Молекулярний механізм сиквенс - специфiчної взаємодії інтеркалюючих лiгандiв з дезоксиолiгонуклеотидами різної довжини і вторинної структури

Размещено на http://www.allbest.ru/

ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ім В. Н. КАРАЗІНА

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня доктора фiзико-математичних наук

03.00.02 - біофізика

МОЛЕКУЛЯРНИЙ МЕХАНІЗМ СИКВЕНС - СПЕЦИФIЧНОЇ ВЗАЄМОДІЇ ІНТЕРКАЛЮЮЧИХ ЛIГАНДIВ З ДЕЗОКСИОЛIГОНУКЛЕОТИДАМИ РІЗНОЇ ДОВЖИНИ І ВТОРИННОЇ СТРУКТУРИ

БАРАНОВСЬКИЙ Сергій Федорович

Харків - 2002

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Проблема взаємодії нуклеінових кислот з біологічно активними ароматичними речовинами є однією з важливих у сучасній молекулярній біофізиці. Відомо, що зв'язування нуклеінових кислот (НК) з багатьма лікарськими препаратами, канцерогенними і мутагенними речовинами, а також з барвниками, характерною рисою яких є наявність плоских гетероциклічних хромофорів, приводить до зміни конформації полімерних молекул НК, характеру білково - нуклеінових взаємодій і, як наслідок, до порушення біологічних функцій генетичного матеріалу клітини. Лікарські препарати з даного класу хімічних сполук широко використовуються при лікуванні різноманітних пухлинних захворювань, зокрема, у хіміотерапії лейкозів, що збіль-шились після аварії на Чорнобильській атомній електростанції. Для з'ясовування молекулярного механізму дії ароматичних лігандів використовуються різноманітні теоретичні й експериментальні методи дослідження. Існуючі теорії взаємодії, особливо модель інтеркаляції, зробили суттєвий внесок у розуміння біологічних властивостей і характеру взаємодії органічних ароматичних сполук з молекулами нуклеінових кислот. Експериментально найбільш повну інформацію про структурні і термодинамічні параметри комплексоутворення лігандів з олігонуклеотидами в розчині можливо одержати за допомогою методів одно- и двомірної ЯМР спектроскопії, що і визначило вибір методів дослідження і розробку пов'язаних з ними методик разрахунку параметрів комплексоутворення молекул і структур молекулярних комплексів.

Конформаційна мінливість і складність побудови полімерних молекул нуклеінових кислот, велика різноманітність місць зв'язування в макромолекулах обмежують можливість детального аналізу іх комплексоутворення з низькомолекулярними ароматичними сполуками. Проте експеримент показує, що селективність іх зв'язування з лігандами виявляється вже на коротких нуклеотидних послідовностях. Отже, основні особливості молекулярного механізму дії біологічно активних речовин, енергетичні і структурні характеристики комплексів лігандів з ДНК і РНК можуть бути виявлені шляхом вивчення іх взаємодії з фрагментами нуклеінових кислот. Зокрема, висновок про селективність зв'язування того або іншого низькомолекулярного сполучення з ви-значеним сайтом нуклеотідної послідовності можна зробити на основі порівняльного аналізу величин рівноважних констант взаємодії лігандів з олігонуклеотидами різноманітних довжин, нуклеотідного складу і послідовості основ у ланцюгу. Такі експерименти стали можливими завдяки розвитку методик синтезу олігонуклеотидів із заданими характеристиками.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалася в повній відповідності з планом науково-дослідних робіт кафедри фізики і хімії Севастопольсього держав-ного технічного університету в рамках держбюджетних НДР: “Специфіка взаємодії лікарськіх речовин з ДНК. Встановлення природи фізико-хімічних факторів, відповідальних за ефективність зв'язування лікарських речовин, що мають різну біологічну активність, із заданими послідовностями ДНК” (“Комплекс”, “Комплекс - 2” 1997 - 1999 рр., Координаційний план №16 Міносвіти України) і “Молекулярні основи протекторної дії кофеіна та його метаболітів як комплексоутворювачів - інтерцепторів ароматичних біологічно - активних речовин” (“Ліганд”1998 - 2000 рр.), за програмою Міжнароднього наукового фонду (фонд Сороса) - гранти UD 7000, UD 7200 (1994 - 1996), а також за Договором про науково - технічне співробітництво СевДТУ з департаментом хімії Беркбек коледжу Лондонського університету (Великобританія) на спільні наукові дослідження (1993 - 1998 рр., 1998 - 2003 рр. “Specificity of drug-nucleic acid interactions ”) і за Міжнародним Грантом INTAS № 97 - 31753 (1999 - 2002 рр. “Design, synthesis and testing of novel biologically - active molecules as potential drugs with sequence - specific binding to nucleic acids”).

