тараса Шевченка «Дослідити системні, клітинні та молекулярні механізми діяльності нервової системи, внутрішніх органів та рухового апарату організму людини та тварин в нормі та патології» (№держреєстрації 0106U005751) та ДУ «Науковий центр радіаційної медицини АМН України» «Ефективність антиоксидантних засобів, що зменшують негативні наслідки впливу іонізуючого випромінювання на стан вищої нервової діяльності тварин, залежно від часу застосування» (№держреєстрації 0106U002354), останнє - згідно договору про наукове співробітництво між кафедрою ФЛТ КНУ імені Тараса Шевченка та лабораторією нейрофізіології ДУ «НЦРМ АМН України».

Мета і завдання дослідження. Метою дослідження було вивчити закономірності викликаних стресом змін вродженої та набутої поведінки щурів та дослідити можливість модифікації цих поведінкових змін засобами з антиоксидантними властивостями.

Для досягнення поставленої мети вирішували такі завдання:

1. Дослідити зміни різних аспектів поведінки за використання моделей іммобілізаційного, емоційно-больового та радіаційного стресу.

2. Визначити модель стресу та методики дослідження поведінки для вивчення можливості модифікації постстресових поведінкових наслідків засобами з антиоксидантними властивостями.

3. Дослідити можливість модифікації стрес-індукованих змін поведінки щурів застосуванням засобів з антиоксидантними властивостями.

4. Визначити ефективність різних схем застосування антиоксидантного засобу для модифікації постстресових поведінкових наслідків.

Об'єкт дослідження - поведінка та вища нервова діяльність за впливу стресу.

Предмет дослідження - вроджена та набута поведінка щурів після впливу різних форм стресу, оксидантний механізм впливу стресу на поведінку.

Методи дослідження - поведінкові, статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Встановлено закономірності змін різних аспектів вродженої та набутої поведінки щурів за використання моделей іммобілізаційного, емоційно-больового та радіаційного стресу. Розроблено методологічний підхід щодо вивчення можливості модифікації постстресових поведінкових наслідків засобами з антиоксидантними властивостями. Вперше досліджено вплив адіахрому на вроджену поведінку стресованих тварин.

Практичне значення одержаних результатів. Результати дослідження розширюють існуючі уявлення про вплив стресу на вищу нервову діяльність та визначають перспективні напрямки подальших досліджень постстресових поведінкових ефектів. Розроблений методологічний підхід може використовуватися для вивчення ефективності засобів корекції поведінкових зрушень внаслідок радіаційного або інших стресорних чинників. Доведена можливість запобігання кверцетином постстресових змін ВНД, визначено ефективні час та схему його застосування. Одержані результати можуть стати підгрунтям для більш широкого використання антиоксидантних засобів у разі впливу різних стресорних чинників, дія яких опосередковується розвитком оксидантного стресу.

Особистий внесок здобувача. Особистий внесок дисертанта в роботу полягає у визначенні разом з науковим керівником актуальності, мети та завдань роботи, формулюванні основних положень та висновків. Автором здійснювалося написання огляду літератури, проведення експериментів, статистична обробка результатів, їх узагальнення та науковий аналіз.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації були представлені та обговорені на 10-тій Міжнародній конференції з біологічної психіатрії «Стрес та поведінка» (Санкт-Петербург, 2007), Міжнародній конференції «Біологія ХХІ століття: теорія, практика, викладання» (Черкаси, 2007), Конференції Федерації європейських фізіологічних товариств (Братислава, 2007), Російській науковій конференції «Медико-біологічні проблеми токсикології та радіології» (Санкт-Петербург, 2008), Міжнародній конференції «Радіопротектори, що ефективні при дії хронічного опромінення у малих дозах» (Миколаїв, 2008), IV Міжнародному міждисциплінарному конгресі «Нейронаука для медицини та психології» (Судак, 2008), IV Міжнародній науковій конференції «Психофізіологічні та вісцеральні функції в нормі та патології» (Київ, 2008), Науково-практичної конференції «Біологічно активні речовини: фундаментальні та прикладні питання отримання та застосування» (Новий Світ, 2009).

Публікації. Результати досліджень опубліковано в 3 статтях у фахових виданнях та 8 збірках тез наукових національних та міжнародних конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 116 сторінках машинописного тексту та складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів та методів досліджень, 2 глав з результатами досліджень з їх обговоренням, узагальнення результатів, висновків та списку використаних джерел. Робота ілюстрована 28 рисунками, містить 9 таблиць. Бібліографія включає 325 джерел, у тому числі 261 іноземних видань.

Основний зміст роботи

Матеріали та методи досліджень

Експериментальні тварини та обсяг досліджень. Дослідження проведені на 386 білих нелінійних щурах самцях віком 2-3 місяці з початковою масою тіла 180±20 г. у дев'яти експериментах. Щури утримувалися у віварії за природного режиму освітлення та стандартного харчового раціону. Експерименти проводилися у відповідності до існуючих вимог щодо використання експериментальних тварин.

Поведінку щурів після впливу різних форм стресу досліджено у трьох експериментах, проведених на 88 тваринах. Вивчення можливості модифікації постстресових поведінкових ефектів засобами з антиоксидантними властивостями проведено у шести експериментах на 298 щурах.

Моделювання різних форм стресу. Використовували моделі іммобілізаційного, емоційно-больового та радіаційного стресу. Іммобілізаційний стрес [М.B. Mьller et al., 2003] створювали шляхом добового вміщення тварин у перфоровані циліндри, у яких щури не мали змоги рухатись. Емоційно-больовий стрес [M.L. Andersen et al., 2004] створювали шляхом футшоку. Тварин вміщували у камеру, де вони зазнавали аверсивної стимуляції впродовж 40 хв. Параметри футшоку - 60 подразнень тривалістю 10 с з інтервалом 2,5-47,5 с стабілізованим електричним струмом силою 0,8 мА. Радіаційний стрес [L. Lebaron-Jacobs et al., 2004] створювали гострим тотальним опроміненням тварин у дозі 2,5 Гр з використанням установки «Рокус» (джерело - ⁶⁰Cо; потужність дози 1,12 Гр/хв).

