Физико-химические методы анализа

Размещено на http://www.allbest.ru/

Министерство образования и науки Российской Федерации

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования

ИРКУТСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

Заочно-вечерний факультет

Кафедра обогащения полезных ископаемых.

Реферат

«Физико-химические методы анализа»

Выполнил: Карпов Александр

Проверил: Богданов А.В.

Иркутск, 2015 г.

Физико-химические методы исследований

На протяжении всей истории развития биологии физические и химические методы были важнейшим инструментом исследования биологических явлений и процессов живой природы. Важность внедрения таких методов в биологию подтверждают экспериментальные результаты, полученные с помощью современных методов исследования, зародившихся в. смежных отраслях естествознания - физике и химии. В этой связи неслучайно в 1970-х годах в отечественном научном лексиконе появился новый термин "физико-химическая биология". Появление этого термина свидетельствует не только о синтезе физических, химических и биологических знаний, но и о качественно новом уровне развития естествознания, в котором происходит непременно взаимное обеспечение отдельных его отраслей. Физико-химическая биология содействует сближению биологии с точными науками - физикой и химией, а также становлению естествознания как единой науки о природе.

В то же время изучение структуры, функций и репродукции фундаментальных молекулярных структур живой материи не лишает биологию ее индивидуальности и особого положения в естествознании, так как молекулярные структуры наделены биологическими функциями и обладают вполне определенной спецификой.

Внедрение физических и химических методов способствовало развитию экспериментальной биологии, у истоков которой стояли крупные ученые: К. Бернар (1813- 1878), Г. Гельмгольц (1821- 1894), Л. Пастер (1822- 1895), И.М. Сеченов (1829- 1905), И.П. Павлов (1849-1936), С.Н. Виноградский (1856- 1953), К.А. Тимирязев (1843- 1920), И.И. Мечников (1845- 1916) и многие другие.

Экспериментальная биология постигает сущность процессов жизнедеятельности преимущественно с применением точных физических и химических методов, при этом иногда прибегая к расчленению биологической целостности, т. е. живого организма с целью проникновения в тайны его функционирования.

Физико-химические методы анализа -- это большая группа методов, в которую часто включают все приемы химических исследований, базирующиеся на количественном измерении физических свойств. Предварительно изученная зависимость состав --свойства позволяет посредством простых физических измерений анализировать любую систему. Если в химическом анализе для определения количественного состава измеряют количество вещества, вступающего в реакцию, или весовое (объемное) количество продуктов реакции, то в физико-химическом анализе непосредственного измерения объема или веса не производят, а количественно определяю/ какое-либо физическое свойство вещества или системы. Поэтому первым этапом разработки и применения любого физико-химического метода является установление зависимости между составом и свойствами, выражаемой математически в виде формулы или графика.

Зависимости, используемые в физико-химических методах анализа, опираются на общие законы физики и химии; специфичность свойств веществ, характер реакций и особенности изучаемых систем находят отражение в величинах параметров уравнений. Это придает физико-химическим методам универсальность, позволяющую применять одни и те же приборы для исследования разнообразных соединений. В связи с этим классификация методов и последовательность их изучения основывается на общности используемых законов (свойств) и применяемой аппаратуры.

Другая особенность физико-химического анализа связана с тем, что свойства вещества или системы не зависят от взятого объема вещества. Любые свойства: окраска, интенсивность излучения, показатель преломления, величина потенциала-- определяются только концентрацией, а не абсолютным количеством изучаемого компонента. Это позволяет значительно повысить чувствительность методов количественного определения и вносит некоторые особенности в технику работы по сравнению с обычными химическими методами. Ряд физико-химических методов позволяет определять такие свойства вещества, или компонента в смеси, которые нельзя изучить обычными приемами: окислительно-восстановительный потенциал, активности ионов, светопоглощение и отражательная способность почвы и т. п. Разнообразие физико-химических методов столь велико, что сейчас уже трудно установить границы, в пределах которых тот или иной метод следует считать физико-химическим.

Современная экспериментальная биология вооружилась новейшими методами, позволяющими проникнуть в субмикроскопический, молекулярный и надмолекулярный мир живой природы. Можно назвать несколько широко применяемых методов: метод изотопных индикаторов, методы рентгеноструктурного анализа и электронной микроскопии, методы фракционирования, методы прижизненного анализа и др. Дадим их краткую характеристику.

Метод изотопных индикаторов

Изотопные индикаторы, вещества, имеющие отличный от природного изотопный состав и благодаря этому используемые в качестве метки при изучении самых разнообразных процессов. Роль изотопной метки выполняют стабильные или радиоактивные изотопы химических элементов, которые легко могут быть обнаружены и определены количественно. Высокая чувствительность и специфичность И. и. позволяют проследить за ними в сложных процессах перемещения, распределения и превращения веществ в сколь угодно сложных системах, в том числе и в живых организмах.

Метод И. и. (называется также методом меченых атомов) был впервые предложен Д. Хевеши и Ф. Панетом в 1913. Широкое использование И. и. стало возможным благодаря развитию ядерной техники, позволившей получать изотопы в массовом масштабе. Метод И. и. основан на том, что химические свойства разных изотопов одного элемента почти одинаковы (благодаря чему поведение меченых атомов в изучаемых процессах практически не отличается от поведения других атомов того же элемента), и на лёгкости обнаружения изотопов, особенно радиоактивных. При использовании метода необходим учёт возможных реакций изотопного обмена, приводящих к перераспределению меченых атомов (следовательно, к потере соединением метки), а иногда и учёт радиационных эффектов, связанных с влиянием радиоактивных излучений на ход процесса. Изотоп, используемый в качестве метки, вводится в состав изучаемых соединений. Могут быть использованы как стабильные, так и радиоактивные изотопы.

