Фізичні механізми асоціації біологічно активних ароматичних молекул та їхнього конкурентного зв’язування з ДНК

Размещено на http://www.allbest.ru/

Харківський національний університет ІМ. В.Н.Каразіна

УДК 577.113:541.49

Фізичні механізми асоціації біологічно активних ароматичних молекул та їхнього конкурентного зв'язування з ДНК

03.00.02 - біофізика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата фізико-математичних наук

Євстигнєєв Максим Павлович

Харків 2002

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Севастопольському державному технічному університеті Міністерства освіти і науки України.

Науковий керівник

доктор фізико-математичних наук, професор Веселков Олексій Никонович, Севастопольський державний технічний, університет, завідувач кафедри фізики.

Офіційні опоненти:

доктор фізико-математичних наук, старший науковий співробітник, Сорокін Віктор Олександрович, Фізико-технічний інститут низьких температур ім. Б.І. Вєркіна НАН України, провідний науковий співробітник відділу молекулярної біофізики (м. Харків);

кандидат фізико-математичних наук, старший науковий співробітник, Больбух Том Вікторович, Інститут радіофізики та електроніки ім. О.Я.Усікова НАН України, старший науковий співробітник відділу біофізики (м. Харків).

Провідна установа

Інститут теоретичної фізики ім. М.М. Боголюбова НАН України, м. Київ.

Захист відбудеться “_29_”_березня_ 2002 р. о _15¹⁵ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.051.13 Харківського національного університету ім. В.Н.Каразіна, 61077, м.Харків, пл.Свободи, 4. ауд.7-4.

З дисертацією можна ознайомитись у Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету ім. В.Н.Каразіна за адресою:

61077, м. Харків, пл.Свободи, 4.

Автореферат розісланий “_19_”____02_____ 2002 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Гаташ С.В.

гетероасоціація ароматичний зв'язування конкурентне

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Відомо, що висока біологічна активність багатьох ароматичних речовин - антибіотиків, які мають різноманітні хіміотерапевтичні властивості, барвників, які проявляють мутагенну або канцерогенну активність, різних ароматичних сполук, що надходять в організм з харчовими продуктами або внаслідок забруднення навколишнього середовища, - зумовлена їх високою здатністю до зв'язування з молекулами ДНК і РНК в клітині. Разом з тим, встановлено, що активність ароматичних речовин може суттєво змінюватись при надходженні їх в клітину в комбінації з іншими ароматичними сполуками. Це має важливе теоретичне і практичне значення. Так, використання антибіотиків у комбінації застосовують у кліничній практиці при лікуванні пухлинних захворювань. Спільне застосування різноманітних антибіотиків може виявляти різний вплив на їх фармакологічну активність, що також справедливо і при взаємодії антибіотиків з ароматичними молекулами з харчових джерел (поліфенолів, метаксантинів, таких як кофеін, та ін.). Останнє може обумовити відповідні вимоги до дієти в процесі медикаментозного лікування.

Раніше було висловлено припущення, що ароматичні молекули можуть виступати в ролі “перехоплювачів” антибіотиків, що зв'язуються з ДНК шляхом інтеркаляції. Одне з пояснень цього явища засновано на припущенні про утворення гетерокомплексів між молекулою “перехоплювача” і антибіотика, що призводить до зменшення концентрації інтеркалятора і, відповідно, його медико-біологічної активності. Отже, вирішення питань про закономірності спільної дії біологічно активних ароматичних молекул і регулювання медико-біологічної активності при їх використанні в комбінації зв'язане із всебічним аналізом процесів само- і гетероасоціації ароматичних молекул.

Одним із самих ефективних експериментальних засобів, які дозволяють отримати найбільш повну інформацію про структурні і термодинамічні параметри молекулярних систем у розчині, є метод ЯМР-спектроскопії. Однак на сьогоднішній день не існує досить точної статистико-термодинамічної моделі молекулярної гетероасоціації, яка адекватно описуюе експериментальні дані ЯМР для змішаних розчинів різноманітних біологічно активних ароматичних речовин. Тому розробка узагальненої моделі гетероасоціації ароматичних молекул у водному розчині за даними ЯМР-спектроскопії має важливе наукове значення.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась в рамках держбюджетної наукової теми “Ліганд” Міністерства освіти і науки України (№ держ. реєстр. 0198U002871): “Молекулярні основи протекторної дії кофеіна та його метаболітів як комплексоутворювачів - інтерцепторів ароматичних біологічно активних речовин”, 1998-2000; за Міжнародним Грантом INTAS-97 31753: “Design, synthesis and testing of novel biologically-active molecules as potential drugs with sequence-specific binding to nucleic acids”, 1999-2002; за Договором про науково-технічне співробітництво СевДТУ з департаментом хімії Беркбек коледжу Лондонського університету (Великобританія), 1998-2003.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи є встановлення основних закономірностей процесів асоціації ароматичних молекул з різноманітними медико-біологічними властивостями у водно-сольовому розчині та з'ясування молекулярного механізму спільної дії біологічно активних ароматичних сполук на ДНК.

Для досягнення поставленої мети вирішувались задачі:

Розробка моделей молекулярної гетероасоціації, комплексоутворення і конкурентного зв'язування з ДНК.

Розробка методик визначення структурних і термодинамічних параметрів асоціації ароматичних молекул на основі даних ЯМР спектроскопії.

Вивчення закономірностей само- и гетероасоціації ароматичних молекул з різноманітними медико-біологічними властивостями. Аналіз характеру фізико-хімічних взаємодій, відповідальних за процеси асоціації молекул у водно-сольовому розчині.