Антиоксиданти використовували для вивчення можливості модифікації постстресових поведінкових ефектів. Тварини отримували per os щоденно впродовж 2 тижнів такі сполуки: адіахром у дозі 25 мг/кг (речовину синтезовано на хімічному факультеті КНУ імені Тараса Шевченка), комбінацію 50 мг/кг альфа-токоферолу та 100 мг/кг аскорбату, кверцетин у дозі 100 мг/кг (Acros organics, Бельгія).

Методи та методики дослідження: поведінкові та статистичні.

У відкритому полі досліджували вроджену локомоторну поведінку щурів впродовж 5 хв. Визначали та аналізували показники рухової та дослідницької активності (кількість відвіданих центральних та пристінкових квадратів, вертикальних стійок; загальну тривалість завмирання) та параметри грумінгу (кількість та тривалість актів) [A.V. Kalueff, 2003; F. Fernandez et al., 2004].

У Суок-тесті, або тесті піднятої алеї, досліджували вроджену локомоторну поведінку тварин впродовж 5 хв. Визначали та аналізували показники рухової та дослідницької активності тварин (кількість перетнутих сегментів алеї, заглядань вниз, орієнтацій, вертикальних стійок; латентний період виходу з центру алеї та кількість його перетинань; кількість падінь та зісковзувань), а також параметри грумінгу (кількість та тривалість актів) [A.V. Kalueff et al., 2005].

У піднятому хрестоподібному лабіринті досліджували поведінкову активність щурів впродовж 5 хв. Визначали та аналізували показники рухової та дослідницької активності (кількість та тривалість виходів у відкриті та закриті рукави лабіринту, кількість вертикальних стійок, кількість заглядань вниз із відкритих ділянок рукавів, кількість переходів через центральну платформу лабіринту та час, проведений у її межах, час загальної нерухомості тварини), а також параметри грумінгу (кількість та тривалість актів) [C. Lee, R.J. Rodgers, 1992; A.V. Kalueff, 2003].

У тесті Порсолта досліджували вроджену локомоторну поведінку тварин впродовж 5 хв плавання у басейні (скляний циліндр діаметром 50 см та висотою 60 см на 2/3 заповнений водою, температура якої була 24°С). Визначали та аналізували показники латентного періоду та загальної тривалості іммобільності тварин [R.D. Porsolt et al., 1977; A.V. Kalueff, 2003].

У шестипроменевому радіальному лабіринті впродовж 5 хв досліджували поведінку щурів після добової харчової депривації. Визначали та аналізували такі показники: середні латентні періоди заходу у промінь та взяття харчового підкріплення (сир); загальні кількості помилок та заходів у промені із взяттям підкріплення; час до отримання твариною останнього підкріплення; загальну кількість заходів у промені (рухову активність); загальний час, проведений у центральній камері та у променях [D.S. Olton et al., 1977; Я. Буреш и др., 1991].

У човниковій камері за модифікованою методикою [В.В. Варецький та ін., 2004] досліджували двостороннє активне уникання щурами аверсивного підкріплення (стабілізований електричний струм силою 0,8 мА). Рандомізовано подавали два умовних подразника: звуковий та світловий, один з яких був основним (на який тварина мала здійснити реакцію уникнення), а другий - додатковим (реакція тварини на який негативно підкріплювалася). Параметри застосування сигналів: кількість спроб (циклів поєднання умовного та безумовного подразників) у сесії - 100, тривалість дії умовного сигналу до початку дії безумовного подразника - 4 с, тривалість одночасної дії умовного та безумовного подразників - 10 с, міжсигнальний період - 25,0±22,5 с. Кожне наступне тестування проводили за умов зміни значущості умовних подразників (використання як основного чи додаткового). Визначали та аналізували показники кількості умовних реакцій (УР) активного уникання у% до максимально можливої, середньої кількості УР у серіях, кількості спроб до реалізації першої УР, середньої тривалості латентного періоду УР, кількості міжсигнальних реакцій та спроб до першої міжсигнальної реакції.

У камері Скіннера (Rhema Labortechnik, Німеччина) досліджували оперантну діяльність з позитивним підкріпленням (молоко) за режиму фіксованого співвідношення у щурів після добової питної депривації [Я. Буреш и др., 1991]. Такий режим підкріплення було обрано як більш чутливий у порівнянні з режимом фіксованого інтервалу [P.C. Mele et al., 1990]. Для запобігання зменшення мотивації тварин фіксоване співвідношення кожні два тижні збільшували на одиницю. Визначали впродовж 30 хв та аналізували показники загальної кількості інструментальних умовних реакцій (кількість взяття підкріплення) та оперантної активності (кількість натиснень на педаль).

Методи статистичного аналізу результатів. Значущість різниць між вибірками оцінювали з використанням критеріїв Мана-Уітні, Вілкоксона, а також критерію Стьюдента після нормалізації розподілу варіант [О.Ю. Реброва, 2002]. Критичний рівень значущості статистичних методів (ймовірність помилкового відхилення нульової гіпотези) був менше 5%. У роботі ненормально розподілені дані представлені у вигляді Ме [25%; 75%] (тобто медіана [інтерквартильний розмах]), а нормально розподілені - у вигляді М±m (тобто середнє значення±помилка середнього). При розрахунках використовували комп'ютерні програми Microsoft Office Excel 2003 та Statistica 6.0.

