Биологические наномоторы и методы их исследования

Размещено на http://www.allbest.ru/

Институт иммунологии и физиологии УрО РАН

БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАНОМОТОРЫ И МЕТОДЫ ИХ ИССЛЕДОВАНИЯ

С.Ю. БЕРШИЦКИЙ

С.Р. НАБИЕВ

Биологические моторы, или наномоторы, - это три классов белковых молекул, которые обеспечивают все двигательные функции живых организмов, такие как миграция клеток, клеточное деление, внутриклеточный транспорт, мышечное сокращение и т.д. Наиболее распространёнными моторными белками являются миозины и кинезины. Эти белки расщепляют АТФ, прямо преобразуя химическую энергию гидролиза в механическую работу с эффективностью, достигающей в некоторых типах мышц 50%. Очевидно, что исследование молекулярной структуры и функции таких белков представляется одной из самых интересных и актуальных задач биологии. Что касается структуры, то развитие рентгеновской кристаллографии позволило расшифровать молекулярную организацию целого ряда моторных белков, а также выдвинуть гипотезы о возможных молекулярных механизмах их работы (см., например, 1). Несомненно, что для ясного понимания того, как работают моторные белки и каков механизм преобразования в них энергии, требуются экспериментальные данные об их физических характеристиках в интактном состоянии. В частности, нужно измерить величину `рабочего шага' одиночной молекулы, силу, которую она развивает во время такого шага, прочность связи миозина с актиновой нитью или кинезина с микротрубочкой, а также изменение этих величин во времени и зависимость их от физических условий.

В 90х годах была построена оптическая ловушка, который позволила регистрировать взаимодействия одиночных молекул моторных белков и измерять их физические характеристики. Возможность захватывать микрообъекты с помощью сфокусированного луча света впервые экспериментально продемонстрировал в 1970 году A. Ashkin (2). В 1987 году он же показал применимость `оптического пинцета' к биологическим объектам (3-4). Сила, с которой диэлектрическая частица размером в 10-6-10-7 м удерживается в луче света, зависит от мощности источника света, в значительной степени от численной апертуры фокусирующей оптики, и составляет 10-9-10-7 Н. На практике в качестве источника света в биологических исследованиях используются ИК лазеры с длиной волны ~1 мкм, наименее травматичные для биологических объектов, обычно Ne:YAG 1064 нм мощностью 0.1-1 Вт. Физические принципы захвата и удержания микрочастиц в фокусированном луче света описаны в литературе (5-6).

В лаборатории биологической подвижности Института иммунологии и физиологии УрО РАН построена двулучевая оптическая ловушка с разделением одного луча по двум перпендикулярным поляризациям, проведены калибровочные эксперименты, а также пробные эксперименты с мышечными белками. Блок-схема экспериментальной установки на базе инвертированного флуоресцентного микроскопа AxioObserver фирмы Carl Zeiss показана на рис. 1.

Рис. 1. Луч ИК лазера (Compass 1064-2000N, Coherent, <1,5 Вт) делится полуволновой пластин-кой на два поляризационных компонента.

Положением одного из лучей можно управлять в двух перпендикулярных проекциях с помощью акусто-оптический модулятор (АОМ). Оба луча собираются в фокусе высокоапертурного объек-тива микроскопа, где захватывают и удерживают полистироловые шарики диаметром 1 мкм. Вышедшие лучи собираются высокоапертурным конденсором и фокусируются на квадрантных фотодиодах (ФД) для регистрации их положения в фокальной плоскости. Выходные сигналы ФД могут использоваться в обратной связи управления АОМ.

Для регистрации смещения объекта из положения равновесия используется четырехквадрантный фотодиод (ФД). ФД регистрирует отклонения объекта по изменению положения самого удерживающего ИК-луча. Принцип детектирования показан на рис. 2.

Рис. 2. ФД находится в обратной фокальной плоскостью конденсора. Удерживаемый объект действует как обычная линза.

Рис. 3. Концы нити актина длиной в несколько микрон крепятся к 1 мкм полистироловым шарикам, которые удерживаются двумя лучами ИК лазера вблизи покрытой миозином поверхности проточной камеры с вмонтированными в нее стеклянными или силиконовыми шариками чуть большего диаметра, образующими на поверхности выпуклости.