Преимущество стабильных изотопов -- их устойчивость и отсутствие ядерных излучений. Однако только небольшое число элементов имеет подходящие стабильные изотопы. Малая доступность последних и сравнительно сложная техника обнаружения составляют недостатки метода И. и. с применением стабильных изотопов. Преимущество радиоактивных изотопов -- возможность их получения практически для всех элементов периодической системы, высокая чувствительность, специфичность и точность определения, простота и доступность измерительной аппаратуры. Поэтому большинство исследований, использующих метод И. и., выполнено с радиоактивными изотопами.

Такие элементы, как водород, углерод, сера, хлор, свинец, имеют удобные для использования как стабильные -- ²H, ¹³C, ³⁴S, ³⁵Cl, ³⁷Cl, ²⁰⁴РЬ, так и радиоактивные изотопы -- ³H, ¹¹C, ¹⁴C, ³⁵S, ³⁶C1,²¹²РЬ. В качестве изотопов азота и кислорода чаще всего применяются стабильные ¹⁵N и ¹⁸O и другие. Стабильные И. и. получают обогащением природных изотопных смесей путём многократного повторения операции разделения (перегонка, диффузия, термодиффузия, изотопный обмен, электролиз; см. Изотопов разделение), а также на масс-спектрометрических установках и при ядерных реакциях.

Для элементов, существующих в природе в виде одного изотопа (Be, F, Na, Al, P, I), в качестве меченых атомов используют только искусственные радиоактивные изотопы; примером часто применяемых радиоактивных изотопов служат ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S, ⁴⁵Ca, ⁵¹Cr, ⁵⁹Fe, ⁶⁰Co, ⁸⁹Sr,⁹⁵Nb, ¹¹⁰Ag, ¹³¹I и др. Выбор радиоактивного изотопа определяется его ядерными характеристиками -- периодом полураспада, типом и энергией излучения. Для индикации пригодны радиоактивные изотопы, период полураспада которых не очень мал, что позволяет работать в течение времени, необходимого для эксперимента, но и не очень велик, что даёт возможность работать с весьма малыми количествами индикатора.

Основным методом анализа стабильных изотопов служит масс-спектрометрия (чувствительность 10^-4% изотопа при точности 0,1--1% для проб массой в доли мг). Всё большее применение находят спектральные методы и парамагнитный резонанс. Дейтерий, ¹⁸O и некоторые другие изотопы определяют по изменению показателя преломления, теплопроводности, плотности как самого элементарного вещества, так и его соединений. Радиоактивные изотопы определяют по их излучению при помощи счётчиков Гейгера или сцинтилляционных счётчиков. Так, с помощью счетчика Гейгера можно уловить излучение 10^-11г углерода ¹⁴C, 10^-16г фосфора ³²Р и иода ¹³¹I, 10^-19г углерода ¹¹C и т. д. Современные жидкостные сцинтилляционные счётчики позволяют с высокой эффективностью и точностью проводить определение изотопов с мягким бета-излучением (³H, ¹⁴C, ³⁵S и др.). Введение в практику этого метода изотопного анализа повышает его производительность и позволяет работать с незначительными активностями, приближающимися к активности космического фона. Широкое применение в биологии получил метод авторадиографии. При работе с радиоактивными изотопами необходимо соблюдать правила техники безопасности в соответствии с существующими нормами.

Известны различные способы синтеза меченых соединений. Наряду с обычным химическим синтезом используются реакции изотопного обмена и биологический синтез. В большинстве случаев изотопная метка занимает определённое положение в молекуле; например, пропионовую кислоту можно пометить по углероду тремя способами: ¹⁴CH₃CH₂COOH, СН₃¹⁴СН₂СООН, СН₃СН₂¹⁴СООН.

Имеются три основных направления использования И. и. Методом И. и. изучают характер распределения веществ и пути их перемещения. И. и. вводят в ту или иную систему и через определённые промежутки времени устанавливают наличие И. и. в различных частях системы. Наиболее наглядные картины распределения получаются без разрушения образца при помощи радиоавтограмм (см. Авторадиография).

Другое направление использования И. и. -- количественный анализ. Один из самых простых и распространённых вариантов метода И. и. -- метод изотопного разбавления, при котором к анализируемому веществу добавляют дозированное количество И. и. и по степени его разбавления судят об исходном количестве вещества. Этот метод позволяет производить определение ничтожно малых количеств трудноопределяемых веществ и, наоборот, больших масс веществ; анализировать сложные смеси, анализ и разделение которых другими методами невозможны. Широкими возможностями отличается примыкающий к методу И. и. активационный анализ, где меткой служит изотоп другого элемента, образованный из данного в результате ядерной реакции. Особенно большое значение этот метод имеет при определении микроэлементов в металлах, сплавах, минералах, тканях, при быстром контроле технологических процессов. Количественный анализ природных изотопов, входящих в естественные радиоактивные ряды урана и тория, а также количественное определение изотопа ¹⁴C в умерших организмах позволяют определять возраст горных пород и археологических находок.

