Станции для исследования биологических наноструктур методами SAXS/WAXS дифракции с использованием синхротронного излучения накопителей "Сибирь-2" (Москва) И ВЭПП-3 (Новосибирск)

5

Размещено на http://www.allbest.ru/

Станции для исследования биологических наноструктур методами SAXS/WAXS дифракции с использованием синхротронного излучения накопителей «Сибирь-2» (Москва) И ВЭПП-3 (Новосибирск)

В.Н. Корнеев

Успехи современной молекулярной биологии позволили понять многие механизмы функционирования живых систем на молекулярном уровне. Однако целый ряд функций организма реализуется на более высоком надмолекулярном и даже надклеточном, тканевом и органном уровнях. С появлением специализированных источников СИ появились экспериментальные возможности прижизненного изучения структурных основ функционирования биологических систем, обеспечивающих многочисленные функции, такие как подвижность, сократимость, динамика цитоскелета, мембранный транспорт, проведение возбуждения, деление клеток, клеточная дифференциация, трансформация при старении и патологических процессах. Каждая из перечисленных функций обеспечивается уникальными клеточными и тканевыми структурами, однако все структурное многообразие объединяет одна общая черта: они представляют собой ансамбли макромолекул биополимеров, для которых характерна высокая упорядоченность с периодами структуры в нанометровом диапазоне порядка 1-100 нм. Такие структуры обуславливают наличие малоуглового диффузного рассеяния и/или рентгеновской дифракции фибриллярного типа с явно выраженным текстурированием в различных направлениях дифракции.

На протяжении более тридцати пяти лет Пущинские институты (ИТЭБ РАН и ИБК РАН) работают с СИ, применяя его в области биологии и медицины, в сотрудничестве с некоторыми институтами Сибирского отделения РАН (Будкеровским институтом ядерной физики, Институтом неорганической химии, Институтом катализа, Институтом химии твердого тела и механохимии) и ФГУ РНЦ “Курчатовский Институт” [1-5].

Рис.1 Малоугловые станции на ВЭПП-3, Сибирь-2 и схема расположения рентгенооптических элементов (описание в тексте)

Для исследования биологических наноструктур методами рентгеновского рассеяния были созданы малоугловые станции «ФРАКС» и «ДИКСИ» на рабочих каналах накопителей ВЭПП-3 и СИБИРЬ-2 двух центров коллективного пользования - Сибирского (СЦСИ, Новосибирск) и Курчатовского (КЦСИ, Москва) центров СИ [2-4, 6].

На рис.1а), б) представлены фотографии станций ФРАКС на 5б канале ВЭПП-3 (а) и ДИКСИ на канале К1.3а Сибирь-2 (б). Базовый вариант станций обеспечивает: диапазон энергий 512,5 Кэв; ширину спектрального интервала /=10-310-4; регистрацию периодов 1,0100 нм [2, 4, 6].

При создании и модернизации экспериментальной аппаратуры мы использовали результаты наших предыдущих разработок, в которых учитывались особенности источников СИ и рабочих каналов накопителей [4, 7-9]. Основные требования к создаваемым системам: модульный принцип построения экспериментального оборудования на основе функционально законченных блоков; уменьшение радиационной нагрузки на рентгенооптические элементы; обеспечение монохроматизации пучка СИ в требуемом спектральном диапазоне и его фокусировка рентгенооптическими трансфокаторами в двух взаимно-перпендикулярных плоскостях (орбиты накопителей и меридиональном направлении); вакуумирование трассы прохождения рентгеновского пучка для уменьшения паразитного рассеяния на воздухе; возможность дистанционного управления элементами рентгенооптических систем; использование разных типов систем регистрации дифракционных картин.