Об'єкт дослідження - ароматичні молекули акридинових (профлавін і акридиновий оранжевий) і фенантридінових (бромістий етідій і йодистий пропидій) барвників, антрацикліновий антибіотик дауноміцин і фрагмент ДНК - дезокситетрануклеотид 5'-d (TpGpCpA).

Предмет дослідження - молекулярні механізми гетероасоціації ароматичних біологічно активних молекул, їх комплексоутворення і конкурентного зв'язування з ДНК у водному розчині.

Методи дослідження: одномірна (аналіз концентраційних і температурних залежностей протонних хімічних зсувів) і двомірна (2М-TOCSY, 2М-ROESY) гомоядерна ¹H-ЯМР спектроскопія (500 МГц) - для отримання структурних і термодинамічних параметрів комплексоутворення молекул, побудови структур комплексів ароматичних молекул, аналізу динамічної рівноваги молекулярних асоціатів у розчині; спектрофотометрія - для визначення концентрації молекулярних компонент у водному розчині.

Наукова новизна одержаних результатів. Розроблено узагальнену модель некооперативної молекулярної гетероасоціації, що дозволяє максимально повно описувати процеси асоціації ароматичних молекул у водному розчині за даними ЯМР-спектроскопії. Запропоновано методики визначення структурних і термодинамічних параметрів реакцій гетероасоціації ароматичних біологічно активних речовин. Вперше засобами 1М- і 2М-ЯМР спектроскопії проведено комплексне дослідження самоасоціації антипухлинного антибіотика новатрона, гетероасоціації антибіотика дауноміцина з акридиновими (профлавін і акридиновий оранжевий) і фенантридіновими (бромістий етідій і йодистий пропидій) барвниками. Визначено просторову структуру 1:1 димера новатрона, 1:1 структури гетерокомплексів дауноміцина з мутагенами (барвниками), термодинамічні параметри асоціації молекул і проведено їхній порівняльний аналіз. Вперше показано, що при певних умовах 1:1 гетерокомплекс ароматичних молекул дауноміцина і барвників може бути додатково стабілізований міжмолекулярним водневим зв'язком. Сформульовано основні закономірності процесів асоціації ароматичних молекул у водному розчині. Виявлено молекулярні механізми, відповідальні за ефективність зв'язування інтеркалюючого ліганда з ДНК у присутності іншої ароматичної сполуки: гетероасоціація і конкуренція за місця посадки на олігонуклеотидній послідовності.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати і висновки роботи можуть бути використані в області біотехнології (розробка речовин з заданими медико-біологічними властивостями), для оцінки ефективності лікарських препаратів при їх комбінованому використанні, при розробці принципів дієти в процесі хіміотерапії, захисту організму від дії канцерогенних і мутагенних речовин та іншіх застосуваннях, пов'язаних з необхідністю врахування спільної дії біологічно активних ароматичних речовин.

Особистий внесок здобувача: в опублікованих з співавторами наукових роботах особистий внесок здобувача полягає: в роботах [1,10,11,13] - участь в розробці базової моделі гетероасоціації і в проведенні розрахунків, аналізі літературних даних, обробці експериментальних даних; в роботах [2,3,12,14] - розробка узагальненої модели гетероасоціації, участь у виборі і реалізації аналітичних і чисельних методів, проведення чисельного експерименту, обговорення результатів, участь у написанні наукових статей; в роботах [4-8] - проведення чисельного експерименту, участь у розшифровці і віднесенні сигналів протонів у двомірних спектрах розчинів досліджуваних молекул, обговорення результатів, участь у написанні наукових статей; в роботі [9] - участь у постановці задачі, аналіз літературних данних;

Апробація результатів дисертації. Основні результати досліджень по темі дисертації були представлені та обговорені на: 14-й Міжнародній школі-семінарі “Спектроскопія молекул і кристалів” (Одеса, 1999); Міжнародній конференції “Теоретична фізика і біологія. ТФБ-99” (Київ, 1999); 15-й Європейській конференції по експериментальній ЯМР-спектроскопії “EENC 2000” (Лейпциг, Німеччина, 2000); 2-му Міжнародньому Смакуловім симпозіумі (Тернопіль, 2000); 15-й Міжнародній школі-семінарі “Спектроскопія молекул і кристалів” (Чернігів, 2001); 15-й Міжнародній конференції по ЯМР-спектроскопії (Дарем, Великобританія, 2001).

Публікації. По матеріалам дисертації опубліковано 14 робіт, в тому числі 8 статей в наукових журналах і 6 тез доповідей на міжнародних конференціях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, чотирьох розділів, висновків і додатків. Повний обсяг дисертації складає 186 с., з них 3 додатки займають 31 с., список використаних літературних джерел - 189 найменувань - 12 с. Дисертація містить 38 рис. і 8 табл., в тому числі на 16 окремих сторінках.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обгрунтовано актуальність теми, сформульовано мету і задачі дослідження, вказана новизна отриманих результатів, наведено основні положення роботи.

Розділ 1 присвячено огляду літератури по темі роботи. Обгрунтовано фізико-хімічну і медико-біологічну значимість досліджень асоціації біологічно активних речовин у водному розчині. Коротко розглянуто основні параметри вторинної структури ДНК. Проаналізовано існуючі на сьогодняшний день роботи в області само- і гетероасоціації ароматичних сполучень і їх комплексоутворення з ДНК. Як приклад взято типові інтеркалятори - акридинові (профлавін (PF) і акридиновий оранжевий (AO)) і фенантридінові барвники (бромістий етідій (EB) і йодистий пропидій (PI)), а також антипухлинні антибіотики, широко використовуємі в кліничній практиці (дауноміцин (DAU) і новатрон (NOV)), що розрізняються за структурною організацією хромофорів і бокових ланцюгів.

