Взаємодія іонів двовалентних металів з неканонічними структурами нуклеїнових кислот

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Вступ

Актуальність теми. Однією з найважливіших задач біофізики і фізики нуклеїнових кислот (НК) є з'ясування молекулярних механізмів, які забезпечують виконання їх біологічних функцій. Іони металів беруть участь в підтриманні нормального функціонування генетичного апарата клітини, а також можуть призводити до його порушення. Це викликає інтерес до вивчення взаємодії іонів з природними та синтетичними нуклеїновими кислотами, у тому числі з їх неканонічними структурами. В теперішній час проводяться численні дослідження можливостей використання багатоланцюгових структур НК для лікування вірусних, генетичних та онкологічних захворювань. Основою антигенної та антизмістової стратегій виборчого пригнічення експресії генів є формування триплексів. Управління утворенням квадруплексів в теломірних кінцях хромосом також представляє потенціальний механізм регулювання функціонування клітини. Проте умови стабільності триплексів та квадруплексів вивчені недостатньо, тому представляє інтерес вивчення конформаційних переходів в системах, що містять одно- та багатоланцюгові спіралі, в присутності іонів металів. В якості модельних систем особливий інтерес представляють гомополінуклеотиди, тому що в залежності від умов вони можуть знаходитися в стані клубка, одноланцюгових спіралей, а також утворювати канонічні та неканонічні багатоланцюгові структури.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було встановлення основних закономірностей впливу температури та концентрації іонів двовалентних металів (Mg2+, Ca2+, Mn2+, Ni2+, Cu2+) на конформаційну рівновагу в водних розчинах гомополінуклеотидів різного рівня структурної організації та з'ясування фізичної природи структурних переходів, що індукуються іонами Mt2+, а також встановлення особливостей форми фазових діаграм металокомплексів при різних іонних силах розчину.

Для досягнення поставленої мети вирішувалися наступні задачі:

Одержати фазові діаграми металокомплексів НК (діаграми температура конформаційних переходів - концентрація іонів Mt2+);

Визначити атоми, що координують іони Mt2+ в одно- та багатоланцюгових полінуклеотидах, що утворені аденіном та урацилом (polyA, polyU, AU, A2U), а також гіпоксантином;

Встановити характер конформаційних переходів, що індукуються іонами металів;

Розрахувати константи зв'язування, що характеризують утворення відповідних металокомплексів.

1. Огляд літератури, присвяченої експериментальному та теоретичному дослідженню комплексів неканонічних структур НК з іонами металів

Розглянуто біологічну роль неканонічних структур НК. Наведені методи теоретичного опису взаємодії НК з низькомолекулярними лігандами, які надалі використовувалися в роботі для визначення констант зв'язування.

Детально проаналізована існуюча інформація про комплекси іонів одно- та двовалентних металів з багатоланцюговими структурами НК. Показано, що в випадку AЧU та AЧ2U подібні дослідження були виконані тільки для іонів Na+ і K+. Для комплексів цих полінуклеотидів з Mg2+ і Ni2+ дослідження були проведені тільки при окремих концентраціях іонів, що не дозволяє отримати повні фазові діаграми. Дані про взаємодію іонів Mt2+ з 1I і 4I малочисельні та мають якісний характер. Дані про константи зв'язування перехідних металів з AЧU, AЧ2U і 4ЧI практично відсутні.

Розглянуто теоретичне описання переходу спіраль-клубок в присутності низькомолекулярних речовин (теорія лігандів, Франк - Каменецкий, 1972). Показано, що викликане зв'язуванням лігандів змінення температури переходу визначається формулою:

,

де Tm і Н - відповідно температура та ентальпія переходу спіраль - клубок, Tm - температура, що відповідає переходу в нову конформацию 50% ланок полінуклеотиду, Tm0 - Tm в відсутності лігандів, Af - вільна концентрація лігандів, K2 та K1 - константи зв'язування з спіральною та клубкоподібною фазами полінуклеотиду, відповідно.

2. Загальна характеристика матеріалів та методів дослідження

Об'єктами дослідження є гомополінуклеотиди polyA, polyU, AЧU, AЧ2U, 1I і 4I (Sigma, Serva).

Полінуклеотиди та хлориди Mg2+, Ca2+, Mn2+, Ni2+ і Cu2+ розчиняли в ацетатному (pH 6.0, [Na+] = 10-3-10-1 M) або какодилатному (pH 7.0, [Na+] = 10-2 М) буферах. Для одержання чотирьохланцюгової polyI одноланцюгову polyI розчиняли в ацетатному буфері, що містив 1 М Na+, та витримували при 20С протягом 300 годин. При вимірюванні диференційних УФ спектрів концентрація НК (Р) складала (1±0.1)Ч10-4М, в експериментах по плавленню Р=(6.5±0.5)Ч10-4М. Похибка визначення концентрації Р та іонів металів складала 0.5%.