Третьим направлением использования И. и. является выяснение механизма различных процессов и изучение строения химических соединений. Введение изотопной метки в определённое положение молекулы устраняет химическую неразличимость атомов, допуская возможность однозначного выяснения механизма тех или иных реакций, для которых обычные химические методы описывают только начальное и конечное состояния.

Все указанные направления применения И. и. широко представлены в различных областях химии, биологии, медицины, техники, сельского хозяйства и т. д. Ниже приводятся отдельные примеры их использования.

В биологии И. и. применяют для решения как фундаментальных, так и прикладных биологических проблем, изучение которых другими методами затруднено или невозможно. Существенное для биологии преимущество метода меченых атомов состоит в том, что использование И. и. не нарушает целостности организма и его основных жизненных отправлений. С применением И. и. связаны многие крупные достижения современной биологии, определившие расцвет биологических наук во 2-й половине 20 в. С помощью стабильных и радиоактивных изотопов водорода (²H и ³H), углерода (¹³C и ¹⁴C), азота (¹⁵N), кислорода (¹⁸O), фосфора (³²P), серы (³⁵S), железа (⁵⁹Fe), йода (¹³¹I) и др. были выяснены и детально изучены сложные и взаимосвязанные процессы биосинтеза и распада белков, нуклеиновых кислот, углеводов, жиров и др. биологически активных соединений, а также химические механизмы их превращений в живой клетке Применение И. и. привело к пересмотру прежних представлений о природе фотосинтеза, а также о механизмах, обеспечивающих усвоение растениями неорганических веществ -- карбонатов, нитратов, фосфатов и др.

С помощью И. и. выполнено огромное число исследований в самых разнообразных направлениях биологии и биохимии. Одно из направлений включает работы по изучению динамики и путей перемещения популяций в биосфере и отдельных особей внутри данной популяции, миграции микробов, а также отдельных соединений внутри организма. Вводя в организмы с пищей или путём инъекций метку, удалось изучить скорость и пути миграции многих насекомых (москитов, мух, саранчи), птиц, грызунов и др. мелких животных и получить данные о численности их популяций. В области физиологии и биохимии растений с помощью И. и. решен ряд теоретических и прикладных проблем: выяснены пути поступления минеральных веществ, жидкостей и газов в растения, а также роль различных химических элементов, в том числе микроэлементов, в жизни растений Показано, в частности, что углерод поступает в растения не только через листья, но и через корневую систему, установлены пути и скорости передвижения ряда веществ из корневой системы в стебель и листья и из этих органов к корням. В области физиологии и биохимии животных и человека изучены скорости поступления различных веществ в их ткани (в том числе скорость включения железа в гемоглобин, фосфора -- в нервную и мышечные ткани, кальция -- в кости).

Важная группа работ охватывает исследования механизмов химических реакций в организме. Так, во многих случаях удалось установить связь между исходными и вновь образующимися молекулами, проследить за "судьбой" отдельных атомов и химических групп в процессах обмена веществ, а также выяснить последовательность и скорость этих превращений. Полученные данные сыграли решающую роль при построении современных схем биосинтеза и метаболизма (метаболических карт), путей превращения пищи, лекарственных препаратов и ядов в живых организмах. К работам этой группы относится выяснение вопроса о происхождении кислорода, выделяемого в процессе фотосинтеза: оказалось, что его источником является вода, а не двуокись углерода. С другой стороны, применение ¹⁴CO₂ позволило выяснить пути превращений двуокиси углерода в процессе фотосинтеза. Использование "меченой" пищи привело к новому представлению о скоростях всасывания и распространения пищевых веществ, об их "судьбе" в организме и помогло проследить за влиянием внутренних и внешних факторов (голодание, асфиксия, переутомление и т. д.) на обмен веществ. Метод И. и. позволил изучить процессы обратимого транспорта веществ через биологические мембраны. Было показано, что концентрации веществ по обе стороны мембраны остаются постоянными с сохранением градиентов концентрации, характерных для каждой из разделённых мембранами сред.

Рентгеноструктурный анализ

Главной задачей рентгеноструктурного анализа является определение кристаллической структуры, а именно: определении симметрии, параметров элементарных ячеек, координат атомов, тепловых параметров атомов, длин связей и углов между атомами, структурного мотива (или иначе топологии структуры). В процессе расшифровки структуры возможно уточнение таких кристаллохимических особенностей как упорядочение/разупорядочение катионов (анионов), степень заселенности позиций, анализ сверхструктур соединений.

Результаты расшифровки структуры кристаллического соединения могут служить основой для более широких выводов. Так, например, определение симметрии кристаллических веществ является важным для суждений об условиях их образования, так как для одного и того же по химическому составу соединения может быть известно несколько полиморфных модификаций, коррелирующих с условиями их генезиса. Определение неразрушающим методом фазы кристаллического объекта, то есть диагностика вещества по значению параметров элементарной ячейки, может быть полезным, скажем, для ювелирной индустрии.

С помощью монокристальных дифрактометров возможно получать не только «классические» структурные данные, но также данные в формате порошковой рентгенографии. Речь идет о тех случаях, когда нет достаточного количества вещества для порошковой рентгеновской дифракции. Этот метод может быть использован для диагностики фаз (по нескольким зернам), а также, например, для получения рентгенограммы (дебаеграммы) необходимой для описания нового минерала. Важной опцией реализуемой с помощью программного обеспечения монокристальных дифрактометров, является возможность построения сечений обратного (дифракционного) пространства, что особенно актуально для соединений со сверхструктурами или минералов, проявляющих способность к ионному обмену (рисунок 1).