Розглянуто фізичні основи процесів асоціації ароматичних молекул у водному розчині і різні математичні моделі молекулярної само- і гетероасоціації за даними ЯМР спектроскопії. Особливу увагу приділено моделюванню процесів гетероасоціації, зроблено висновок про необхідність побудови коректної математичної моделі гетероасоціації для аналізу засобом ЯМР взаємодії у водному розчині ароматичних речовин з різноманітними медико-біологічними властивостями.

В розділі 2 розглянуто фізичні основи спектроскопії ядерного магнітного резонансу. Приділено особливу увагу деяким особливостям проведення ЯМР експерименту в умовах водного розчинника. Описано методики двомірної гомоядерної спектроскопії, які виявляють кореляцію хімічних зсувів через хімічні зв'язки (2М-COSY та 2M-TOCSY) і через простір (2M-NOESY та 2M-ROESY). Обгрунтовано необхідність застосування в нинішній роботі 2M-ROESY експерименту, що дозволить ефективно виділяти міжпротонні взаємодії для молекул відносно невеликих молекулярних мас. Описано засіб приготування експериментальних зразків і умови проведення експериментів.

Зразки барвників PF, AO і EB, PI і антибіотиків DAU, NOV розчиняли в D₂O з ізотопною чистотою 99.95% D, ліофілізували і після цього розчиняли у дейтерірованому 0.1М а-фосфатному буфері (pD=7.1). Концентрацію ароматичних сполук визначали спектрофотометрично, використовуючи наступні коефіціенти екстинкції: =41000 М^-1см^-1 (=444 нм) для PF; =56000 М^-1см^-1 (=492 нм) для AO; =5860 М^-1см^-1 (=480 нм) для EB; =5900 М^-1см^-1 (=493 нм) для PI; =11500 М^-1см^-1 (=477 нм) для DAU і =8360 М^-1см^-1 (=682 нм) для NOV. 1М- і 2М-¹Н ЯМР-спектри отримано на спектрометрі “Bruker DRX” з резонансною частотою 500 МГц. Досліджуємі зразки заздалегідь дегазували. Концентраційні виміри протонних хімічних зсувів проводили при двох температурах при фіксованій концентрації одного з ароматичних сполучень. Температурні залежності хімічних зсувів ароматичних протонів вимірювали при постійному складі розчину. Стабілізацію температури в процесі вимірів здійснювали BVT-терморегулятором. Хімічні зсуви визначали відносно ДСС, в якості внутрішнього стандарту використали бромід тетраметиламонію (ТМА).

В розділі 3 розроблено теоретичні моделі гетероасоціації і комплексоутворення ароматичних молекул з ДНК, виконано тестування і порівняльний аналіз моделей, наведено результати експериментальних досліджень самоасоціації антибіотика NOV і гетероасоціації акридинових (PF і AO) і фенантридінових (EB і PI) барвників з антибіотиком дауноміцином.

Для аналізу експериментальних даних ЯМР спектроскопії розроблено загальний алгоритм проведення обчислювального експерименту для дослідження процесів взаємодії ароматичних молекул у водному розчині (асоціація і комплексоутворення з ДНК), вхідними даними якого є експериментальні концентраційні і температурні залежності протонних хімічних зсувів, а вихідними - граничні хімічні зсуви протонів в мономері або в комплексі, рівноважні константи асоціації або комплексоутворення і термодинамічні параметри - ентальпія і ентропія. На підставі описаного алгоритму отримано структурні і термодинамічні параметри самоасоціації новатрона і побудована просторова структура димера молекул антибіотика (рис. 1).

Аналіз параметрів самоасоціації NOV дозволив зробити наступні висновки:

Застосування димерних моделей при аналізі молекулярних систем, що виявляють високий ступінь спорідненості один до одного у розчині, може дати відчутну помилку в визначенні параметрів реакцій самоасоціації.

Агрегація антибіотика новатрона носить некооперативний характер ( = 0.980.04), що пов'язано з впливом досить масивних бокових ланцюгів молекули.

Значення рівноважної константи самоасоціації NOV (K=273008500 л/моль, T=298K) суттєво вище констант самоасоціації досліджуваних нами раніше ароматичних молекул барвників і антибіотиків в аналогічних експериментальних умовах. Високий ступінь агрегації NOV, зокрема, проявляється в наявності в спектрі 2М-ROESY міжмолекулярного крос-піку, що свідчить про инверсну “хвіст до голови” орієнтації хромофорів молекул в димірному комплексі (рис. 1).

Спостерігається досить високе за абсолютною величиною значення ентальпії реакції самоасоціації антибіотика (H = -(31.12.4) кДж/моль), що має очевидну кореляцію зі значенням рівноважної константи агрегації NOV. Відносно невисоке значення ентропії (S=-(185) Дж/мольK), певно, зумовлене гідрофобними взаємодіями, які дають позитивний внесок в S і пов'язаних з наявністю у хромофора антибіотика масивних бокових ланцюгів.

Аналіз структури хромофора і бокових ланцюгів NOV дозволяє зробити висновок, що в димері таких молекул при антипаралельній орієнтації хромофорів існують стерічні умови для утворення міжмолекулярних водневих зв'язків між аміногрупами NH5/NH8 бічних ланцюгів і гідроксильними групами OH1/OH4 NOV.