Експериментальні методи: диференційна УФ спектроскопія, термічна денатурація.

Метод УФ спектроскопії має високу чутливість до змін поглинання НК, що дозволяє використовувати розведені розчини, зводжуючи до мінімуму агрегацію полінуклеотидів в відсутності іонів, а також збільшити діапазон досліджених концентрацій іонів. Форма диференційних УФ спектрів (ДУФС) залежить від природи атомів, з якими взаємодіє іон (Сорокин, Благой, 1991). Метод ідентифікації зв'язуючих центрів грунтується на порівнянні форми ДУФС полінуклеотидів з формою диференційних спектрів мономерів, для яких місця зв'язування іонів відомі, а також з ДУФС, зумовленими протонуванням, оскільки для протонів іонізовані атоми визначені з великим ступенем надійності. Експериментальні ДУФС реєстрували з використанням 4-кюветної схеми. Похибка вимірювання оптичної щільності складала 0.5%. Вимірювання проводилися на спектрофотометрі Specord M 40, Carl Zeiss Jena.

Термічну денатурацію полінуклеотидів проводили в герметичних кварцевих кюветах, розміщених в 2 ідентичних мідних блоках, що знаходилися в камері спектрофотометра Specord UV VIS фірми Carl Zeiss Jena. Нагрів проводився із швидкістю 0.25С/мин. Криві конформаційних переходів 21, 31 та 32 реєструвались в максимумі поглинання полінуклеотидів, переходи 23 і 32 спостерігались в ізобестичній точці спектра гіперхромізму подвійної спіралі (н = 35700см-1). Похибка вимірювання температури знаходилась в межах ±0.5С.

3. Експериментальні дані про комплекси AЧU та AЧ2U з іонами Mg2+

Форма ДУФ спектрів AЧU і A2U (Деа) є "дзеркальним" відображенням спектрів Деh, зумовлених плавленням подвійної спіралі AЧU та потрійної спіралі A2U, відповідно. Це означає, що при 200С і 10-2 M Na+ AЧU та A?2U мають деяку кількість невпорядкованих ланок, які при додаванні Mg2+ переходять в спіральний стан.

Одержані криві плавлення комплексів AU та A2U з іонами Mg2+ були використані для побудови діаграм конформаційних переходів. За винятком фазових діаграм комплексів A2U з іонами Mg2+ при низьких іонних силах розчину, усі інші мають “критичну” точку, в якої змінюється тип конформаційного переходу. Відповідна їй концентрація іонів Mg2+ слабо залежить від початкової конформації полінуклеотиду. Крім того, при 10-1M Na+ накладення фазових діаграм комплексів AU та A2U з іонами Mg2+ показує наявність "критичної" точки, спільної для обох полінуклеотидів. Їй відповідає температура (Tm)cr=(55-58)C і концентрація [Mg2+t]cr = (3,5-5,5)10-5М. Якщо співвідношення концентрацій polyA та polyU в розчині дорівнює 1:2, то при більш високих температурах і вищих від “крітичної” концентраціях іонів Mg2+ при плавленні потрійної спіралі A2U подвійна спіраль AU не утворюється, а при співвідношенні 1:1 при плавленні подвійної спіралі утворюється потрійна при температурах, більш низьких, ніж “критична”.

В роботі також були отримані повні фазові діаграми AU і A2U з іонами Mg2+. Форма фазових діаграм суттєво залежить від іонної сили розчину. Так, при 10-2 М Na+ при руйнуванні потрійної спіралі AЧ2U в якості проміжної конформації утворюється подвійна спіраль, яка існує в вузькому температурному інтервалі (3-5С). При 10-1 М Na+ AЧ2U область існування подвійної спіралі звужується з підвищенням вмісту Mg2+ і при концентрації іонів вищє, ніж критична, A2U при нагріванні розпадається безпосередньо на одноланцюгові клубки.

Аналіз температурних інтервалів конформаційних переходів показав, що перехід 32 має суттєво меншу кооперативність, ніж переходи 21 і 31. Інтервал переходу (T) визначається, в основному, величинами його ентальпії та фактора кооперативності (Lazurkin Yu.S., Frank-Kamenetskii M.D., Trifonov E.N. 1970)

.

Показано, що фактори кооперативності для всіх вивчених переходів є величинами одного порядку (10-4 - 10-5). Таким чином, причиною меншої кооперативності переходу.