Рисунок 1. Реконструкция обратного пространства в структуре минерала квинтинит (Mg₄Al₂(OH)₁₂CO₃*3H₂O)

Электронно-микроскопический метод исследования

Электронно-микроскопический метод исследования получил широкое распространение в различных областях науки и техники. Электронный микроскоп благодаря высокой разрешающей способности (более чем на два порядка выше по сравнению со световым микроскопом) позволяет наблюдать тонкие особенности и детали структуры микрообъектов на атомно-молекулярном уровне. Эти приборы по своему назначению разделяются на просвечивающие (ПЭМ) и растровые (РЭМ) электронные микроскопы. Первые позволяют изучать образцы в проходящих, а вторые - во вторичных или рассеянных объектом электронах.

Применение просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) в минералогии началось со времени получения теневых изображений тонкодисперсных частиц глинистых минералов. Начиная с 50-х годов стали появляться работы, посвященные принципам действия, конструкции и техническим возможностям электронных микроскопов . Одновременно разрабатывались различные методы исследования в электронном микроскопе. В настоящее время в комплекс электронно-микроскопических методов входят просвечивающая и растровая электронная микроскопия, микродифракция и электронно-зондовый анализ. С помощью этого комплекса методов решается широкий круг вопросов минералогии. В него входят исследование тонкой микроморфологии минеральных индивидов и агрегатов, определение различных типов точечных дефектов и дислокаций, оценка степени неоднородности минералов, выявление морфологических и структурных соотношений между различными фазами, прямое изучение периодичности и дефектов кристаллических решеток минералов и др.

Растровый электронный микроскоп и рентгеновский микроанализатор это два прибора с большими возможностями, позволяющие на таком уровне наблюдать и изучать неоднородные органические и неорганические материалы и поверхности. В обоих приборах исследуемая область или анализируемый микрообъем облучаются тонко сфокусированным электронным пучком, либо неподвижным, либо разворачиваемым в растр по поверхности образца.

Физические основы растровой электронной микроскопии

Принцип действия основан на использовании некоторых эффектов, возникающих при облучении поверхности объектов тонко сфокусированным пучком электронов - зондом. Как показано на рис. 2. в результате взаимодействия электронов 1 с образцом (веществом) 2 генерируются различные сигналы. Основными из них являются поток электронов: отраженных 3, вторичных 4, Оже-электронов 5, поглощенных 6, прошедших через образец 7, а также излучений: катодолюминесцентного 8 и рентгеновского 9.

Рисунок 2. - Эффекты взаимодействия электронного луча с объектом

1 - электронный луч; 2 - объект; 3 - отраженные электроны; 4 - вторичные электроны; 5 - Оже-электроны; 6 - ток поглощенных электронов; 7 - прошедшие электроны; 8 - катодолюминесцентное излучение; 9 - рентгеновское излучение

Для получения изображения поверхности образца используются вторичные, отраженные и поглощённые электроны. Остальные излучения применяются в РЭМ как дополнительные источники информации.

Важнейшей характеристикой любого микроскопа является его разрешающая способность. Она определяется:

- площадью сечения или диаметром зонда;

- контрастом, создаваемым образцом и детекторной системой;

- областью генерации сигнала в образце. Диаметр зонда в основном зависит от конструктивных особенностей и качества узлов микроскопа и прежде всего электронной оптики. В современных РЭМ достигнуто высокое совершенство компонентов конструкции, что позволило уменьшить диаметр зонда до 5...10 нм.

Влияние контраста на разрешающую способность проявляется в следующем. Формирование контраста в РЭМ определяется разностью детектируемых сигналов от соседних участков образца, чем она больше, тем выше контраст изображения. Контраст зависит от нескольких факторов: топографии поверхности, химического состава объекта, поверхностных локальных магнитных и электрических полей, кристаллографической ориентации элементов структуры. Важнейшими из них являются топографический, зависящий от неровностей поверхности образца, а также композиционный, зависящий от химического состава. Уровень контраста определяется также и эффективностью преобразования падающего на детектор излучения, которое создает сигнал на его выходе. Если получаемый в итоге контраст недостаточен, то его можно повысить, увеличив ток зонда. Однако большой поток электронов в силу особенностей электронной оптики не может быть хорошо сфокусирован, то есть диаметр зонда возрастет и, соответственно, снизится разрешающая способность.

Другой фактор, ограничивающий разрешение, зависит от размеров области генерации сигнала в образце. Схема генерации различных излучений при воздействии электронного пучка на образец представлена на рис. 2. При проникновении первичных электронов в образец они рассеиваются во всех направлениях, поэтому внутри образца происходит расширение пучка электронов. Участок образца, в котором первичные электроны тормозятся до энергии Е=0, имеет грушевидную форму. Боковое расширение электронного пучка в образце в этом случае имеет величину от 1 до 2 мкм, даже когда зонд имеет диаметр 10 нм. Расхождение электронов приводит к тому, что площадь выхода на поверхность образца электронов будет больше фокуса электронного пучка. В связи с этим процессы рассеивания электронов внутри образца оказывают большое влияние на разрешающую способность изображений, получаемых в отраженных, вторичных и поглощенных электронах.