В фізичній моделі молекулярної гетероасоціації двох речовин X і Y припускається існування динамічної рівноваги у розчині, включаючого реакції нескінченномірної некооперативної самоасоціації і гетероасоціації різноманітних типів комплексів. Вважається, що основний внесок в рівноважний зміст агрегатів дадуть наступні типи комплексів: самоасоціати X_i і Y_j, гетероасоціати з одним гетеростиком X_iY_j, гетероасоціати з двома гетеростиками X_iY_jX_k і Y_jX_iY_l, де i, k і j, l, відповідно, кількість мономерів в агрегатах речовин X і Y:

.(1)

Рівноважні константи реакцій самоасоціації К_X і К_Y, і гетероасоціації К_C вважаються незалежними від числа молекул в агрегатах і комплексах.

Рівноважні концентрації утворюючихся комплексів визначаються на підставі закону діючих мас. Рівняння закону збереження маси для речовини X приймає вигляд:

,(2)

де x₀, x₁ і y₀, y₁ - вхідні і мономерні концентрації речовин X і Y, відповідно.

Аналіз хімічного зсува засновано на припущенні існування у розчині швидкого обміну між асоційованими формами в масштабі часу ЯМР, що дозволяє розглядати експериментально спостерігаємий хімічний зсув як зважену суму хімічних зсувів ядер, відповідних агрегатам в різноманітних реакціях асоціації. В розглядуваній фізичній моделі кожна молекула може знаходитися в складі різних асоціатов і комплексів (1) і мати наступні значення хімічних зсувів: _m - в мономері; _d - в димері; _i - всередині агрегату; _C - в гетерокомплексі:

,(3)

де f_m, f_d, f_i, f_С - мольні частки відповідних типів хімічних зсувів.

Вклад в екранування протонів кожної молекули в самоасоціаті з боку інших молекул вважається однаковим. З урахуванням (1) і (3) аналітичний вираз для протонного хімічного зсува записується у вигляді:

.(4)

Вирази (2) і (4) складають основу базової аналітичної моделі гетероасоціації ароматичних молекул. Для отримання аналогічних рівнянь для речовини Y необхідно в (2) і (4) замінити індекси x на y і навпаки. Останнє випливає з симетрії схеми реакцій (1) відносно речовин X і Y.

Вирази (2) і (4) базової моделі недостатньо строго враховують специфічний ефект, що виникає при нескінченному складанні комплексів з двома гетеростиками: X_iY_jX_k і Y_jX_iY_l. Більш коректний вираз для закону збереження маси (2) отримано в узагальненій моделі гетероасоціації в матричном вигляді:

,(5)

де [K₀] - 1x4 матриця коефіцієнтів;

[C] - 4x1 матриця концентрації типів комплексів.

Моделювання експериментально спостерігаємого хімічного зсуву (див вираз (3)) в базовій моделі не враховує крайових ефектів, тобто залежності хімічного зсува від положення молекули в агрегаті: усередині, зкраю або у гетеростику. Зокрема це виявляється в тому, що вирази (4) не переходять в граничному випадку при K_C=0 до моделі самоасоціації молекул. Ігнорування крайових ефектів, особливо в випадках порівняно високих констант гетероасоціації, може призвести до відчутних помилок при обчисленні параметрів комплексоутворення молекул. Для того щоб врахувати вплив положення молекули в агрегаті на хімічний зсув протонів, були розглянуті всі можливі види її найближчого оточення, тобто якого типу контакти (стики) утворить молекула з сусідами. В результаті узагальнена модель призводить до більш коректного виразу для сумарного протонного хімічного зсува:

,(6)

де [_X]=[_mX,_dX,_CX] - матриця незалежних типів хімічних зсувів речовини X;

[K₁], [K₂] - 3x4 і 4x1 матриці коефіціентів.

Обчислення добутку матриць в (6) в різноманітній послідовності дозволяє отримати різні форми аналітичного подання виразів для хімічного зсуву _X. Поклавши K_C=0, рівняння (5) і (6) переходять у відомі вирази для некооперативної моделі самоасоціації.

Порівняльна характеристика моделей гетероасоціації була проведена на прикладі гетероасоціації ароматичних молекул барвників - профлавіна і бромістого етідія. З використанням загального алгоритму проведення обчислювального експерименту по базовій і узагальненій моделям отримано параметри гетероасоціації цих молекул (табл. 1).

Таблиця 1

Розрахункові параметри гетероасоціації PF+EB по різноманітним моделям (0.1М фосфатний буфер, pD=7.1, T=298K)

Аналіз табл.1 дозволяє зробити висновок про несуттєву (менш 30%) відмінність параметрів гетероасоціації, отриманих по базовій і узагальненій моделям. Слід очікувати більшої розбіжності результатів при збільшенні константи K_C або при збільшенні екранування протонів в гетерокомплексі _C = _m - _C і, навпаки, тенденції до збігу результатів, отриманих за різними моделями, при зниженні вкладу гетерокомплексів в сумарну динамічну рівновагу. В зв'язку з цим критерій придатності базової моделі може бути наведений в формі набору умов: K_C<K_X , K_Y ; _C>_d.

Встановлено, що при переході до узагальненої схеми аналізу значення _C (див. табл.1) зазнають зміни в одному напрямі для кожного протона PF, що фактично може бути інтерпретовано, як зміна відстані між хромофорами в гетерокомплексі.

Теоретичний аналіз процесу зв'язування ароматичного ліганда з фрагментом ДНК виконано на підставі базового підходу, основаного на засобі послідовного ускладнення моделі шляхом вступу нових реакцій взаємодії інтеркалятора з ДНК. При цьому, коли рівноважна константа самоасоціації ароматичного ліганда невелика, робилося припущення про визначальну роль двокомпонентних взаємодій в розчині, тобто при самоасоціації олігонуклеотида і ліганда враховувалося, відповідно, лише утворення дуплекса і димера. В даній роботі для сильно агрегуючого антибіотика новатрона запропонована більш загальна схема комплексоутворення ароматичної молекули з ДНК, включаюча реакції нескінченомірної некооперативної самоасоціації ліганда. Такий підхід дозволяє істотно поширити робочий діапазон концентрацій і зняти обмеження на рівноважну константу самоасоціації інтеркалятора.