На рис.1в) представлена обобщенная схема конфигурации элементов фокусирующей системы монохроматизации (на основе кристалла и зеркала) и различных типов систем детектирования. Полихроматический пучок, выходящий из накопительного кольца (е), фокусируется кристалл-монохроматором (1) в горизонтальной плоскости. Фокусировка в вертикальной плоскости осуществляется полисекционной системой зеркал полного внешнего отражения (2) [4]. Монохроматический пучок попадает на образец (3), дифракционная картина от которого может быть зарегистрирована в фокальной плоскости любым типом детектора: однокоординатным (4а), двухкоординатными - на основе люминофора и CCD матрицы (4б) или запоминающей пластины (4с). Изображение на флуоресцирующем экране (5) фокусируется мегапиксельным объективом (6) на охлаждаемую матрицу (7). Перед детектором размещается ловушка первичного рентгеновского пучка (8), толщина которой подбирается эмпирически [10]. Для юстировочных работ разработан и создан набор четырехстворчатых танталовых щелей с независимо управляемыми шторками [11]. Для устранения паразитного рассеяния на воздухе установлены вакуумируемые телескопические камеры между образцом и детектором, а также между полисекционной системой зеркал и фоновой щелью. рентгеновский детектор мышца синхротронный

В экспериментальных установках использована оригинальная последовательность фокусирующих рентгенооптических трансфокаторов кристалл - зеркало [12]. В разных рентгенооптических схемах фокусирующая поверхность кристалл-монохроматора формируется по форме кругового или логарифмического цилиндра. Рентгенооптический трансфокатор на основе зеркала полного внешнего отражения расположен в вакуумируемом модуле. Фокусировка рентгеновского пучка осуществляется зеркалами (кварц или кварц, покрытый Ni, Pt или Au), изгибаемыми по круговому цилиндру. Зеркала устанавливаются на критические углы скольжения, что обеспечивает подавление высших гармоник излучения, отраженного от монохроматора [4, 6].

Для создания светосильной полисекционной оптической системы, во-первых, необходимо, настроить углы скольжения зеркал (сделанных из разных материалов) в первом ф1 и последующих фn модулях в соответствии с граничными условиями. Во-вторых, необходимо создать оптимальную протяженность зеркальной поверхности исходя из угла поля зрения системы (угол захвата пучка СИ). В работе [2] мы вычислили данные параметры следующими выражениями:

(1)

где: ; - угловая величина рентгеновского потока над зеркалами, который ими не перехватывается; U1 и V1- расстояния между передним торцом первого зеркала и источником СИ или детектором, соответственно; , Lф - длина зеркала и расстояние между передними торцами смежных зеркал.

Мы были пионерами в разработке метода дифрактометрии с высоким временным разрешением (методика дифракционного кино), позволяющего регистрировать короткоживущие структурные состояния с миллисекундным временем жизни на основе использования высокочувствительных быстродействующих однокоординатных детекторов, разработанных в ИЯФ СО РАН [1].

Рис.2 Комплекс приборов для исследования мышцы и система управления экспериментом (описание в тексте)

Для регистрации текстурированных рентгенограмм биологических объектов используем системы на основе запоминающих экранов Image Plate (IP), а также были созданы несколько версий двухкоординатных детектирующих систем на основе высокоэффективных флуоресцирующих экранов и цифровых камер с охлаждаемыми ССД матрицами и мегапиксельными объективами [6, 9].

Для исследования мышцы в различных режимах сокращения методом дифракционного кино разработано многофункциональное устройство, являющееся комплексом различных приборов, обеспечивающих жизнедеятельность образца в условиях, близких к физиологическим [2]. В последних экспериментах использовался быстродействующий детектор ОД-3 (скорость счета 10Мгц) с разработанной системой управления исполнительными устройствами и регистрацией рентгеновских и механических характеристик различных объектов (СУР). На рис.2а), б), в) представлены фотографии узлов образца и их обобщенная схема. Один прибор предназначен для меридионального изучения мышцы (б), другой - для исследования объекта в экваториальной (сагиттальной) плоскости (а). Блок-схема СУР и временная диаграмма эксперимента представлены на рисунках 2г), д), соответственно.