Рисунок 3 - Области сигналов и пространственное разрешение при облучении поверхности объекта потоком электронов (зонд).

физический спектроскопия оптический изотопный

Области генерации: 1 - Оже-электронов, 2 - вторичных электронов, 3 - отраженных электронов, 4 - характеристического рентгеновского излучения, 5 - тормозного рентгеновского излучения, 6 - флуоресценции

Отраженные электроны. Они образуются при рассеивании первичных электронов на большие (до 90^o) углы в результате однократного упругого рассеивания или в результате многократного рассеивания на малые углы. В конечном итоге первичные электроны, испытав ряд взаимодействий с атомами образца и теряя при этом энергию, изменяют траекторию своего движения и покидают поверхность образца. Размеры области генерации отраженных электронов (рис. 2) значительны и зависят от длины пробега электронов в материале образца. Протяженность области возрастает с увеличением ускоряющего первичные электроны напряжения и уменьшения среднего атомного номера Z элементов, входящих в состав образца. Протяженность области может изменяться от 0,1 до 1 мкм. Электроны, потерявшие в процессе отражения часть энергии, покидают образец на относительно больших расстояниях от места падения электронного зонда. Соответственно сечение, с которого получают сигнал (рис. 2), будет существенно больше сечения зонда. Поэтому разрешение РЭМ в режиме регистрации отраженных электронов небольшое и изменяется от десятков нанометров при работе с невысокими ускоряющими напряжениями и тяжелыми материалами до сотен нанометров при работе с большими ускоряющими напряжениями и легкими материалами.

Важной особенностью эмиссии отраженных электронов является ее зависимость от атомного номера элементов. Если атомный номер атомов материала в точке падения первичного пучка электронов мал (легкие атомы), то образуется меньшее количество отраженных электронов с малым запасом энергии. В областях образца, содержащих высокую концентрацию атомов с большим атомным номером (тяжелые атомы), большее число электронов отражается от этих атомов и на меньшей глубине в образце, поэтому потери энергии при их движении к поверхности меньше. Эти закономерности используются при получении изображений в отраженных электронах.

Вторичные электроны. Первичные электроны, проникающие в образец, взаимодействуют с электронами внешних оболочек атомов объекта, передавая им часть своей энергии. Происходит ионизация атомов образца, а высвобождающиеся в этом случае электроны могут покинуть образец и быть выявлены в виде вторичных электронов. Они характеризуются очень малой энергией до 50 эВ и поэтому выходят из участков образца очень близких к поверхности (рис. 2). Глубина слоя, дающего вторичные электроны, составляет 1...10 нм. В пределах этого слоя рассеивание электронов пренебрежимо мало, и поэтому при получении изображений во вторичных электронах разрешающая способность определяется прежде всего диаметром первичного зонда. Вторичные электроны обеспечивают максимальную в сравнении с другими сигналами разрешающую способность порядка 5...10 нм. Поэтому они являются в РЭМ главным источником информации для получения изображения поверхности объекта, и именно для этого случая приводятся паспортные характеристики прибора. Количество образующихся вторичных электронов слабо зависит от атомного номера элемента. Основным параметром, определяющим выход вторичных электронов, является угол падения пучка первичных электронов на поверхность объекта. Таким образом, вариации наклона микроучастков поверхности вызывают резко выраженные изменения в выходе вторичных электронов. Этот эффект используется для получения информации о топографии поверхности.

С целью увеличения эмиссии вторичных электронов часто образец устанавливается под углом к оси зонда. При этом будет ухудшаться резкость изображения - его размытие по краям. Для ее исправления в РЭМ предусмотрена система компенсации угла наклона. Метод наклона образца применяют при исследовании плоских объектов (металлографических шлифов и др.). Для образцов с сильно развитым рельефом полностью провести коррекцию угла наклона не удается.

В растровом электронном микроскопе наибольший интерес представляют сигналы, создаваемые вторичными и отраженными электронами, поскольку они меняются при изменении топографии поверхности по мере того, как электронный луч сканирует по образцу. Вторичная электронная эмиссия возникает в объеме вблизи области падения пучка, что позволяет получать изображения с относительно высоким разрешением. Объемность изображения возникает за счет большой глубины фокуса растрового электронного микроскопа, а также эффекта оттенения рельефа контраста во вторичных электронах. Возможны и другие типы сигналов, которые оказываются также полезными во многих случаях [3].

В физико-химической биологии широко применяются различные методы фракционирования, основанные на том или ином физическом либо химическом явлении. Довольно эффективный метод фракционирования предложил русский биолог и биохимик М.С. Цвет (1872-1919). Сущность его метода заключается в разделении смеси веществ, основанном на поглощении поверхностью твердых тел компонентов разделенной смеси, на ионном обмене и на образовании осадков.

Радиоспектроскопия

Оптическая спектроскопия опирается на открытие великого английского физика Ньютона, разложившего белый свет в радужную полоску - спектр, и на работы немецкого физика Фраунгофера, обнаружившего в спектре Солнца узкие темные линии, установившего, что они вызваны поглощением света в верхних слоях солнечной атмосферы, и впервые точно измерившего длину световых волн.

В 1854 г. немецкие ученые - химик Бунзен и физик Кирхгоф - начали изучать спектры пламени, окрашенного парами различных солей. В результате пятилетних работ они положили начало спектральному анализу, столетний юбилей которого будет отмечаться в 1959 г.