З метою виявлення основних фізико-хімічних закономірностей процесу гетероасоціації ароматичних молекул у водному розчині методом ЯМР-спектроскопії проведено дослідження гетероасоціації молекул ароматичних лігандів, володічих різноманітними медико-біологічними властивостями: гетероасоціація антрациклінового антибіотика дауноміцина з мутагенами - акридиновими (профлавін і акридиновий оранжевий) і фенантридіновими (бромістий етідій і йодистий пропидій) барвниками. Аналіз експериментальних даних виконано на підставі концентраційних і температурних залежностей протонних хімічних зсувів взаємодіючих молекул, з використанням базової аналітичної моделі гетероасоціації. Розрахункові параметри реакцій гетероасоціації наведено в табл.2. На підставі розрахованих значень індукованих хімічних зсувів, а також спостерігаємих в спектрах 2М-ROESY міжмолекулярних крос-піків, побудовано найбільш імовірні структури 1:1 гетерокомплексів барвників з антибіотиком у водному розчині (рис.2).

Порівняльний аналіз параметрів реакцій гетероасоціації барвників з дауноміцином з відповідними параметрами самоасоціації взаємодіючих молекул (див. табл.2), а також з досліджуваними раніше в нашій лабораторії і іншими авторами молекулярними системами, дозволив зробити наступні висновки:

В змішаному розчині має місце складна динамічна рівновага різноманітних асоційованих форм взаємодіючих молекул барвників і антибіотика, розподіл яких залежить від концентрації і температури.

Гетерокомплекси досліджуваних молекулярних систем стабілизовані здебільшого дисперсійними взаємодіями хромофорів молекул, а також гідрофобними взаємодіями з розчинником. Найбільш істотний вклад гідрофобних взаємодій виявляється в системі AO+DAU, що зумовлено наявністю масивних діметильних груп у хромофора AO.

Системи PF+DAU, EB+DAU і PI+DAU характеризуються більшими за абсолютною величиною значеннями константи гетероасоціації і високими значеннями термодинамічних параметрів у порівнянні з характеристиками самоасоціації цих молекул. Останнє дає підставу припустити наявність додаткового стабілізуючого фактора в гетерокомплексі ароматичних молекул, не зв'язаного із стекинг-взаємодією хромофорів. Можна припустити, що таким фактором є міжмолекулярний водневий зв'язок, утворюючийся між однією з аміногруп акридинового або фенантридінового хромофора і 9-MeCO групою DAU. Справді, додаткова стабілізація гетерокомплекса H-зв'язком повинна призвести до зростання константи і негативного внеска в ентальпію і ентропію реакції гетероасоціації, що фактично і спостерігається по даним в табл. 2. Для системи PF+DAU побічне підтвердження цьому слідує з спостерігаємих міжмолекулярних крос-піків ROE, що дозволять зробити висновок про взаємне розташування хромофорів молекул PF і DAU в гетерокомплексі, в якому створено стеричні умови для утворення H-зв'язку між 3,6-аміногрупою барвника і 9-MeCO групою DAU (рис.2а). Заміна аміногруп акридинового хромофора на диметильні групи у акридинового оранжевого (не здатні до утворення H-зв'язку) призводить до проміжного значення K_C і відносно низьким значенням термодинамічних параметрів (див. табл.2 і рис.2б). Аналогічні ознаки H-зв'язку, а саме, наявність донорно- акцепторних груп та їх стерична близькість в 1:1 комплексі молекул, підвищені значення параметрів реакції асоціації, мали місце і при дослідженні гетероасоціації EB+DAU і PI+DAU (табл.2). Це дозволяє припустити, що описані умови є загальними не тільки для встановлення, але і прогнозування факту стабілізації 1:1 гетерокомплекса ароматичних молекул у водному розчині водневим зв'язком.

Таблиця 2

Параметри самоасоціації акридинових і фенантридінових барвників: рівноважна константа (K_X, л/моль), ентальпія (H_X, кДж/моль) і ентропія (S_X, Дж/мольК) і гетероасоціації з дауноміцином: рівноважна константа (K_C, л/моль), ентальпія (H_het, кДж/моль) і ентропія (S_het, Дж/мольК) в 0.1М фосфатному буфері, pD=7.1, T=303K

Примітка. Параметри самоасоціації DAU в аналогічних експериментальних умовах: K_Y = 580110 л/моль, H_Y = -(34.0 ± 6.0) кДж/моль, S_Y = -(60 ± 15) Дж/мольК

Розділ 4 присвячено дослідженню спільного зв'язування мутагенів - профлавіна, бромістого етідія і йодистого пропидія і антибіотика дауноміцина з дезокситетрануклеотидом 5'-d(TpGpCpA). В розрахунковій схемі поряд з реакціями само- і гетероасоціації молекул PF, EB, PI, DAU і їх комплексоутворення з дезокситетрануклеотидом були враховані також реакції утворення гетерокомплексів барвників і DAU з мономером і дуплексом тетрануклеотида:

,(7)

де N, N₂ - мономерна та дуплексна форма тетрануклеотида.

Встановлено, що ступінь інтеркаляційного зв'язування молекул антибіотика і барвника з ДНК визначається двома процесами: конкуренція між DAU і барвником за місця посадки на олігонуклеотид і утворення гетерокомплексів DAU-барвник у розчині. Відносний вклад того або іншого процесу залежить не тільки від рівноважних констант гетероасоціації DAU/барвник і комплексоутворення лігандів з ДНК, але і від відношення концентрації олігонуклеотида і барвника.