Смещение объекта из фокуса луча вызовает изменение положения луча, если же объект и луч смещаются вместе, то ФД не регистрирует изменения положения луча. Ответ детектора практически нечувствителен к абсолютному положению детектируемого луча, но чувствителен к относительному смещению удерживаемого объекта и регистрируемого луча.

Для регистрации взаимодействия одиночных молекул миозина с актиновой нитью Finer с соавторами (7) разработали схему типа «гантель» (Рис.3.). Жёсткость оптической ловушки и чувствительностть ФД к смещению калибровали в экспериментальной ячейке глубиной 100 мкм (объем ~ 50 мкл), собранной из предметного и покровного стёкол и заполненной дистиллированной водой. Использовали три метода калибровки: оптический молекула сигнал фотодиод

а) силой Стокса

б) по ответу на шаговое смещение шарика в ловушке

в) по спектральной мощности броуновского шума.

По первому методу 1 мкм полистироловый шарик находится в прозрачной ячейке с жидкостью с известной вязкозтью и удерживается ловушкой. Движение ячейки создаёт вязкую силу, которая смещает шарик из центра ловушки. Зная скорость движения ячейки, вязкость и размер шарика и измеряя выходной сигнал ФД, находим его чувствительность по силе (пН/В; рис. 4.).

Рис. 4. Стоксову силу прикладывали к полистироловому шарику периодическим перемещением экспериментальной ячейки с помощью моторизованной подачи, шарик при этом удерживается ловушкйо. Шум регистрируемого сигнала создаётся броуновскими колебаниями шарика в ловушке.

Предварительно откалибровав смещение моторизованных подач (4,3 мВ/мкм), мы можем вычислить силовую чувствительность ФД. В данном случае силовая чувствительность ФД равна ~ 7,10 пН/В.

Для определения чувствительности ФД к смещению с помощью АОМ сканировали ИК лучом микросферу, приклеенную к поверхности проточной камеры. Ответ ФД представлен на рис. 5 (шаг АОМ ~ 100 нм).

Рис. 5. Полистироловый шарик удерживают в ловушке с помощью подвижного луча, затем приближают объектив к поверхности ячейки так, чтобы удерживаемая микросфера «прилипла» к поверхности ячейки.

Когда это происходит, шум колебаний шарика в ловушке резко падает. Оставаясь на этой высоте поверхность сканируют с заданным шагом (~ 100 и 200 нм) с помощью АОМ в 2 перпендикулярных проекциях. Эта ситуация имитирует отклонения шарика из ловушки, когда на него действует внешняя сила, например, сила, молекулы миозина во время рабочего шага.

Сопоставляя выходной сигнал ФД с величиной шага подвижного луча получаем чувствительность ФД по перемещению (~6,5 мВ/нм). Теперь, зная обе чувствительности ФД, можем вычислить жесткость оптической ловушки (~ 0,046 пН/нм). Жесткость оптической ловушки может быть также определена по ответу шарика на быстрое шаговое смещение луча. (Рис. 6). Значение жесткости ловушки, измеренное таким методом при той же мощности луча, получилось ~ 0,040 пН/нм.

Рис. 6. Возвращение частицы (шарика) в равновесное состояние в вязкой среде под действием упругой силы (ловушки) после ступенчатого изменения положения является примерно экспоненциальным, с показателем экспоненты равным отношению жёсткости ловушки и вязкости раствора, в котором находится объект.

В случае шарика наиболее простым и удобным способ калибровки одновременно и чувствительности, и жесткости ловушки является регистрация спектральной мощности сигнала положения частицы в ловушке. Для этого необходимо знать диаметр шарика, вязкость окружающей его среды и температуру. Спектральную мощность колебаний шарика в ловушке получают преобразованием Фурье решения уравнения движения частицы в ловушке (1) с особой правой частью F(t), которая описывает тепловые возмущения со стороны раствора (функция Ланжевена), где ? - вязкость раствора, а ? - жесткость ловушки.

Спектральная мощность S(f) для положения объекта в ловушке описывается функцией Лоренца с характерной частотой среза fС и уровнем плато, которое определяется первым множителем в формуле (2). Связь частоты среза fС с жесткостью ловушки ? определяется соотношением (3).