В 1860 г. они открыли с помощью спектрального анализа неизвестный ранее элемент цезий, а ещё через год - рубидий, положив этим начало триумфальному шествию нового метода исследования в химии, физике и астрономии.

Около 30 лет назад на основании теоретического анализа спектра аммиака, исследованного оптическими методами, было предсказано, что этот газ имеет спектральные линии в сантиметровом диапазоне радиоволн и должен сильно поглощать радиоволны длиной около 1,25 см.

Это предсказание было подтверждено в 1934 г. опытами Клитона и Вильямса, прибор которых представлял собой гибрид оптического спектроскопа с радиосхемой. В качестве источника излучения они применили магнетрон.

Однако этот изолированный опыт можно отнести лишь к предыстории радиоспектроскопии, ибо в то время технические возможности не позволяли производить систематические исследования спектров в сантиметровом диапазоне. Такие возможности появились во время второй мировой войны в связи с развитием радиолокации. Потребности радиолокации выдвинули и первые задачи, теоретическое исследование которых по существу привело к возникновению радиоспектроскопии. Речь идет о поглощении радиоволн в атмосфере.

Работы В. Л. Гинзбурга (СССР), появившиеся в 1942 г. и в последующие годы, и затем работы Ван-Флека (США) показали, что поглощение сантиметровых радиоволн в атмосфере вызвано главным образом парами воды. Особенно сильно водяные пары поглощают радиоволны длиной от 1,2 до 1,6 см. Именно это воспрепятствовало применению в радиолокации волн длиной 1,25 см, для которых в США были разработаны клистроны, магнетроны и другая аппаратура.

Рис. 4. Наблюдение оптического спектра излучения.1 - пламя, скрашенное парами исследуемого вещества, 2 - линза, 3 - щель спектроскопа, 4 - объектив, 5 - призма, 6 - объектив, 7 - экран с изображением спектра.

В результате для радиолокации начали применять другие диапазоны, а аппаратура, разработанная на волну 1,25 см, помогла проведению экспериментальных исследований в области радиоспектроскопии.

Подлинное возникновение радиоспектроскопии следует отнести к 1946 г., в течение которого были опубликованы результаты свыше 20 теоретических и экспериментальных работ в этой области. Отличием новых работ по сравнению с первым наблюдением поглощения в аммиаке было то, что исследования велись при низких давлениях газов, при которых взаимодействие молекул невелико и можно отчетливо наблюдать отдельные спектральные линии. Это и может служить основанием для причисления нового метода исследования к спектроскопии - науке, основанной на исследовании спектральных линий.

Общеизвестно, что радиоволны отличаются от видимого света только длиной волны. Именно это отличие и обусловливает разницу между радиоспектроскопией и оптической спектроскопией. При исследованиях оптических спектров обычно имеют дело со спектрами излучения, подобными тем, которые 100 лет назад изучали Бунзен и Кирхгоф. Гораздо реже в оптике исследуются спектры поглощения. Уже в диапазоне невидимых инфракрасных волн положение меняется. Здесь основную роль играют спектры поглощения. Это связано главным образом с тем, что интенсивность излучения быстро падает по мере увеличения длины волны.

В радиодиапазоне интенсивность спектров излучения в естественных условиях столь мала, что до сих пор в природе наблюдалась лишь единственная спектральная линия излучения - линия межзвездного водорода на волне 21 см, Поэтому в радиоспектроскопии изучают главным образом спектры поглощения. О причинах этого подробнее будет сказано ниже.

Основные спектральные линии, наблюдаемые при радиоспектроскопических исследованиях, обусловлены главным образом изменениями вращательной энергии молекул. Спутники, наблюдаемые иногда вблизи этих линий, связаны большей частью с влиянием электрических или магнитных полей. Чрезвычайно важно, что во многих случаях в наблюдаемых спектральных линиях удается обнаружить дополнительную, так называемую сверхтонкую, структуру, изучая которую можно определить ряд важных свойств атомных ядер. Прежде чем говорить о том, каким образом можно, исследуя спектральные линии, проникать в тайны строения вещества, ознакомимся с методами наблюдения этих линий.

Сравним радиоспектроскоп с оптическим и инфракрасным спектроскопом.

При исследовании оптических спектров опыт обычно ставится так. Исследуемое вещество помещается в пламя горелки или электрической дуги. Раскаленные пары излучают свет, который собирается линзой и через узкую щель падает на призму (или диффракционную решетку). Призма разлагает свет в спектр и отбрасывает его на экран или фотопластинку. Вместо фотопластинки можно поставить болометр (или фотоэлемент) и, перемещая его по спектру, регистрировать изменение яркости в зависимости от положения болометра. При этом каждому положению болометра соответствует определенная длина волны.

При наблюдении спектров поглощения опыт несколько видоизменяется. Источником обычно служит раскаленный угольный электрод электрической дуги, дающий на экране спектроскопа сплошной спектр. Исследуемый объект, например сосуд с жидкостью, ставят на пути световых лучей и о спектре поглощения жидкости судят по уменьшению яркости различных участков спектра. Таким способом обычно пользуются и в диапазоне инфракрасных волн, но при этом чаще всего вместо призмы для получения спектра пользуются диффракционными решетками особого типа.

Рис. 5. Наблюдение спектра поглощения.1 - электрическая дуга, 2 - линза, 3 - щель спектроскопа, 4 - объектив, 5 - призма, 6 - объектив, 7 - исследуемое вещество, 8 - экран с изображением спектра.