Найбільш яскраво вплив гетероасоціації на параметри зв'язування антибіотика з ДНК виявляється в системі EB-DAU-ДНК. При зміні відносного змісту олігонуклеотида (r_N) (рис.3) в області r_N<1 має місце максимум відносного зниження комплексів DAU з дуплексом d(TGCA) (F_d), що є результатом конкуренції процесів гетероасоціації DAU з EB і комплексоутворення DAU з d(TGCA). Зважаючи на малість константи гетероасоціації K_C системи PI+DAU у порівнянні з K_C системи EB+DAU (див. табл.2) і водночас значно більшої, ніж у молекули EB, спорідненості PI до дуплексу ДНК, аналогічний максимум на кривій F_d для пропидія не спостерігається (рис.3). Вклад гетерокомплексів в зменшення зв'язування DAU з d(TGCA) істотно залежить від величини r_N і характеру бокових ланцюгів барвника. Концентрація гетерокомплексів барвник-DAU (F_H) як функція відносної концентрації барвника (r_X) (рис.4) в системі EB-DAU-ДНК значно вища, ніж в системі PI-DAU-ДНК. При r_N=1 F_H домінує (F_H>1) при r_X>2 в системі EB-DAU-ДНК і при r_X>3 в системі PI-DAU-ДНК.

Запропонований метод аналізу динамічної рівноваги, включаючої богатокомпонентні взаємодії біологічно активних речовин, дозволяє визначити оптимальну концентрацію антибіотик/мутаген для заданого ступеня зменшення зв'язування ліганда з ДНК.

ВИСНОВКИ

Розроблено статистико-термодинамічні моделі молекулярної гетероасоціації біологічно активних ароматичних сполук, в яких відсутні обмеження на розміри агрегатів і рівноважні константи самоасоціації, що дозволяє проводити коректний аналіз процесів гетероасоціації молекул засобом ЯМР.

Вперше запропоновано методику термодинамічного аналізу реакцій гетероасоціації ароматичних молекул у водному розчині засобом ЯМР.

Розроблено загальний алгоритм проведення обчислювального експерименту при аналізі взаємодії біологічно активних молекул у водному розчині засобом ЯМР, який може бути застосований для вивчення процесів самоасоціації, гетероасоціації і комплексоутворення з ДНК.

Проведено порівняльний аналіз запропонованих моделей гетероасоціації молекул на прикладі гетероасоціації акридинового барвника профлавіна і фенантридінового барвника бромістого етідія у водному розчині. Встановлено межі придатності моделей асоціації молекул.

Вивчено самоасоціацію антибіотика новатрона у водно-сольовому розчині засобами одномірної і двомірної ¹Н ЯМР спектроскопії (500 МГц). Визначена рівноважна константа самоасоціації молекул новатрона у водному розчині, K=273008500 л/моль при Т=298К, параметр кооперативности = 0.980.04 і значення термодинамічних параметрів агрегації антибіотика: H = (31.12.4) кДж/моль, S = (185) Дж/(мольК). Вперше побудовано найбільш імовірну структуру димера 1:1 комплексу молекул NOV у водному розчині, яка знаходиться у добрій згоді з експериментальними даними.

Встановлено, що 1:1 димер молекул новатрона наряду зі стекинг-взаємодією хромофорів додатково стабілізован H-зв'язками між аміногрупами NH5/NH8 бічних ланцюгів і гидроксильними групами OH1/OH4 хромофора NOV.

Вперше вивчено гетероасоціацію типових мутагенів-акридинових (профлавін і акридиновий оранжевий) і фенантридінових (бромістий етідій і йодистий пропидій) барвників з антрацикліновим антибіотиком дауноміцином у водному розчині. Отримано чисельні значення рівноважних констант, граничних хімічних зсувів і термодинамічних параметрів гетероасоціації означених молекул. Для всіх вивчених систем побудовано найбільш імовірні просторові структури 1:1 гетерокомплексів у водному розчині.

Показано принципову можливість додаткової стабілізації 1:1 гетерокомплекса ароматичних молекул у водному розчині міжмолекулярним водневим зв'язком. Встановлено, що в 1:1 гетерокомплексах PF-DAU, EB-DAU і PI-DAU утворюється водневий зв'язок між аміногрупами хромофора барвника і 9-MeCO групою DAU.

Сформульовано закономірності процесів само- і гетероасоціації ароматичних молекул, які пов'язані з кількісними характеристиками рівноважних констант, граничних хімічних зсувів молекул в асоціатах і характером фізичних взаємодій при утворенні молекулярних комплексів. Запропоновано методику якісної інтерпретації процесів гетероасоціації ароматичних біологічно активних молекул на основі порівняльного аналізу термодинамічних параметрів реакцій асоціації взаємодіючих молекул.

Проведено якісний і кількісний аналіз зв'язування мутагенів - профлавіна, бромістого етидія і йодистого пропидія - та антибіотика дауноміцина з дезокситетрануклеотидом d(TpGpCpA) у змішаному розчині. Запропоновано молекулярний механізм спільної дії біологічно активних ароматичних сполук на ДНК, що визначається двома процесами: гетероасоціацією інтеркалюючих лігандів і конкуренцією лігандів за місця посадки на олігонуклеотидній послідовності.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Davies D.B., Veselkov D.A., Kodintsev V.V., Evstigneev M.P., Veselkov A.N. ¹H NMR investigation of the hetero-association of aromatic molecules in aqueous solution: factors involved in the stabilization of complexes of daunomycin and acridine drugs // Molecular Phys. - 2000. - V.98, №23 - P.1961-1971.