Результати досліджень та їх обговорення

Дослідження поведінки з використанням моделі іммобілізаційного стресу проводилося із застосуванням тесту відкритого поля на 1, 3, 5, 7 та 14 дні та Суок-тесту на 4 та 8 дні після стресу.

У відкритому полі добова іммобілізація призводила до пригнічення локомоторної активності на 1 день після стресу: кількість перетнутих квадратів у групі контроль становила 58 [37; 61], а у групі стрес - 22 [17; 35] (p<0,05). На 3 день після іммобілізації відмінності між групами збільшувалися: у групі контроль цей показник становив 59 [29; 72], а у групі стрес - 13 [7; 32] квадратів (p<0,05). На 5 день після стресу показник локомоторної активності контрольних тварин невірогідно зменшувався у порівнянні з вихідним рівнем та становив 34 [25; 49] квадрата, проте продовжував відрізнятися від такого у групі стрес, де його значення було 19 [5; 24] квадратів (p<0,05). На 7 день після іммобілізації локомоторна поведінка не відрізнялася у контрольній та стресованій групах (відповідно 24 [17; 33] та 14 [5; 31] перетнутих квадратів), проте на 14 день після іммобілізації знову було виявлено значні вірогідні розбіжності між експериментальними групами тварин (контроль - 50 [32; 73], стрес - 8 [4; 31] квадратів, p<0,05). Отже, в той час коли локомоторна активність контрольних щурів майже поверталася до початкового рівня, щури, які зазнали іммобілізації, залишалися малоактивними. Можливо, низький рівень локомоції за два тижні після стресу є відставленим наслідком стрес-індукованого інгібування поведінки. Також не виключено, що у стресованих тварин зсув балансу у бік неофілії мав певну затримку у часі і тому не був виявлений впродовж проведених тестувань.

Дослідницька активність у відкритому полі, яку оцінювали за показником кількості вертикальних стійок, значно і тривало пригнічувалася у стресованих тварин (рис 1.). Динаміка змін вертикальної активності повторює зміни локомоторної активності у відповідні терміни, що свідчить про однотипний вплив стресу як на локомоторний, так і на дослідницький паттерни поведінки щурів. Наслідком іммобілізаційного стресу було інгібування вродженого поведінкового репертуару тварин, який є характерним під час перебування у помірно аверсивному середовищі за умов поступового звикання до нього.

Водночас здебільшого не знайдено відмінностей у проявах грумінгової активності між контрольною та стресовою групами щурів. Збільшення тривалості грумінгу у стресованих тварин порівняно з контролем (відповідно 30 [13; 107] с та 10 [6; 26] с, p<0,05) спостерігалося лише на 1 день після іммобілізації, що можна пояснити станом шкіри щурів після добового знерухомлення. Тобто активація грумінгу, на нашу думку, мала гігієнічний, а не стрес-реактивний характер.

Дослідження у Суок-тесті не виявило значущої різниці у локомоторній поведінці між контрольними та стресованими щурами в обох тестуваннях після іммобілізації. Серед усіх показників дослідницької активності на 4 день після стресу відрізнявся лише показник кількості заглядань вниз, який складав у групі контролю 8 [4; 10], а у групі стресу - 13 [11; 17] (p<0,05). На 8 день після іммобілізації знайдено різницю між контрольною та стресованою групами тварин у кількості реакцій орієнтацій (відповідно 2 [0; 5] та 7 [2; 9], (p<0,05)). Не було знайдено вірогідної різниці між стресованими та контрольними тваринами за показниками кількісті переходів через центр алеї та латентного періоду виходу щурів з центру алеї, а також кількості та тривалості актів грумінгу.

Таким чином, гострий іммобілізаційний стрес призводить до пригнічення локомоторного та дослідницько-пошукового аспектів вродженого поведінкового репертуару щурів у тесті відкритого поля; водночас, за умов певного підвищення аверсивності середовища (у Суок-тесті) суттєві зміни локомоторної та дослідницької поведінки щурів не проявляються.

Дослідження впливу на поведінку емоційно-больового стресу проводилося з застосуванням тесту відкритого поля на 1, 3, 5, 7 та 14 дні після стресу; Суок-тесту на 4 та 8 дні та радіального лабіринта на 5 та 15 дні після стресу.

У відкритому полі на 1 день після емоційно-больового стресу локомоторна активність стресованих щурів збільшувалася до 60 [20; 79] перетнутих квадратів, майже вдвічі перевищуючи цей показник у групі контролю, де він становив 30 [7; 36] (p<0,05). Проте вивчення подальшої часової динаміки змін цього показника не виявило значущої різниці між експериментальними групами тварин впродовж всього періоду спостереження, що дає підстави розглядати одноразове застосування електростимуляції кінцівок як фактор, який спричиняє проминальний активуючий вплив у короткий відтинок часу після стресу. Дослідницька активність стресованих щурів, як і показники їхнього грумінгу, впродовж всього двотижневого періоду тестування не відрізнялися від відповідних показників контрольної групи.

Дослідження у Суок-тесті не виявило значущої різниці між контрольними та стресованими щурами у локомоторній та дослідницькій поведінці, а також у грумінговій активності, що підтверджує оцінку поведінкового статусу тварин, визначену за результатами тестувань у відкритому полі.

У радіальному лабіринті також не було виявлено значних відмінностей за показниками поведінки між контрольними та стресованими тваринами. Єдиним виключенням були лише зменшені відносно контролю значення показників латентних періодів взяття першого та останнього підкріплення у ході проходження лабіринту під час другого тестування. Так, у контрольній та стресовій групах перший показник складав відповідно 5 [4; 7] с та 3 [2; 6] с (p<0,05), а другий - 254 [198; 264] с та 148 [119; 215] с (p<0,05). Проте це, на нашу думку, може пояснюватися як ефект незначної активації, а також навчання та використання тваринами попередньо набутого досвіду.