Узел образца снабжен контрольно-измерительными датчиками, отслеживающими физическое, химическое и физиологическое состояние объекта; предусмотрена возможность изменения ориентации образца относительно рентгеновского пучка. Принципы технических решений при конструировании узла образца диктовались несколькими жесткими требованиями. Первое: геометрические параметры - размещение образца на рентгеновском пучке в ограниченном пространстве, асимметричном относительно канала СИ. Второе: обеспечение оптимальных условий для поддержания нативного состояния исследуемого объекта, а именно, погружение его в буферный раствор определенного состава и температуры. Последнее требование находится в полном противоречии с требованиями рентгеновской дифрактометрии - необходимостью уменьшения потерь на поглощение рентгеновского излучения раствором и окнами кюветы. Чтобы избежать поглощения рентгеновского излучения, на время экспозиции раствор перекачивается из рабочей камеры в буферную с помощью диафрагменного насоса.

Система СУР позволяет с миллисекундным временным разрешением регистрировать физиологические параметры мышцы при сокращении: развиваемая сила, изменение длины саркомера и мышцы, а также изменения интенсивностей дифракционных рефлексов, обусловленных молекулярной структурой мышцы [13, 14]. В эксперименте регистрируется серия дифракционных картин (кадров) состояний структуры, соответствующих последовательным стадиям процесса мышечного сокращения. Время измерения разделяется на определенное число временных интервалов (длительности кадров), в каждом из которых производится одно измерение. Временной интервал от начала одного измерения к началу следующего называют «циклом хранения данных». Минимальная длительность кадра составляет 1мкс [6]. На временной диаграмме эксперимента приведено управление шестью элементами: насосом для перекачки раствора Рингера из кюветы с мышцей (1); заслонкой рентгеновского пучка (2); датчиком силы (3); запуском ОД-3 (4); устройствами положительной (5) и отрицательной (6) электростимуляции мышцы.

На рис.3 и 4 приведены экспериментальные результаты, которые характеризуют возможности аппаратного обеспечения на каналах СИ рентгендифракционных исследований различных биологических объектов и других образцов при использовании различных систем регистрации.

Рис.3 Дифрактограммы различных объектов, полученные с детекторами ОД-3-1500 и ОД-3-350 (описание в тексте)

На рис. 3а), б) представлены дифрактограммы, полученные с детектором ОД-3-1500 на СИ ВЭПП-3 (а) и «Сибирь-2» (б). Для демонстрации метода дифракционного кино на рис. 3а) представлена кинетика интенсивности экваториальных рефлексов в динамическом процессе изменения структуры мышцы. Приведен набор рентгенограмм из одного цикла изометрического сокращения (12 кадров по 10 мс). В третьем кадре на мышцу воздействовали стимулом 3мс. Затем регистрируются интенсивности рефлексов (11) и (10). Наблюдается увеличение и уменьшение интенсивностей, соответственно. К двенадцатому кадру мышца возвращается к исходному состоянию. На рис. 3б) приведена дифрактограмма коллагена (экспозиция 60с), на которой наблюдаются более 14 порядков отражений в диапазоне ~ 50 Еч650 Е.

На рис. 3с), д) представлены дифрактограммы миристата серебра AgC14 и бегената серебра AgC22, соответственно. Результаты получены с детектором ОД-3-350 в условиях канала 5б ВЭПП-3. В этом случае энергия и расстояние образец - детектор были ~8,1 кэВ и 350 мм. Изображения получены с высоким разрешением: на дифрактограмме AgC14 с основным периодом решетки d001 = 39,5Е наблюдаются хорошо различимые дифракционные пики от более 20 порядков, и на рис. 4д) демонстрируется изображение только с пятью пиками от основного периода d001 = 58.4Е. Таким образом, с данной схемой возможно наблюдать периоды структуры в диапазоне 2?= 1,50 ч 29,20.