Веселков Д.А., Евстигнеев М.П., Дэвис Д.Б., Веселков А.Н. Статистико-термодинамическая модель гетероассоциации ароматических молекул в водном растворе на основе данных ¹H-ЯМР-спектроскопии // Вісн. Харк. ун-ту. - 2000. - №488. Біофізичний вісн. Вип.6. - С.19-25.

Veselkov A.N., Evstigneev M.P., Veselkov D.A., Davies D.B. A generalized NMR-derived statistical-thermodynamical model of hetero-association of aromatic molecules in aqueous solution // J.Chem.Phys. - 2001. - V.115, №5. - P.2252-2266.

Veselkov A.N., Evstigneev M.P., Veselkov D.A., Djimant L.N., Davies D.B. Hetero-association of aromatic drug and mutagen molecules and their competitive binding with a DNA oligomer // Вісн. Харк. ун-ту. - 2001. - №525. Біофізичний вісн. Вип.1. - С.18-26.

Davies D.B., Veselkov D.A., Evstigneev M.P., Veselkov A.N. Self-association of the antitumour agent novatrone (mitoxantrone) and its hetero-association with caffeine // J. Chem. Soc. Perkin Trans. 2. - 2001. - P.61-67.

Веселков Д.А., Евстигнеев М.П., Дымант Л.Н., Дэвис Д.Б., Веселков А.Н. Структурный и термодинамический анализ самоассоциации антибиотика митоксантрона (новатрона) в водном растворе методом ¹H-ЯМР-спектроскопии // Хим.физика. - 2001. - Т.20, №4. - С.27-32.

Веселков Д.А., Евстигнеев М.П., Кодинцев В.В., Дымант Л.Н., Дэвис Д.Б., Веселков А.Н. Исследование гетероассоциации молекул дауномицина и бромистого этидия в водном растворе методом ¹H ЯМР-спектроскопии // Физ.химия. - 2001. - Т.75, №5. - С.879-884.

Евстигнеев М.П., Веселков Д.А., Дымант Л.Н., Дэвис Д.Б., Веселков А.Н. ¹H ЯМР анализ гетероассоциации кофеина с антибиотиком митоксантроном в водном растворе // Журн.структ.химии. - 2001. - Т.42, №5.- С.928-935.

Veselkov D.A., Kodintsev V.V., Djimant L.N., Evstigneev M.P., Davies D.B., Veselkov A.N. Influence of caffeine on the binding of antibiotics actinomycin D and daunomycin with DNA in aqueous solution // Proc. 14-th International School-seminar “Spectroscopy of molecules and crystals”. - Odessa (Ukraine). - 1999. - P.62.

Davies D.B., Veselkov D.A., Kodintsev V.V., Evstigneev M.P., Veselkov A.N. ¹H NMR study of hetero-association of aromatic molecules in aqueous solution: drug-mutagen complex formation // Proc. International conference “Theoretical physics and biology TPB-99”. - Kiev (Ukraine). - 1999. - P.38

Veselkov D.A., Kodintsev V.V., Evstigneev M.P., Sigaev V.A., Vysotsky S.A., Davies D.B., Veselkov A.N. NMR analysis of the hetero-association of aromatic molecules in aqueous solution: formation of drug-mutagen complexes // Book of abstracts. 15-th European experimental NMR conference (EENC 2000). - Leipzig (Germany). - 2000. - P.106.

Evstigneev M.P., Veselkov D.A., Kodintsev V.V., Veselkov A.N. A NMR-derived model of mixed association of aromatic molecules in aqueous solution // Proc. 2-nd International Smacula Symposium. - Ternopol (Ukraine). - 2000. - P.243-245.

Evstigneev M.P., Sigaev V.A., Veselkov D.A., Davies D.B., Veselkov A.N. NMR analysis of the hetero-association of aromatic molecules in aqueous solution: factors involved in the stabilization of complexes of daunomycin and mutagens // Proc. 15-th International School-seminar “Spectroscopy of molecules and crystals”. - Chernihiv (Ukraine). - 2001. - P.144.

Veselkov A.N., Evstigneev M.P., Veselkov D.A., Davies D.B. A general NMR analysis of hetero-association of aromatic molecules in aqueous solution // Book of abstracts. 15-th International NMR conference. - Durham(UK). - 2001. - P.8.18.

АНОТАЦІЇ

Євстигнєєв М.П. Фізичні механізми асоціації біологічно активних ароматичних молекул та їхнього конкурентного зв'язування з ДНК. - Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фізико-математичних наук за спеціальністю 03.00.02 - біофізика. - Харківський національний університет ім. В.Н.Каразіна, м. Харків, 2002.

З метою встановлення молекулярних механізмів спільного зв'язування біологично активних ароматичних лігандів з ДНК запропоновано методику аналізу богатокомпонентної рівноваги у розчині, включаючого процесі само- та гетероасоціації ароматичних молекул та їхнього комплексоутворення з ДНК. Розроблено моделі гетероасоціації ароматичних молекул і комплексоутворення з ДНК у водному розчині для інтерпретації даних ЯМР спектроскопії. Засобом одновимірної і двовимірної гомоядерної ¹H ЯМР спектроскопії (500 МГц) досліджено самоасоціацію антибіотика новатрона і гетероасоціацію акридинових (профлавін і акридиновий оранжевий) і фенантридінових (бромістий етідій і йодистий пропидій) барвників з антрацикліновим антибіотиком дауноміцином. Визначено рівноважні константи і термодинамічні параметри реакцій асоціації взаємодіючих молекул, побудовано просторові структури 1:1 комплексів. Сформульовано загальні закономірності процесів асоціації ароматичних молекул у змішаному розчині з ДНК.