Неуникний вплив електричного струму, без сумніву, є стресовим чинником [M.L. Andersen et al., 2004; Q. Li et al., 2005], проте модель футшок камери, яка застосовувалася нами, передбачала можливість позбавлення тварин від подразнення після його початку. Тобто контрольованість ситуації значною мірою зменшувала вплив гострого емоційно-больового стресу. Крім того, з огляду на концепцію стилів пристосування [Д.А. Жуков, 1997], у залежності від поведенкової стратегії тварин (пасивне очікування або активне уникнення стимулу), інтенсивність стрес-відповіді може варіювати та навіть не проявлятися у випадку успішної адаптації.

Таким чином, гострий емоційно-больовий стрес за умов контрольованості ситуації не призводить до значних змін як локомоторного та дослідницького аспектів вродженого поведінкового репертуару щурів у тестах відкритого поля та піднятої алеї, так і поведінки тварин у радіальному лабіринті.

Дослідження впливу на поведінку радіаційного стресу проводилося з застосуванням тесту відкритого поля до опромінення у дозі 2,5 Гр та на 4 та 26 дні після променевого стресу; хрестоподібного піднятого лабіринту на 6 день після опромінення; радіального лабіринту до променевого стресу та на 5, 28, 40 та 63 дні після нього; човникової та скіннерівської камер до стресу та щотижнево впродовж двох місяців після опромінення.

У відкритому полі вивчення вродженої поведінки щурів на 4 день після стресу не виявило різниці у локомоторній, дослідницькій та грумінговій активності між тваринами контрольної та опроміненої груп, ці показники також не відрізнялися від базового рівня параметрів, досліджених до стресу. За місяць після стресу поведінка щурів різних експериментальних груп також не відрізнялася, проте було знайдено вірогідне підвищення рівня показників як рухової, так і дослідницької діяльності, відносно попередніх тестувань. Не виключено, що це може бути обумовлено активуючим впливом емоційно-больового навантаження, що його викликано щотижневою процедурою тестування тварин у човниковій камері.

Вивчення тривожності тварин у хрестоподібному піднятому лабіринті не виявило різниці між групами контрольних та стресованих щурів. Можливо, нечутливість цієї методики щодо оцінки ефектів стресу (що в цілому збігається з результатами, які отримано у тесті відкритого поля) обумовлено дизайном дослідження, а саме попереднім застосуванням методики човникової камери.

У радіальному лабіринті вивчення поведінкових показників здебільшого не виявило значних відмінностей між контрольними та стресованими тваринами впродовж перших 40 діб після опромінення. Різницю у показниках між щурами різних експериментальних груп було знайдено лише на 63 день після стресу. Так, у контрольній та стресовій групах показник латентного періоду заходу у промінь складав відповідно 7 [5; 9] с та 4 [4; 6] с (p<0,05), а показник часу перебування у променях лабіринту - 212 [157; 223] с та 242 [225; 262] с (p<0,05). Разом з тим, опромінені щури витрачали більше часу на отримання харчового підкріплення в усіх променях - латентний період взяття останнього підкріплення для них був 152 [119; 187] с, тоді як у контролі цей показник становив 105 [90; 147] с (p<0,05). В цілому, уникання більш відкритих «незахищених» ділянок лабіринту тваринами, які зазнали стресу, разом з менш ефективним пошуком їжі може свідчити про певні порушення робочої пам'яті та посилення тривожності тварин. Розвиток цих ефектів через значний час після стресу може бути віддаленим наслідком опромінення або обумовлюватися впливом додаткового емоційно-больового навантаження, викликаного тестуваннями щурів у човниковій камері.

У човниковій камері щотижнево досліджували активне уникання щурів впродовж 2 місяців після опромінення. Радіаційний стрес призводив до порушень набутої умовнорефлекторної поведінки. Так, опромінення зменшувало кількість умовних реакцій у тестуванні: у контролі цей показник становив 24±2% від максимально можливих, а у стресованих тварин 19±2% (р<0,05) (рис. 2). При цьому латентний період реакції уникнення становив у контролі 3,66±0,04 с, тоді як у групі стрес - 3,77±0,02 с (р<0,05). Показник кількості спроб до першої умовної реакції обернено характеризує швидкість навчання, він становив у контролі 16,5±2,7, водночас стресовані тварини починали уникати негативного безумовного подразнення на 24,6±3,0 спробі (р<0,05). Різниці між групами за показником кількості умовних реакцій у серіях не було знайдено. Цікаво відмітити, що незважаючи на чітке погіршення умовнорефлекторної діяльності опромінених тварин, рівень їх активації (який визначався за показниками кількості міжсигнальних реакцій та кількості спроб до першої міжсигнальної реакції) не відрізнявся від рівня контролю. Так, у контрольних щурів було 18,9±1,8 міжсигнальних реакцій у тестуванні, а у стресованих - 18,1±2,7.

У камері Скіннера щотижнево досліджували умовнорефлекторну діяльність у контрольних та стресованих щурів впродовж двох місяців після опромінення. Знайдено, що радіаційний стрес змінював набуту поведінку щурів з позитивним підкріпленням подібно до вищеописаного його впливу на поведінку уникання. Так, опромінення зменшувало оперантну активність у тестуванні від 191,1±15,1 натиснень у контролі до 148,9±8,2 натиснень у стресованих тварин (р<0,05). При цьому показник кількості реалізованих умовних реакцій опромінених тварин закономірно зменшувався та становив у контролі 43,1±3,9, а у групі стрес - 32,9±2,3 (р<0,05) (рис. 2).

Таким чином, гострий радіаційний стрес не впливає на локомоторний та пошуково-дослідницький аспекти вродженого поведінкового репертуару щурів, що їх досліджено у відкритому полі та хрестоподібному піднятому лабіринті. Радіаційний стрес викликає незначні порушення робочої пам'яті разом з посиленням тривожності тварин у радіальному лабіринті та пригнічує інструментальну набуту поведінку щурів з негативним та позитивним підкріпленням у човниковій та скіннерівській камерах, але не впливає на загальну збудливість тварин.