Мета і задачі дослідження. Метою дослідження було встановлення основних закономірностей інтеркаляційної взаємодії ароматичних лігандів з комплементарними і некомплементарними олігонуклеотидними послідовностями в водно-сольовому розчині; з'ясування впливу довжини нукле-отидного складу, вторинної структури нуклеотидної послідовності на процеси комплексоутворення ароматичних лігандів з дезоксиолігонуклеотидами і можливість перенесення отриманих характеристик на полімерну молекулу ДНК.

Для досягнення поставленої мети вирішувались задачі: розшифровки і віднесення сигналів протонів та ядер фосфору в одновимірних і двомірних спектрах розчинів досліджуємих молекул, виявлення в спектрах ядерного ефекту Оверхаузера характерних внутрішньо - і міжмолекулярних крос - піків для молекулярних комплексів у розчині та їх інтерпретація; вивчення закономірностей самоасоціації ароматичних лігандів, дезоксиолігонуклеотидів; аналізу вторинних структур олігонуклеотидів різної довжини і послідовності основ, визначення кількісних характеристик, необхідних для аналізу рівноваги у розчині барвник - олігонуклеотид; розробки методик визначення структурних і термодинамічних параметрів асоціації і комплексоутворення молекул на основі концентраційних і температурних залежностей протонних хімічних зсувів; вивчення комплексоутворення фенантридінового барвника бромистого етидію (EB) і антрациклінового антибіотика дауноміцину (DAU) з одно- і дволанцюговими дезоксиолігонуклеотидами різноманітного нуклеотидного складу і послідов-ності основ у ланцюзі, встановлення основних типів утворюючихся комплексів їх структур і термодинамічних характеристик; аналізу характеру фізико-хімічних взаємодій, відповідальних за селективність зв'язування аромати.

Об'єкт дослідження - дезоксиолігонуклеотиди різної довжини і вторинної структури і іх комплекси з біологічно активними ароматичними речовинами - бромистим етидієм і дауноміци-ном у водному розчині.

Предмет дослідження - одномірнї і двомірнї ЯМР спектри розчинів молекул, просторові структури молекулярних комплексів.

Методи дослідження - одномірна і двомірна ЯМР спектроскопія, спектрофотометрія, моделювання процесів комплекоутворення молекул в умовах багатокомпонентної рівноваги у розчині.