Фазові діаграми дозволили розрахувати значення констант зв'язування Mg2+ з polyA та polyU по теорії лігандів. Знайдені константи погоджуються з експериментально одержаними результатами інших авторів в межах розсіяння їх значень. Це свідчить про те, що термодинамічний опис конформаційних переходів в досліджених системах, оснований на теорії лігандів, є коректним. Підтвердженням цього є також задовільна згода експериментальної та розрахованої теоретично залежностей інтервалу переходу 31 від ступеню зв'язування при:

4. Експериментальні дані про взаємодію Ni2+ з AЧU і AЧ2U

Форма ДУФС комплексів Ni2+ з AЧU і AЧ2U показує, що іони Ni2+, подібно Mg2+, не зв'язуються з основами подвійних та потрійних спіралей, а взаємодіють тільки з фосфатними групами, що призводить до упорядкування розупорядкованих ділянок полінуклеотидів. Причиною відсутності взаємодії з N7 аденіна в разі AU є, можливо, жорсткість подвійної спіралі, що перешкоджає утворенню хелатних комплексів N7 - Ni2+ - О(Р). В A2U N7 бере участь в утворенні водневих зв'язків, що додатково утруднює взаємодію Ni2+ з цим гетероатомом.

Подібність форм ДУФС AMP і polyA, індукованих іонами Ni2+, показує, що в обох випадках координуючим іон атомом є N7 аденіну. В разі polyA при кімнатній температурі ця взаємодія спостерігається при [Ni2+]>4Ч10-4М. При [Ni2+]>10-3М відбувається утворення компактних часток з ефективним радіусом Rэф ~100 Е, оцінка якого проведена по хвильовій залежності оптичної щільності від хвильового числа в області = (16000 - 30000)см-1.

Вплив іонів Mg2+ і Ni2+ на конформаційні переходи AU і A2U якісно подібний, але є й деякі відрізнення. Як для Mg2+, так і для Ni2+ зростання вмісту іонів призводить до підвищення температур переходів 21 та 31. Значення критичної концентрації для цих іонів співпадає, однак, в разі іонів Ni2+ температура переходу 23 не залежить від концентрації іонів, тоді як для Mg2+ при концентрації вище критичної, стабільність подвійної спіралі знижується з підвищенням вмісту іонів, внаслідок чого область існування потрійної спіралі розширюється.

Розрахунок констант зв'язування Ni2+ з AU і A2U було виконано в рамках теорії лігандів. Зв'язування Ni2+ характеризується негативною кооперативністю, що зумовлено кулонівським відштовхуванням іонів, що адсорбуються з розчину, іонами, вже зв'язаними з полімером. Одержані значення констант зв'язування дозволяють пояснити деякі особливості фазових діаграм. Так, причиною дестабілізації AU іонами Mg2+ є виконання умови KA2U > KAU. Відсутність залежності температури переходу 23 від вмісту Ni2+ обумовлена близькими значеннями констант зв'язування Ni2+ з AU, A2U і polyA. Підвищення термостабільності подвійних та потрійних спіралей в присутності іонів Mg2+ і Ni2+ викликано тим, що константи зв'язування іонів з багатоланцюговими спіралями вище, ніж з одноланцюговою polyU.

5. Вивчення взаємодії іонів Mg2+, Ca2+, Mn2+, Ni2+ та Cu2+ з одно- та чотирьохланцюговою polyI

Для 4I спектр a складається з конформаційної та координаційної (b) складових. Останній обумовлений взаємодією іонів з гетероатомами основ. Порівняння індукованих іонами Cu2+ спектрів a для 1I, з координаційною складовою ДУФС 4I, а також з спектрами протонування по N7 та депротонування по N1 дозволяє припустити, що іони Cu2+ утворюють хелатні комплекси, взаємодія з N7 та через молекулу води гідратної оболонки іона з О6, що призводить до депротонування N1.

Руйнування упорядкованої структури 4I іонам Cu2+, що відбувається при цьому, зумовлено, можливо, розривом системи водневих зв'язків, що забезпечують її стабільність.

В цьому розділі представлені також розрахунки констант зв'язування іонів Cu2+ з 1I і 4I. На відмінність від антикооперативністі зв'язування Cu2+ з 4I, взаємодія з 1I характеризується позитивною кооперативністю. Зростання відмін між K4 та K1 при зростанні ступеню зв'язування є додатковим фактором руйнування чотирьохланцюгової структури.

Іони Mn2+ та Ni2+ взаємодіють з 4I подібно до іонів Cu2+ тільки при суттєво більш високих концентраціях. При великому вмісті іонів Ni2+ та Cu2+ спостерігається компактизація 1I, що утворилася в результаті розпаду 4I. Як і в випадку polyA в присутності іонів Ni2+, ефективний радіус компактних часток 1I складає ~100 Е. Ця компактизація повинна супроводжуватися дегідратацією полімеру, що може бути причиною позитивної кооперативністі взаємодії іонів Cu2+ з 1I. Іони Mg2+ і Ca2+ в вивченому діапазоні концентрацій не зв'язуються з основами 4I та не змінюють її конформацію.