На рис.4 представлены дифрактограммы бегената серебра AgC22, полученными с детекторными системами на основе запоминающего экрана IP (Fujifilm BAS 5000) (а) и регистратора с флуоресцирующим экраном (Gd2O2S:Tb), мегапиксельным объективом (Computar, M1614) и охлаждаемой матрицей (Sony 249) (б). На картине (а) при режиме съемки: I=46мА, экспозиция 50с, расстояние образец-детектор 271 мм,- зарегистрированы многочисленные рефлексы с периодами в интервале от 59,9 Е до 4,3 Е. На картине (б) наблюдаются 4 порядка основного рефлекса при режиме: охлаждение -200С, бининг 2х2, усиление 200; I=54 мА; экспозиция 60с; расстояние образец-детектор 515 мм; л=1,6Е.

Заключение

Для изучения структурной динамики мышц разработан метод малоугловой рентгеновской дифракции с высоким временным разрешением, основанный на использовании синхротронного излучения, светосильной фокусирующей оптики и быстродействующих детекторов (однокоординатных). При исследованиях биологических тканей, в которых не имеется строгой структурной упорядоченности высокомолекулярных биополимеров, рентгендифракционный метод всегда оказывается наиболее плодотворным. Но для такого типа исследований необходимо использовать двухкоординатные детектирующие системы. Такая техника дает возможность истолковать полученные результаты и изучить их зависимость от многих независимых физико-химических переменных. Сравнительный анализ результатов испытания нашей оригинальной детектирующей системы с рентгенфлуоресцирующими экранами и японской системы на основе IP показал, что IP имеет лучшее пространственное разрешение и более высокую чувствительность. Однако лимитирующим фактором при использовании IP для малого времени экспозиции является время считывания информации и подготовки пластины к следующей регистрации, которое составляет около 20 минут. Преимущество нашей системы обусловлено прямым вводом в компьютер оптических изображений, получаемых на рентгенфлуоресцентных экранах за счет использования охлаждаемых CCD - матриц.

Литература

1. Вазина А.А., Герасимов В.С., Железная Л.А. и др. // Аппаратура и методы рентгеновского анализа. 1975. Вып.19, с. 73-81.

2. Korneev V.N., Sergienko P.M., Matyushin A.M. et al. // Nucl. Instr. & Meth. 2005. A 543, pp. 368-374.

3. Vazina A.A. // “Brilliant Light in Life and Material Sciences”. NATO Security through Science - B: Physics and Biophysics. 2007, pp. 121-131.

4. Korneev V.N., Shlektarev V.A., Zabelin A.V. et al. // Nucl. Instr. & Meth. 2007. A 575, pp. 134-139.

5. Vazina A.A., Lanina N.F., A.A. Vasilieva A.A. et al. // Nucl. Instr. & Meth. 2009. A 603 , pp. 90-94.

6. Korneev V.N., Shlektarev V.A., Zabelin A.V. // Glass Physics and Chemistry. 2008. V. 34, no. 4, pp. 501-508.

7. Korneev V.N., Ariskin N.I., Aulchenko V.M. et al. // J. of Surface Investigation. 2004. No. 10, pp. 24-27.

8. Korneev V.N., Sergienko P.M. et al. // J. of Surface Investigation. 2007. V. 1, no. 1, pp. 99-104.

9. Korneev V.N., Shlektarev V.A. et al. // Bul. of the RAS: Physics. 2008. V. 72, no. 2, pp. 197-200.

10. Корнеев В.Н., Герасимов В.С. А.с.№1245969 (СССР). Б.И. 1986. № 27, 5с.

11. Корнеев В.Н., Шамаров А.М., Герасимов В.С. и др. А.с.№1521134 (СССР). Б.И 1989. №41, 7с.

12. Савельев В.Б., Вазина А.А., Сергиенко П.М. и др. // ПТЭ. 1981. № 4, c. 213-216.

13. Vazina A.A., Gadzhiev A.M. et al. // Rev.Sci.Instrum. 1989. V.60, no.7, part II, pp. 2350-2353.

14. Aul'chenko V.M., Bukin M.A., Vazina A.A. et al. // Nucl. Instr. & Meth. 2005. A 543, pp. 143-147.

Размещено на Allbest.ru