Наукова новизна одержаних результатів. Встановлено, що характеристики процесу самоасоціації лігандів істотньо залежать від структури їх хромофорів і характеру бічних ланцюгів і груп. Отримано кількісні дані, які показують, що термодинамичні параметри самоасоціації дезоксиолігонуклеотидів визначаються складом, послідовністю основ і довжиною нуклеотидного ланцюга; за термодинамічною стабільністю досліджені самокомплементарні дуплекси дезоксиолігонуклеотидів розташовуються в нас-тупному ряді: d(CGCGCG) 2 > d(GACATGTC)2 > d(CGTACG) 2 > d (TACGTA) 2 > d(CGCG) 2 > d (GCGC) 2 > d (TGCA) 2 > d (ACGT) 2 > d (AGCT) 2, а диміри несамокомплементарних дезокситетрануклеотидів у такій послідовності: d (CGAA) 2 ”d(AAGC) 2 > d (CTGA) 2 > d (GAAG) 2. Особливе місце в плані термодинамічної стабільності (Тm ” 760 С) займає несамокомплементарний дезоксиолігонуклеотид d(GCGAAGC), спроможний утворювати шпилькову структуру у водному розчині. Методом одномірної і двомірної гомо - і гетероядерної ЯМР-спектроскопії проведено комплексне і систематичне дослідження взаємодії у водному розчині типового інтеркалятора бромистого етидію і антрациклінового антибіотика дауноміцину з вказаними дезоксиолігонуклеотидами, що відрізняються нуклеотидним складом, послідовністю основ у ланцюзі та числом місць можливої посадки ліганду. Отримано і проаналізовано двомірні ЯМР спектри, що свідчать про місця переважної посадки ліганда при взаємодії з олігонуклеотидами. Виявлено особливості утворення комплексів при різноманітних співвідношеннях вхідних концентрацій взаємодіючих молекул і температурах розчину. Вста-новлено переважну взаємодію бромистого етидію з пірімідін-пуріновою (pyr-pur) послідовністю основ у самокомплементарному олігонуклеотидному дуплексі, а дауноміцину з триплетною нуклеотидною послідовністю, що містить дві сусідні CG-пари, фланковані AT-парою в гексамірі d(CGTACG)2. Показано, що при взаємодії лігандів з одно - і двоспіральними молекулами оліго-нуклеотидів характер зв'язування залежить як від нуклеотидного складу, так і від послідовності основ у ланцюзі. Антибіотик виявляє певну специфічність зв'язування з d(CpG)-сайтом в одно-ниткових послідовностях дезоксигексануклеотидів. На основі запропонованих моделей визна-чено структурні і термодинамічні характеристики самоасоциації молекул, а також реакцій компле-ксоутворення олігонуклеотид - ліганд. Розроблено методику розрахунку структур комплексів барвників з олігонуклеотидами за граничними значеннями протонних хімічних зсувів взаємоді-ючих молекул. Визначено просторові структури 1:1 і 1:2 комплексів бромистого етидію і дауноміцина з дезоксі- олігонуклеотидами, проведено порівняльний аналіз геометричних особли-востей комплексів молекул в розчині. На основі сумісного аналізу експериментальних концен-траційних і температурних залежностей хімічних зсувів лігандів розраховано внески різно-манітного типу реакцій у розчині в сумарні теплові і ентропійні ефекти.

Проведено порівняльний аналіз різноманітних типів молекулярних взаємодій у процесах комплексоутворення ароматичних лігандів з дезоксиолігонуклеотидами в розчині.

Практичне значення одержаних результатов. Отримані в роботі експериментальні і теоретичні результати поглиблюють існуючі уявлення про взаємодію біологічно активних низькомолекулярних речовин з фрагментами молекул нуклеінових кислот у різноманітних конформаційних станах. Клас речовин, що інтеркалюють, досить широкий і різноманітний за своїми медично - біологічними властивостями. Прикладом можуть бути протипухлинні антибіотики - інгібітори синтезу ДНК і РНК, акридинові барвники, що володіють канцерогенною і мутагенною активністю і фенантридиновий барвник бромистий етидій, що виявляє трипаноцидну дію. Розроблені в дисертації методики, алгоритми і програми аналізу концентраційних і температурних залежностей експериментальних параметрів ЯМР - спектроскопії дозволяють проаналізувати закономірності рівноваги “олігонуклеотид - ліганд” у розчині, знайти константи утворення різноманіт-ного вигляду комплексів, визначити структури молекулярних комплексів, диференціювати вклади різноманітних реакцій комплексоутворення в сумарні тепловій і ентропійний ефекти при взаємодії інтеркаляторів з олігонуклеотидами у розчині. Запропоновані методики розрахунку структурних і термодинамічних параметрів застосовано для аналізу сиквенс-специфічного зв'язування ароматичних лігандів з одноланцюговими і двохспіральними фрагментами нуклеінових кислот в умовах складної рівноваги у розчині. Отримані результати можуть бути використані при детальних дослідженнях поцесів молекулярного “впізнавання” у різноманітних фізико-хімічних і біологічних системах, установленні принципів виборчої взає-модії з генетичним матеріалом клітини, розробці лікарських препаратів.