Для оценки жесткости оптической ловушки и силовой чувствительности ФД была использована программа, написанная Tolic-Norrelykke с соавторами (8). На рис. 7 показаны запись спектра и его аппроксимация функцией Лоренца.

Рис. 7. Пример записи спектра шума шарика в ловушке (слева) и аппроксимация спектра (справа). Вычисленные в этом эксперименте значения жёсткости ловушки и чувствительность ФД по силе составили 0,055 пН/нм и 10,4 пН/В, соответственно, при мощности луча 0,25 Вт

Видно, что результаты, полученные разными способами калибровки очень близки, а, поскольку, способ калибровки по спектру мощности оказывается наиболее простым, то он и будет использоваться как основной способ калибровки экспериментальной установки.

Кроме калибровок установки сделаны также пробные эксперименты с мышечными белками. Схема эксперимента показана на рис. 3, а на рис. 8 - пример записи по регистрации движения молекулы миозина.

Рис. 8. В отсутствие взаимодействия положение шарика в ловушке определяется броуновскими колебаниями молекул раствора. Присоединение молекулы миозина уменьшает амплитуду колебаний из-за увеличения жёсткости системы.

Анализ `среднее-дисперсия' - наиболее применимый метод математической обработки данных взаимодействия биологических объектов в оптической ловушке. В отсутствие взаимодействия регистрируемый сигнал представляет собой высокоамплитудные броуновские колебания шарика в ловушке с жёсткостью, значительно меньшей жесткости молекулы миозина, таким образом, жёсткость всей системы («гантели») обусловлена жёсткостью ловушки. В момент взаимодействия, то есть, присоединения миозина к актину, шум колебаний шарика значительно падает, поскольку во время взаимодействия жёсткость системы определяется в основном жёсткостью миозина, которая более чем на порядок больше жесткости ловушки. Поскольку уменьшается шум сигнала, то уменьшается и его дисперсия. Таким образом дисперсия служит основным критерием отличия «событий» от «несобытий». На рис.8 приведен пример записи сигнала одной из координат ФД; участки, на которых дисперсия сигнала уменьшена, соотвествуют взаимодействию сократительных белков. В анализе `среднее-дисперсия' усредняют экспериментальный сигнал (рис. 9, слева) и вычисляют дисперсию во времени (рис. 9, справа). На графике `среднее-дисперсия' (рис. 10) по оси ординат отложена дисперсия, а по оси абсцисс - среднее значение положения шарика в ловушке. Удобство такого графика в том, что точки «событий» лежат ниже тех экспериментальных точек, где взаимодействия нет. Координата абсциссы (среднее значение) дает информацию о том, в каком положении находится система во время взаимодействия и при его отсутствии.

Рис. 9. Слева: пример записи движения молекулы миозина по смещению шарика в ловушке, сигнал записан с частотой 5 кГц и усреднён по 40 точкам, концентрация АТФ - 1 мкМ. Справа: дисперсия шума в этом же фрагменте записи.

Вычисляя разницу между значениями в присоединённом и неприсоединенном состояниях, находим величину одиночного шага молекулы миозина (Рис.10).

Рис.10 Анализ «среднее-дисперсия» для исследования взаимодействия одиночных молекул мышечных белков актина и миозина.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Holmes K.C. (1997). The swinging lever-arm hypothesis of muscle contraction. Curr. Biol. 7:R112-R118.

2. Ashkin A. (1970). Phys. Rev. Lett. 24:156-159.

3. Ashkin A., Dziedzic J.M. (1987). Science 235:1517-1520.

4. Ashkin A., Dziedzic J.M., Yamane T. (1987). Nature 330:769-771.

5. Ashkin A. (1997). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4853-4860

6. Neuman K.C., Block S.M. (2004). Rev. Sci. Instrum. 75:2787-2809.

7. Finer J.T., Simmons R.M., Spudich J.A. (1994). Nature 368:113-118.

8. Toliг-Nёrrelykke I.-M., Berg-Sёrensen K., Flyvbjerg H. (2004). Computer Phys. Communications 159:225-240.

Размещено на Allbest.ru