Визначення методологічного підходу для подальших досліджень. Вивчення впливу на поведінку іммобілізаційного, емоційно-больового та радіаційного стресів із залученням широкого арсеналу методик дослідження як вродженого, так і набутого поведінкового репертуару щурів, показало, по-перше, неоднаковий вплив на поведінку різних стресорів та, по-друге, різну чутливість застосованих тестів до виявлення постстресових поведінкових ефектів. З огляду на отримані результати ми вважали доцільним використання моделей іммобілізаційного та радіаційного стресів у подальших дослідженнях. Оскільки наслідки іммобілізаційного стресу чітко проявлялися у відкритому полі, але не у Суок-тесті, нами було вирішено перед застосуванням піднятої алеї провести дослідження у тесті Порсолта. Як відомо, за дії гетерогенних стресорів адаптивна відповідь може підсилюватися [S. Dronjak et al., 2004; R.B. Harris et al., 2004], а, враховуючи те, що умови проведення тесту вимушеного плавання (неможливість уникнення небезпеки, фізичне навантаження) створюють емоційно-негативний стан, ми очікували на збільшення чутливості Суок-тесту. Проте більш перспективним для досліджень АО уявлялося використання променевого стресу: попри те, що вплив радіації на вроджену поведінку був незначним, було визначено чітке постпроменеве пригнічення інструментальної діяльності, що збігається з даними інших дослідників [E.V. Tukalenko et al., 2007].

Дослідження можливості попередження застосуванням адіахрому змін вродженої поведінки щурів після іммобілізаційного стресу проводили із використанням відкритого поля на 1, 3, 5, 7 та 14 дні після стресу, тесту Порсолта на 15 день після іммобілізації та Суок-тесту на 18 день після стресу. У дослідженні порівнювали групи тварин, які зазнавали іммобілізації та отримували або не отримували адіахром впродовж 2 тижнів перед стресом.

За результатими тесту відкритого поля встановлено, що отримання тваринами адіахрому не поліпшувало показники вродженої поведінки щурів, які зазнавали іммобілізаційного стресу, порівняно з лише стресованими тваринами. Водночас можна помітити зниження рівня рухової поведінки у щурів обох експериментальних груп. Так, локомоторна активність щурів, які зазнавали стресу, змінювалася з 1 по 14 день після стресу від 27 [19; 37] до 7 [4; 12] відвіданих квадратів, а у групі «стрес та адіахром» - від 29 [16; 39] до 11 [5; 32] квадратів. Показник дослідницької активності тварин, які зазнавали стресу, змінювався впродовж тестувань від 5 [3; 7] до 1 [0; 1], а у групі «стрес та адіахром» - від 4 [2; 7] до 1 [0; 4] вертикальних стійок. Також не було різниці між експериментальними групами за показниками грумінгу та кількості перетнутих центральних квадратів поля. Можливо, динамічне зниження показників локомоторної та дослідницької поведінки протягом 2 тижнів після стресу є відображенням поступового розвитку стрес-індукованого дефіциту вродженого поведінкового репертуару щурів, який не може бути модифікованим превентивним двотижневим застосуванням адіахрому.

Отримані у тесті Порсолта дані свідчать про відсутність різниці між тваринами обох експериментальних груп. Так, латентний період іммобільності у стресованих щурів становив 63 [53; 128] с, а час іммобільності - 74 [64; 122] с; водночас у тварин, які отримували адіахром до стресу, ці показники складали відповідно 75 [64; 127] с та 118 [82; 147] с. Тобто отримання щурами адіахрому не попереджає постстресові поведінкові ефекти. На користь цього висновку також свідчить відсутність впливу адіахрому на показники поведінки у Суок-тесті.

Таким чином, зміни вродженої поведінки у тестах відкритого поля, Порсолта та піднятої алеї після іммобілізаційного стресу не можуть бути модифіковані застосуванням перед стресом флавоноїду штучного походження адіахрому.

Дослідження можливості модифікації стрес-індукованих змін поведінки щурів застосуванням кверцетину та комбінації альфа-токоферолу та аскорбату проводилося із використанням моделі гострого радіаційного стресу та методик дослідження інструментальної діяльності тварин. Набуту поведінку щурів досліджували впродовж 2 місяців після опромінення.

У човниковій камері радіаційний стрес призводив до зниження рівня показника кількості умовних реакцій активного уникнення на 22% (р<0,05). У неопромінених та опромінених тварин, які одержували кверцетин, рівень цього показника збільшувався відповідно на 31% та 27% (р<0,05). Разом з тим не виявлено вірогідного впливу застосування токоферолу з аскорбатом, тоді як у опромінених щурів, які одержували комбінацію цих речовин, рівень умовнорефлекторної діяльності був на 40% вище ніж у контрольній групі (р<0,05) (рис. 3). Отримані дані також виявили досить значне уповільнення швидкості навчання у стресованих тварин, яке проявлялося у збільшенні кількості спроб до виникнення умовного рефлексу у тестуванні на 49% порівняно з контролем (р<0,05). Серед інших експериментальних груп від контролю вірогідно відрізнялися лише щури, які отримували кверцетин та не зазнавали стресу: у них, за показником кількості спроб до першого уникнення, скорочення етапу вироблення умовної реакції було менше на 39% (р<0,05). Радіаційний стрес вірогідно збільшував латентний період реакції уникнення, тоді як групи тварин, які отримували антиоксидантні засоби, не відрізнялися від контролю за цим показником.