Особистий внесок здобувача. В опублікованих із співавторами наукових роботах особистий внесок здобувача полягає:

у роботах [1,2,9] - в проведенні експерименту, аналізі літературних даних,обробці експериментальних даних;

у роботах [10,19,38] - в проведенні чисельного експерименту та обговоренні результатів;

у роботах [28,40,41] - в проведенні вимірювань та аналізі експериментальних даних ;

у роботах [3,4,5,37] - в проведенні аналізу літературних данних, постановці задачі теоретичного дослідження і написанні наукових статей;

у роботах [6-9,11,12,14,36] - в написанні наукових статей, виборі і реалізації аналітичних і чисельних методів, розробці методик визначення структурних і термодинамічних параметрів асоціації і комплексоутворення молекул на основі концентраційних і температурних залежностей протонних хімічних зсувів;

у роботах [13,16,35] - в постановці задачі, виборі і реалізації аналітичних і чисельних методів її розв'язання, розшифровці і віднесенні сигналів протонів в одномірних і двомірних спектрах розчинів досліджуваних молекул;

у роботах [15,17,18,22,27,29,39] - в побудові структур молекулярних комплексів у розчині, аналізі і інтерпретації отриманих результатів, написанні наукових статей, аналізі літературних даних;

у роботах [20,23,24,33] - в розвитку методу аналізу ЯМР - спектрів, проведенні теоретичних розрахунків, аналізі та інтерпретації отриманих результатів;

у роботах [31,32,34] - в постановці задачі експериментального дослідження, проведенні теоретичних розрахунків, обговоренні отриманих результатів, написанні наукових статей.

Апробація результатів дисертації. Основні результати роботи були представлені й обговорювалися на: семінарі хімічного товариства їм. Д. І. Менделєєва “Молекулярна фізика і біофізика водних систем”, Санкт-Петербург, 1992, 1993 рр.; семінарі департаменту фізики і хімії СевДТУ, Севастополь, 1992 - 2001рр.; III міжнародному конгресі по теоретичній органічній хімії, Тойохаши, Японія, 1993 р.; Міжнародній науковій конференції, присвяченої 150-річчю народження І. Пулюя, Тернопіль, 1995 р.; 35-м Санибел - симпозіумі, Флорида, США, 1995 р.; Міжнародній конференції по ЯМР-спектроскопії, Манчестер, Великобританія, 1995 р.; Європейській конференції з експериментальної ЯМР - спектроскопії (EENC-1996), Париж, Франція, 1996 р.; 12 біофізичному з'їзді, Амстердам, Голандія, 1996 р.; 13-ій міжнародній конференції з ЯМР спектроскопії, Ексетер, Великобританія, 1997 р.; 14-й європейській конференції по експериментальній ЯМР - спектроскопії (EENC-1998), Блед, Словенія, 1998 р.; II з'їзді Українського біофізичного товариства, Харків, 1998 р.; Міжнародній конференції по фізиці біологічних систем, Київ, 1998 р.; 14-й міжнародній конференції з ЯМР - спектроскопії, Едінбург, 1999 р.; 15-й європейській конференції з експериментальної ЯМР - спектроскопії (EENC-2000), Лейбциг, 2000 р.; 15-й міжнародній школі - семінарі “Спектроскопія молекул і кристалів”, Чернігів, 2001р. Тези перерахованих доповідей опубліковано.