нуклеїновий конформаційний фазовий полінуклеотид

Висновки

В дисертації встановлені основні закономірності впливу температури та концентрації іонів одно- та двовалентних металів на конформаційну рівновагу в водних розчинах гомополінуклеотидів. Встановлені температурні та концентраційні області стабільного стану окремих конформацій. Показано, що форма діаграм конформаційної рівноваги визначається значеннями констант зв'язування іонів Mt2+ з різними конформаціями полінуклеотида.

1. Вперше отримані фазові діаграми конформаційної рівноваги одно- (polyA, polyU), дво- (polyA?polyU) та трьохланцюгових (polyA2polyU) полінуклеотидів в розчинах, що містять іони Mg2+ та Ni2+, в широкому інтервалі температур (20 - 96С) та концентрацій іонів (10-5 - 10-2)М, визначена "критична" концентрація іонів Mg2+ та Ni2+, перевищення якої призводить до зміни типу конформаційного переходу;

2. Знайдено, що перехід 32 є значно менш кооперативним, ніж переходи 21 та 31. Причиною цього є низька величина ентальпії переходу 32;

3. Форма фазових діаграм комплексів AU та A2U з іонами Mg2+ та Ni2+ суттєво залежить від концентрації іонів Na+. Так, при їх концентрації, близькій до фізіологічної (0.1М), підвищення вмісту іонів Mg2+ в розчині AU призводить до безперервного розширення діапазону стабільного стану потрійної спіралі, тоді як при 10-2 М Na+ він не залежить від концентрації Mg2+. При цьому "критична" точка на фазових діаграмах комплексів A2U з ионами Mg2+ та Ni2+ відтсутня;

4. Показано, що теорія лігандів задовільно описує зміну параметрів переходів 31, 32 та 21 в AU та A2U, викликану іонами Mg2+ та Ni2+. З термодинамічного аналізу, виконаного в рамках цієї теорії, випливає, що зміна температур конформаційних переходів визначається константами зв'язування іонів Mt2+ з одно- та багатоланцюговими спиралями;

5. Знайдено, що подібно до іонів Mg2+, іони Ni2+ зв'язуються тільки з атомами кисню фосфатних груп AU та A2U. Взаємодія з N7 аденіну цих полінуклеотидів відсутня, в той час як вона спостерігається в AMP та polyA;

6. Встановлено, що іони Cu2+, Ni2+, Mn2+ зв'язуються з N7 гіпоксантину, що призводить до руйнування упорядкованої структури чотирьохланцюгової polyI. В присутності високих концентрацій цих іонів спостерігається утворення компактних часток одноланцюгової polyI з ефективним радіусом ~100 Е. Іони Mg2+ та Cа2+ не взаємодіють з N7 4polyI і відповідно не змінюють її конформацію;

7. Впереше встановлена залежність від ступеню зв'язування констант асоціації Cu2+ з гіпоксантином чотирьох- та одноланцюгової polyI і іонів Ni2+ з фосфатами AU та A2U. Взаємодія іонів з мультиланцюговими спіралями характеризується негативною кооперативністю, зв'язування іонів Cu2+ з одноланцюговою polyI має позитивну кооперативність.

Література

1. Sorokin V.A.,Valeev V.A., Degtyar M.V.,Blagoi Yu.P. Interaction of Ni2+ ions with homopolynucleotides containing adenine and uracil and its monomers // Biophysical Bulletin - N466 - Series - "Molecular Biophysics". - 1999. - Issue 5(3). - P.33 - 37.

2. Sorokin V.A., Valeev V.A., Gladchenko G.O., Degtyar M.V., Blagoi Yu.P. Interaction of divalent metal ions with polyriboinosinyc acid // Macromolecular Chemistry and Physics - 2000. - V.201, N 17. - P. 2408 - 2416.

3. Sorokin V.A., Valeev V.A., Gladchenko G.O., Degtyar M.V., Blagoi Yu.P. Ni2+ Ion Effect on Conformations of Single-, Double- and Three-Stranded Homopolynucleotides Containing Adenine and Uracil // Macromolecular Chemistry and Physics - 2001. - N 5. - P. 191 - 203.

4. В.А. Сорокин, В.А. Валеев, Г.О. Гладченко, М.В. Дегтяр, А.Ю. Рубина, Е.А. Андрусь, Ю.П. Благой, В.А. Карачевцев Влияние ионов Mg2+ на конформацию polyApolyU// Вісник Харківського університету. - № 528. - Серія "Молекулярна Біофізика" - 2001. - Вип. 2(9). - С. 45-50.

Размещено на Allbest.ru