Рівень оперантної активності у камері Скіннера серед усіх експериментальних груп був нижчим також тільки у стресованих щурів, його значення було на 22% нижче ніж у контролі. Водночас показник кількості реалізованих умовних реакцій з позитивним підкріпленням відрізнявся у групах опромінених тварин, де він складав 76% від контролю (р<0,05), та у щурів, які зазнавали стресу та отримували кверцетин, де він перевищував контрольний рівень на 33% (р<0,05).

Таким чином, одержані дані свідчать про пригнічення функціонального стану ЦНС тварин після впливу гострого радіаційного стресу, яке може бути попереджено застосуванням засобів з антиоксидантними властивостями: кверцетином, або комбінацією альфа-токоферолу та аскорбату. Отримані результати наводять на думку про однаковість механізмів дії цих засобів. Оскільки опромінення ініціює інтенсифікацію оксидантних процесів, напевно, подібність ефектів використаних засобів обумовлюється добре відомими антиоксидантними властивостями обох застосованих сполук [J.S. Coombes et al., 2002; В.А. Барабой, 2006]. Водночас позитивний ефект кверцетину на поведінку уникання певною мірою може реалізовуватися внаслідок підвищення збудливості тварин. Так, у неопромінених тварин, які отримували кверцетин, середня кількість міжсигнальних реакцій була на 50% більше, а кількість спроб до першої міжсигнальної реакції на 34% менше ніж у контролі (р<0,05). Слід зазначити, що обидва антиоксидантних засоба проявляли чіткий позитивний вплив на функціональний стан ЦНС стресованих щурів. Однак порівняння результатів вивчення інструментальної поведінки вказувало на дещо більшу ефективність кверцетину. Тому саме він використовувався у подальшому.

Дослідження оптимальної тривалості та схеми введення кверцетину для модифікації стрес-індукованих змін поведінки щурів. Спочатку визначали щоденне дозування та оптимальний термін застосування кверцетину. Відповідно до даних літератури, ми обрали щоденну дозу кверцетину 100 мг/кг та пероральне застосування цього засобу. Проте не було знайдено обґрунтованих рекомендацій щодо тривалості застосування цієї речовини. Виходячи з особливостей фармакокінетики кверцетину (висока біодоступність, швидкий перехід у тканини, короткий період напіввиведення цієї сполуки та її метаболітів) [I. Erlund, 2002; J.P.E. Spencer et al., 2003] та поставленої мети ми порівнювали вплив кверцетину на умовнорефлекторну поведінку тварин у човниковій камері при його щоденному використанні у дозі 100 мг/кг впродовж 14 або 30 діб. Зміни кількості реакцій активного уникнення щурів за чотири періоди тестування (перший період - 1-25 спроба; другий період - 26-50 спроба; третій період - 51-75 спроба; четвертий період - 76-100 спроба) наведено на рис. 4. Латентний період здійснення умовнорефлекторної реакції уникнення зменшувався у порівнянні з контролем лише у щурів, які отримували кверцетин впродовж 14, але не 30 діб, причому у другому періоді тестування це зниження було вірогідним. Аналогічну тенденцію щодо підвищення рівня функціонального стану ЦНС тварин одержано й за показником кількості умовних реакцій у серії. Разом з тим показник кількості спроб до першої міжсигнальної реакції був вірогідно вище у контролі, де він складав 26±8 спроб, ніж у щурів, які отримували кверцетин впродовж 30 діб (4±2 спроби) (р<0,05), але не у тварин, які отримували цей антиоксидантний засіб протягом 14 діб (15±5 спроб). Таким чином, отримані дані свідчать, що застосування кверцетину впродовж двох тижнів справляє помірний позитивний вплив на інструментальну діяльність щурів, а подовження терміну отримання тваринами кверцетину до місяця не поліпшує набуту поведінку, а лише певною мірою підвищує збудливість щурів.

У подальшому проводили в декілька етапів вивчення можливості корекції кверцетином постстресових змін поведінки уникання при його використанні за однакових дози та часу застосування, проте за різних схем застосування відносно впливу стресу. Уявлялося цікавим вивчити не тільки ефекти дії кверцетину на поведінку в умовах стресу опромінення у помірній дозі (2,5 Гр) [L. Lebaron-Jacobs et al., 2004], але й також визначити можливість корекції цим засобом поведінкових змін, що супроводжують специфічні наслідки впливу радіації. Відомо, що опромінення щурів у дозі 6 Гр викликає у тварин розвиток кістковомозкового синдрому гострої променевої хвороби [В. Бонд и др., 1971; В. Бонд, Т. Сугахара, 1974], а стресова компонента є наявною не тільки за неспецифічної відповіді організму на той чи інший чинник, але і за реалізації специфічної патології [Г. Селье, 1982; H. Selye, 1976].

На першому етапі, в якому кверцетин вводився до опромінення, було отримано наступні результати змін набутої поведінки активного уникання. Показник кількості УР складав у групі контролю 18±2%, у тварин, які зазнали променевого впливу у дозах 2,5 та 6 Гр, рівень інструментальної діяльності знижувався відповідно до 14±2% та 13±1% (р<0,05). У щурів, які були опромінені у дозах 2,5 та 6 Гр та отримували кверцетин, кількість УР не відрізнявся від рівня контролю та становила відповідно 17±2% та 15±1% (рис. 5). Швидкість реакції уникнення вірогідно знижувалася у порівнянні з контролем лише у групах опромінених тварин, які не отримували кверцетину. Аналогічні результати отримано і для показника сталості набутого стереотипу поведінки: так, у щурів, які зазнали опромінення у дозі 2,5 Гр, цей показник був на 17%, а за дози 6 Гр - на 18% нижче ніж у контролі (р<0,05).