Опыт можно было бы и видоизменить: оставляя болометр неподвижным, можно поворачивать вокруг оси призму или диффракционную решетку так, чтобы мимо болометра последовательно проходили различные участки спектра.

Радиоспектроскоп не содержит ни призм, ни щелей, ни дифракционных решеток, необходимых в оптике для разложения излучения источника в спектр. Они оказываются ненужными потому, что радиотехника предоставляет в распоряжение ученых источники колебаний с очень узким спектром частот-источники монохроматических (одноцветных) колебаний, как их обычно называют, заимствуя термин из арсенала оптики.

Перестраивая частоту такого генератора, мы по существу достигаем того же, что достигается в результате вращения призмы в инфракрасном спектрометре - исследуемое вещество последовательно облучается электромагнитными волнами различных частот.

Простейший радиоспектроскоп состоит из трех основных частей: источника монохроматического излучения, поглощающей ячейки и индикатора (рис. 6). Источником обычно служит отражательный клистрон, допускающий удобную, практически безынерционную перестройку частоты без затраты мощности. Радиоволны, излучаемые клистроном, направляются в поглощающую ячейку, где они взаимодействуют с исследуемым веществом - поглощаются им. Поглощающая ячейка - это чаще всего отрезок волновода, в котором помещается исследуемый газ. В конце волновода в большинстве радиоспектроскопов помещается полупроводниковый детектор, выполняющий роль индикатора. Иногда детектор заменяется болометром.

Рис. 6. Схема простого радиоспектроскопа.1 - источник излучения (клистрон), 2 - аттенюатор, 3 - поглощающая ячейка со слюдяными окошками, 4- детектор, 5 - усилитель, 6 - осциллограф, 7 - генератор напряжения развертки.

Отрезок волновода, служащий поглощающей ячейкой, с обоих концов отделен от остальной установки окошками из тонкой слюды, хорошо пропускающей сантиметровые радиоволны. Это позволяет откачивать из поглощающей ячейки воздух и заполнять ее исследуемым газом, поддерживая его давление равным стотысячным или миллионным долям атмосферы.

В простейших радиоспектроскопах выходной сигнал детектора после усиления подается на осциллограф, развертка которого осуществляется обычным генератором пилообразного напряжения. Это же напряжение управляет частотой радиоволн, излучаемых клистроном, Поэтому каждая точка на линии развертки осциллографа соответствует вполне определенному значению частоты.

Если во время работы радиоспектроскопа в поглощающей ячейке поддерживается вакуум, то при правильной настройке прибора луч на экране осциллографа прочерчивает прямую линию. Это естественно, так как мощность, достигающая детектора, в этом случае не зависит от частоты. Если же в поглощающей ячейке находится газ, спектральная линия которого лежит в диапазоне частот, пробегаемых при перестройке клистрона, то картина меняется. До тех пор, пока частота клистрона далека от спектральной линии, поглощение мало, и мощность, падающая на детектор, сохраняется неизменной. Но по мере приближения настройки клистрона к резонансной частоте поглощение радиоволны в исследуемом газе постепенно возрастает, достигая максимума при точном совпадении. Соответственно изменяется и мощность радиоволны, попадающая на детектор. Поэтому на экране осциллографа появляется кривая, изображающая зависимость мощности, попадающей на детектор, от частоты, т. е. контур спектральной линии исследуемого газа (рис. 4).

В этом состоит одно из существенных преимуществ радиоспектроскопов перед оптическими, в которых форма спектральных линий получается обычно в виде зависимости потемнения фотографической пластинки от длины волны (частоты) света. Для исследования формы линии необходимо еще провести трудоемкое изучение потемнения пластинки (фотометрирование), учтя при этом неизбежное влияние ширины щели спектроскопа, дефекты фотоэмульсии, наличие вуали и т. п.

В оптике возможность разделения двух близких спектральных линий определяется главным образом качеством спектроскопа, как говорят оптики, его "разрешающей способностью". С помощью лучших спектроскопов оптикам с трудом удается разделить две спектральные линии, отстоящие одна от другой на стотысячную долю наблюдаемой длины волны.

В радиоспектроскопии благодаря применению монохроматических источников излучения удается разделить спектральные линии, отстоящие всего на стомиллионные доли длины наблюдаемой волны, причем предел разрешающей способности кладется не свойствами прибора, а шириной наблюдаемых спектральных линий.

Чем же обусловлена ширина спектральных линий ? Она определяется главным образом условиями, в которых находятся наблюдаемые атомы или молекулы. Чем сильнее внешние воздействия, влияющие на внутренние состояния атома или молекулы, тем шире соответствующие спектральные линии.

Спектральная линия изолированного одиночного атома (или молекулы) в радиодиапазоне имела бы ширину, равную одной миллиардной от одной миллиардной длины волны. Дело в том, что свойства атомов и молекул отличаются от свойства привычных нам крупных тел, состоящих из очень большого числа атомов и молекул.

Запас внутренней энергии изолированного атома и молекулы не может принимать произвольных значений. Для каждого атома и молекулы существует вполне определенный набор значений внутренней энергии, так что переходы между ними могут происходить лишь скачками, при которых энергия меняется порциями - квантами. Переход изолированного атома из состояния с большей энергией в состояние с меньшей энергией сопровождается излучением кванта электромагнитной энергии, соответствующего электромагнитной волне вполне определенной частоты. Это значит, что такой процесс сопровождается излучением предельно узкой спектральной линии.