Ключові слова: асоціація, статистико-термодинамічна модель, термодинамічні параметри, ЯМР-спектроскопія, новатрон, дауноміцин, ароматичні барвники, конкурентне зв'язування, ДНК.

Евстигнеев М.П. Физические механизмы ассоциации биологически активных ароматических молекул и их конкурентного связывания с ДНК. -Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук по специальности 03.00.02 - биофизика. - Харьковский национальный университет им. В.Н.Каразина, г.Харьков, 2002.

С целью установления молекулярных механизмов совместного связывания биологически активных ароматических лигандов с ДНК предложены методики анализа многокомпонентного равновесия в растворе, включающего процессы само- и гетероассоциации ароматических молекул и их комплексообразования с ДНК. Разработаны модели гетероассоциации ароматических молекул и их комплексообразования с ДНК в водном растворе для интерпретации данных ЯМР спектроскопии. Методом двумерной гомоядерной ¹H-ЯМР спектроскопии (500 МГц) исследованы самоассоциация антибиотика новатрона и гетероассоциация акридиновых (профлавин и акридиновый оранжевый) и фенантридиновых (бромистый этидий и йодистый пропидий) красителей с антрациклиновым антибиотиком дауномицином. Определены равновесные константы и термодинамические параметры реакций ассоциации взаимодействующих молекул, построены пространственные структуры 1:1 комплексов. Сформулированы общие закономерности процессов ассоциации ароматических молекул в растворе.

Ключевые слова: ассоциация, статистико-термодинамическая модель, термодинамические параметры, ЯМР-спектроскопия, новатрон, дауномицин, ароматические красители, конкурентное связывание, ДНК.

Evstigneev M.P. Physical mechanisms of association of biologically active aromatic molecules and their competitive binding with DNA. - Manuscript.

Thesis for a Candidate's degree of Physical and Mathematical Sciences in Biophysics - Speciality 03.00.02, V.N.Karazin Kharkov National University, Kharkov, 2002.

NMR spectroscopy has been used to elucidate the molecular basis of a competitive binding with DNA of aromatic molecules, having different medical biological properties - mutagens and antibiotics. In order to analyse a multicomponent equilibrium in solution different interactions between molecules, including self- and hetero-association of aromatic ligands and their complexation with DNA have been studied.

Homonuclear one-dimensional and two-dimensional (2D-TOCSY and 2D-ROESY) ¹H-NMR spectroscopy (500 MHz) has been used to investigate the self-association of antibiotic novatrone (NOV) and hetero-association of typical mutagens, acridine dyes (proflavine (PF) and acridine orange (AO)) and phenanthridine dyes (ethidium bromide (EB) and propidium iodide (PI)), with anthracycline antibiotic daunomycin (DAU) in aqueous solution.

Statistical-thermodynamical models of hetero-association of aromatic molecules have been developed for interpretation of NMR data, where there are no limitations on the magnitudes of the equilibrium self-association constants and concentrations of interacting molecules in aqueous solution. Comparison of the models has been made and limitations of their application have been formulated. On the basis of theoretical approaches a general algorithm of the calculation procedure using NMR data has been suggested. The method leads to determination of structures and thermodynamics of association of ligands in aqueous solution. Equilibrium constants and thermodynamical parameters (enthalpy and entropy) of the association reactions have been determined and the most favourable structures of 1:1 complexes have been calculated for all the systems studied.

It is concluded that 1:1 complexes of aromatic molecules in aqueous solution are stabilized by dispersive van der Waals, hydrophobic and H-bond interactions; the major role play dispersive interactions giving negative enthalpy-entropy change. Hydrophobic interactions have a substantial contribution in stabilization of NOV dimer and AO+DAU hetero-complex due to the existence of bulky side chains in the chromophores of NOV and AO molecules. Comparative analysis of the obtained association parameters shows relatively high magnitudes of equilibrium association constants and enthalpy/entropy change for NOV self-association and for hetero-association of mutagens (PF,EB,PI) with DAU. Taking into consideration intermolecular ROE cross-peaks and distances between donor and acceptor groups in 1:1 hetero-complexes of the interacting molecules, the obtained results are consistent with hydrogen bond formation between 3,6-aminogroups of PF and 9-MeCO group of DAU and also between EB/PI 3,8-aminogroups and 9-MeCO group of antibiotic.

Results of investigation of mutagen/antibiotic hetero-association were used for elucidation of the molecular mechanism of the binding of biologically active molecules with DNA in the mixed solution. An NMR derived model of complexation of aromatic ligands with DNA has been further developed to include no limitation on the self-association constants of the intercalating molecules. Analysis of the dynamic equilibrium of two aromatic ligands and DNA in aqueous solution, which includes the most probable interactions between molecules has been proposed. It has been found that the efficacy of intercalative binding of different aromatic molecules with DNA depends on both the hetero-association of the ligands (interceptor action) and the competitive binding of the ligands with DNA (protector action). Relative importance of each process is determined by the concentrations of the molecular components in solution and also by relation between the equilibrium constants of hetero-association of ligands and their complexation with DNA. Quantitative analysis has shown that complexation of PF and EB with oligonucleotide in the presence of DAU is highly affected by hetero-association of aromatic ligands (interceptor action) due to an extra stabilization of hetero-complexes in aqueous solution by formation of intermolecular H-bonds. It is concluded that such an analysis enables the optimum concentration of protector or interceptor molecules to be determined for any defined reduction in ligand binding to DNA.

Key words: association, statistical-thermodynamical model, thermodynamical parameters, NMR-spectroscopy, novatrone, daunomycin, aromatic dyes, competitive binding, DNA.

Размещено на Allbest.ru