На другому етапі, в якому кверцетин вводився з другої доби після опромінення, показник кількості УР у човниковій камері складав у групі контролю 18±2%, а у опромінених тварин він був нижчим та складав 12±2% для дози 2,5 Гр та 11±1% для дози 6 Гр (р<0,05). Серед груп опромінених тварин, які отримували кверцетин, від контролю відрізнялася лише група тварин, що зазнали променевого впливу у дозі 6 Гр, у якій кількість УР складала 13±2% (р<0,05) (рис. 6). Тривалість латентного періоду УР порівняно з контролем була вірогідно більшою у тварин, які зазнали впливу радіації, та у опромінених у дозі 6 Гр щурів, які отримували кверцетин. Швидкість навчання зменшувалася порівняно з контролем в усіх групах тварин, які зазнали променевого впливу. Для груп щурів, які були опромінені у дозах 2,5 та 6 Гр, це зниження складало відповідно 59% (р<0,05) та 82% (р<0,05), а за відповідних доз радіації та отримання кверцетину показник кількості спроб до першої УР був вище контрольних значень на 31% (р<0,05) та 84% (р<0,05). Аналогічні результати отримано і для сталості набутого стереотипу поведінки: так, у щурів, які зазнали опромінення у обох дозах, рівень цього показника був на 13% нижче ніж у контролі (р<0,05), водночас використання кверцетину збільшувало показник кількості умовних реакцій в серії у тварин, опромінених у дозі 2,5 Гр, майже до рівня контролю, але не щурів, які були опромінені у дозі 6 Гр, де показник становив 87% від контролю (р<0,05).

На третьому етапі, в якому кверцетин вводився з тридцятої доби після опромінення, рівень інструментальної діяльності усіх опромінених груп тварин був вірогідно нижче контролю, а застосування антиоксидантного засобу не справляло жодного коригуючого впливу (рис. 7). Інші показники поведінки уникання щурів змінювалися аналогічно, тобто пригнічення функціонального стану ЦНС після опромінення не модифікувалося відставленим введенням кверцетину.

Таким чином, вплив іонізуючої радіації у дозах 2,5 та 6 Гр призводить до погіршення функціонального стану ЦНС щурів, що його оцінено за показниками набутої поведінки уникання. Зниження рівня інструментальної діяльності було майже однаковим як за радіаційного стресу, так і за дози опромінення, яке викликає неспецифічні наслідки. Двотижневе застосування кверцетину перед опроміненням у обох дозах попереджує пригнічення умовнорефлекторної поведінки тварин. Застосування кверцетину впродовж двож тижнів починаючи з другої доби після опромінення в цілому зменшує порушення набутої поведінки щурів, але тільки за дози 2,5 Гр. У разі двотижневого отримання тваринами кверцетину з тридцятої доби після опромінення в обох дозах модифікуючого впливу антиоксидантного засобу не виявлено. Отже, оптимальною схемою використання антиоксидантів є їх застосування до впливу стресового чинника, а використання антиоксидантів відразу після його дії є менш ефективним.

Вважається, що постпроменеве пригнічення функціонального стану ЦНС може проявлятися внаслідок ушкоджень ядерної та мітохондріальної ДНК нервових клітин [P.J. Tofilon, J.R. Fike, 2000; H. Korr, 2001], порушень метаболізму у нейронах та змін у синаптичній передачі мембранних потенціалів [Б.И. Давыдов, И.Б. Ушаков, 1987], демієлінізації [А.К. Гуськова, 1989], змін у нейроглії [R.K. Mulhern et al., 2001], радіаційно-індукованого апоптозу [P.J. Tofilon, J.R. Fike, 2000], аутоімунних реакцій [Ю.П. Зозуля та ін., 1998] тощо. Проте, оскільки постпроменеві зрушення ВНД, як це показано у нашому дослідженні, можуть бути модифіковані антиоксидантами, що їх застосовано перед опроміненням, можна дійти висновку, що такий ефект обумовлено глибокими та тривалими змінами, які викликано оксидантним стресом внаслідок опромінення, що узгоджується з думкою [Ю.А. Зозуля и др., 2000; В.А. Барабой, 2006; A. Agrawal, R.K. Kale, 2001] про механізми дії радіації. Це обґрунтовує перспективність подальших досліджень використання антиоксидантів для попередження постстресових поведінкових наслідків, реалізація яких опосередкована розвитком оксидантного стресу.

Висновки

модифікація поведінка стрес антиоксидантний

В роботі встановлено чутливість різних аспектів вродженої та набутої поведінки щурів до впливу різномодальних стресорів за декількох експериментальних моделей та можливість корекції антиоксидантами постстресових зрушень поведінки за розробленого методологічного підходу дослідження.

1. Іммобілізаційний стрес призводить до пригнічення локомоторного та дослідницького аспектів вродженої поведінки щурів у відкритому полі. Проте за умов збільшення аверсивності середовища у Суок-тесті суттєві зміни поведінкового репертуару тварин не виявляються.

2. Емоційно-больовий стрес за умов контрольованості тваринами дії стресора не призводить до значних змін як локомоторної та дослідницької поведінки щурів у тестах відкритого поля та піднятої алеї, так і поведінки тварин у радіальному лабіринті.

3. Радіаційний стрес не впливає на локомоторний та дослідницький аспекти вродженого поведінкового репертуару щурів, що їх оцінено у відкритому полі та піднятому хрестоподібному лабіринті. Водночас опромінення призводить до незначних змін робочої пам'яті тварин та суттєво пригнічує умовнорефлекторну набуту поведінку щурів з позитивним та негативним підкріпленням, але не впливає на загальну активацію тварин.

4. Методологічний підхід, який передбачає застосування радіаційного стресу та оперантних поведінкових методик для оцінки функціонального стану центральної нервової системи впродовж тривалого часу дослідження, може використовуватися як модель вивчення можливості модифікації постстресових поведінкових наслідків засобами з антиоксидантними властивостями.

5. Зміни вродженої поведінки у тестах відкритого поля, Порсолта та піднятої алеї після іммобілізаційного стресу не можуть бути модифіковані застосуванням перед стресом флавоноїду штучного походження адіахрому.