В лаборатории, однако, невозможно наблюдать излучение одиночного атома. Обычно в опыте участвует большое число атомов или молекул, которые так или иначе взаимодействуют между собой и с окружающими предметами. Если взаимодействие очень сильно, то это сказывается на значениях допустимых уровней их внутренней энергии. Так как взаимодействующие частицы всегда участвуют в хаотическом тепловом движении, то величина взаимодействия все время беспорядочно изменяется. Поэтому вместо фиксированных значений внутренней энергии возникают целые области допустимых значений, а переходы между этими областями приводят к излучению различных по величине квантов, т. е. электромагнитных волн с более или менее произвольным набором частот. Вот почему в результате взаимодействия молекул между собой спектральные линии уширяются.

В газах при обычных давлениях молекулы чрезвычайно часто соударяются между собой. Поэтому спектральные линии в радиодиапазоне оказываются столь широкими, что при атмосферном давлении их невозможно наблюдать раздельно. Удается зафиксировать лишь весьма плавные изменения величины поглощения радиоволны при изменении частоты.

Если же давление газа уменьшено до стотысячной доли атмосферы, то соударения становятся более редкими, и спектральные линии становятся настолько узкими, что их можно без труда наблюдать раздельно. При дальнейшем понижении давления газа ширина спектральных линий уменьшается, но не беспредельно. Предел дальнейшего сужения определяется соударениями молекул со стенками установки.

В условиях очень малого давления молекулы практически не сталкиваются между собой, а свободно летают от одной стенки сосуда к другой. Эти соударения будут происходить тем реже, чем больше размеры сосуда. Поэтому дальнейшее сужение спектральных линий может быть достигнуто лишь за счет увеличения размеров сосуда.

Но и этот путь не беспределен. Следующее ограничение сужения спектральной линии определяется эффектом Допплера, который заключается в том, что наблюдаемая частота электромагнитной волны зависит от относительного движения источника и наблюдателя. Если источник и наблюдатель сближаются, то частота возрастает и наоборот. Это хорошо известно на примере изменения тона паровозного гудка при движении поезда.

Так как в результате хаотического теплового движения всегда имеются молекулы, движущиеся с различными скоростями и в произвольных направлениях относительно наблюдателя, то имеется некоторый разброс в частотах излучаемых или поглощаемых ими электромагнитных волн. Этот разброс тем сильнее, чем больше средняя скорость молекул, т. е. чем выше температура газа и чем легче его молекулы. При комнатной температуре этот эффект препятствует наблюдению спектральных линий газов более узких, чем миллионная доля длины волны. Понижая температуру, можно добиться дальнейшего сужения спектральных линий. Однако этот путь тоже не беспределен, ибо при понижении температуры сильно падает упругость паров, т. е. уменьшается число молекул, участвующих в опыте.

О методах получения более узких спектральных линий и о наблюдении спектральных линий в жидкостях и твердых телах будет сказано ниже.

Радиоспектроскопия обладает огромным преимуществом перед оптической спектроскопией также благодаря тому, что на ее вооружении находятся радиотехнические методы измерения частоты колебаний, позволяющие работать с погрешностями, меньшими чем одна миллиардная от измеренной частоты.

Но даже легко осуществимые измерения с погрешностями порядка десятимиллионных долей обеспечивают радиоспектроскопии такую точность, что полученные ею результаты ограничиваются не ошибками измерения частоты, а погрешностями в определении таких универсальных постоянных, как постоянная Планка, постоянная Больцмана и др., которые входят в дальнейшие расчеты.

Техника эксперимента современной физико-химической биологии обязательно включает те или иные вычислительные средства, которые в значительной степени облегчают трудоемкую работу экспериментатора и позволяют получить более достоверную информацию о свойствах исследуемого живого объекта.

Характерная особенность современной физико-химической биологии - ее стремительное развитие. Трудно перечислить все ее достижения, но некоторые из них заслуживают особого внимания. В 1957 г. был реконструирован вирус табачной мозаики из составляющих его компонентов. В 1968-1971 гг. произведен искусственный синтез гена для одной из транспортных молекул путем последовательного введения в пробирку с синтезируемым геном новых нуклеотидов. Весьма важными оказались результаты исследований по расшифровке генетического кода: было показано, что при введении искусственно синтезированных молекул в бесклеточную систему, т. е. систему без живой клетки, обнаруживаются информационные участки, состоящие из трех последовательных нуклеотидов, являющихся дискретными единицами генетического кода. Авторы этой работы - американские биохимики М. Ниренберг (р. 1927), X. Корана (р. 1922) и Р. Холли (р.1922).

Расшифровка различных видов саморегуляции - также важное достижение физико-химической биологии. Саморегуляция как характерное свойство живой природы проявляется в разных формах, таких, как передача наследственной информации - генетического кода; регуляция биосинтетических процессов белка (ферментов) в зависимости от характера субстрата и под контролем генетического механизма; регуляция скоростей и направлений ферментных процессов; регуляция роста и морфогенеза, т.е. образования структур разного уровня организации; регуляция анализирующей и управляющей функций нервной системы.

Живые организмы - весьма сложный объект для исследований. Но все же современные технические средства позволяют все глубже и глубже проникнуть в тайны живой материи.

Размещено на Allbest.ru