6. Зміни набутої інструментальної поведінки після радіаційного стресу можуть бути попереджені застосуванням засобів з антиоксидантними властивостями: кверцетином або комбінацією альфа-токоферолу та аскорбату.

7. Оптимальною схемою застосування кверцетину для модифікації постстресових поведінкових наслідків є отримання тваринами цього антиоксидантного засобу впродовж двох тижнів до впливу радіаційного стресу.

Список опублікованих робіт за темою дисертації

1. Вплив адіахрому на поведінку щурів після іммобілізаційного стрессу / I. Тубальцева, М. Макарчук, В. Хиля, Н. Горбуленко, В. Лозова, А. Васильєва, О. Коваленко // Вісник КНУ імені Тараса Шевченка: «Проблеми регуляції фізіологічних функцій». - 2006. - №11. - С. 12-13. (Здобувач - аналіз літератури, проведення експериментів, обробка даних, підготовка матеріалу до друку)

2. Кверцетин попереджує зміни умовнорефлекторної інструментальної діяльності щурів після впливу іонізуючої радіації у дозі 2,5 Гр / I. Тубальцева, Є. Тукаленко, М. Макарчук, В. Лозова // Вісник КНУ імені Тараса Шевченка: «Біологія». - 2007. - №49-50. - С. 34-36. (Здобувач - проведення експериментів, обробка даних, підготовка до друку)

3. Поведінка стресованих щурів в суок-тесті за умов вживання адіахрому / I. Тубальцева, М. Макарчук, В. Хиля, Н. Горбуленко // Вісник КНУ імені Тараса Шевченка: «Проблеми регуляції фізіологічних функцій». - 2007. - №12. - С. 26-27. (Здобувач - аналіз літератури, проведення експериментів, обробка даних, підготовка до друку)

4. The effects of Quercetin on behavioral paramertes of stressed rats in the Suok-test. / I. Tubaltseva, V. Lozova, E. Tukalenko, M. Makarchuk // 10-th Jubilee Multidiscipl. Int. Conf. of Biol. Psychiatry «Stress and Behavior», St-Petersburg, Russia, May 16-20, 2007. - P. 57. (Здобувач - ідея, проведення експериментів, обробка даних, підготовка до друку)

5. Вплив кверцетину на щурів після іонізуючого опромінення / І. І. Тубальцева, Є. В. Тукаленко, О.Г. Ракочі, В.В. Варецький, В.М. Лозова, І.Р. Дмітрієва, М.Ю. Макарчук // Матеріали міжн. конф. «Біологія XXI століття: теорія, практика, викладання», Київ-Черкаси-Канів, 1-4 квітня 2007 р. - С. 331-332. (Здобувач - ідея, проведення експериментів, обробка даних, підготовка до друку)

6. Exploratory behaviour of stressed rats in the elevated alley Suok test under the quercetin administration / I. Tubaltseva, V. Lozova, E. Tukalenko, M. Makarchuk // Acta Physiol.: Abstracts for the Joint Meeting of The Slovak Physiological Society and The Fed. of Europ. Physiol. Societies, 11-14 Sept. 2007, Bratislava, Slovakia. - P. 58. (Здобувач - ідея, проведення експериментів, обробка даних, підготовка до друку)

7. Дослідження застосування антиоксидантів для попередження постпроменевих змін інструментальної поведінки щурів / І.І. Тубальцева, В.В. Варецький, О.Г. Ракочі, В.М. Лозова, Є.В. Тукаленко, І.Р. Дмітрієва, М.Ю. Макарчук // Материалы междунар. конф. «Радиопротекторы, эффективные при действии хронического облучения в малых дозах» 16-20 июня 2008 г., Николаев - С. 45-46. (Здобувач - ідея, проведення експериментів, обробка даних, підготовка до друку)

8. Кверцетин и резвератрол уменьшают неблагоприятное воздействие ионизирующего излучения на когнитивную функцию ЦНС / В.В. Варецкий, А.Г. Ракочи, Е.В. Тукаленко, В.В. Талько, И.Р. Дмитриева, И.И. Тубальцева, В.М. Лозовая, Н.П. Доценко // Вестник росс. воен.-мед. академии: Материалы Росс. науч. конф. «Медико-биологические проблемы токсикологи и радиологии», 29-30 мая 2008 г., СПб. - 2008. - №3 (23), прил. 1. - С. 209. (Здобувач - ідея, проведення експериментів, обробка даних)

9. Stress-induced behavior and its possible modulation by antioxidants / V.M. Lozova, I.I. Tubaltseva, E.V. Tukalenko, N.E. Makarchuk // Fourth Int. Congress «Neuroscience for Medicine and Psychology», 10-20 June 2008, Sudak, Ukraine. - P. 183-184. (Здобувач - ідея, проведення експериментів, обробка даних, підготовка до друку)

10. Чи можуть антиоксиданти корегувати обумовлені стресом зміни поведінки? / М.Ю. Макарчук, Є.В. Тукаленко, І.І. Тубальцева, А.О. Пахомова // Матеріали IV Міжн. наук. конф. «Психофізіологічні та вісцеральні функції в нормі та патології», Київ, 8-10 жовтня 2008 року. - С. 126. (Здобувач - проведення експериментів, обробка даних, підготовка до друку)

11. Вплив антиоксидантів на зміни поведінки, обумовлені стресом / М.Ю. Макарчук, І.І. Тубальцева, Є.В. Тукаленко, А.О. Пахомова // Тези доповідей наук.-практич. конф. «Біологічно активні речовини: фундаментальні та прикладні питання отримання та застосування», Новий Світ, 25-30 травня 2009 року. - С. 476. (Здобувач - проведення експериментів, обробка даних, підготовка до друку)

Размещено на Allbest.ru