Публікації. Результати дисертації опубліковані в 41 наукових працях, в тому числі у 31 статтях у наукових журналах та у 10 материалах і тезах доповідей національних і міжнародних конференцій, симпозіумів і з'їздів.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, 5 розділів, висновків і додатків. Повний обсяг дисертації складає 379 с., із яких додатки, оформлені окремою книгою, займають 101с. Дисертація містить 22 таблиці і 73 рисунка, в тому числі на 37 окремих сторінках. Список використаних літературних джерел - 358 найменувань.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обгрунтовується актуальність дослідження, викладено його мету і задачі, вказано на новизну отриманих результатів, та на їх наукову і практичну цінність.

В першому розділі, що має оглядовий характер, наведено експериментальні і теоретичні дані про структурні особливості молекул нуклеінових кислот та їх компонентів. Проаналізовано літературні дані про процеси самоасоціації нуклеотидних послідовностей і ароматичних молекул бар-вників та антибіотиків, комплексоутворення ароматичних лігандів з фрагментами молекул нуклеінових кислот, отримані засобами ЯМР - спектроскопії та іншими експериментальними засобами. Обговорено наявні в літературі дані про сиквенс - специфічне інтеркаляційне зв'язування ароматичних лігандів з ДНК. Зроблено висновок про те, що в розчині, що містить фрагменти ДНК і інтеркалятори, має місце динамічна рівновага, включаюча самоасоціацію молекул і утворення різноманітних типів комплексів з дезоксиолігонуклеотидами. Кількісний аналіз процесів комплексоутворення лігандів з олігонуклеотидними послідовностями припускає наявність інформації про параметри самоасоціації різноманітних форм молекул, що досліджуються і про структурні особливості агрегатів у водному розчині. Інтенсивність крос - піків в спекрах 2М - NOESY, зумовлена міжмолекулярними взаємодіями в інтеркальованих комплексах, досить низька. Це пов'язано з досить великою відстанню між протонами ароматичних лігандів і основами олігонуклеотидів, а також з тим, що вміст того або іншого типу комплексу, що знаходиться в рівновазі у змішаному розчині взаємодіючих молекул, відносно малий. При інтерпретації експериментальних даних ЯМР необхідно вирішувати проблему "конформаційної чистоти" в розчині: розробляти розрахункові методики і моделі комплексоутворення, які дозволили б оцінювати відносний вміст різноманітного типу асоціатів в розчині і на цій підставі робити висновки про характер взаємодії і структурні особливості комплексів.

Схематичне подання дослідницкої роботи по темі дисертації (мал. 1) включає:

а) дослідження самоасоціації і комплексоутворення несамокомплементарних дезокситетрануклео-тидів з ароматичними лігандами (мале коло). Послідовності основ тетрануклеотидів d(AAGC), d(GAAG), d(CGAA) входять в якості складових елементів в структуру некомплементарного дезоксигептануклеотида d(GpCpGpApApGpC), що містить паліндромну послідовність у ланцюзі, здатного утворювати шпилькову структуру в водному розчині (велике коло).

б) середнє коло діаграми відбиває дослідження самоасоциації і комплексоутворення самокомплементарних дезоксиолігонуклеотидів різної довжини і послідовності основ ланцюга з ароматичними лігандами, що дозволяють отримати інформацію про природу фізико-хімічних взаємодій, відповідальних за сиквенс-специфічне зв'язування лігандів і провести порівняльний аналіз структурних і термодинамічних параметрів комплексоут-ворення лігандів з дезоксиолігонуклеотидами різноманітної вторинної структури. В якості ароматичних лігандів використано типові інтеркалятори: фенантридіновий барвник бромистий етидій (EB), володіючий мутагенною дією, і антрацикліновий антибіотик дауноміцин (DAU) з виразною антипухлинною активністю.

В другому розділі розглянуто фізичні основи ЯМР- спектроскопії, методики отримання одномірних і двомірних спектрів. Наведено опис двомірної гомоядерної (2М-CОSY, 2М-NOESY, 2М-ТОCSY) і гетероядерної кореляційної спектроскопії (2М - НМВС), що дозволяє отримати інформацію про структурні параметри взаємодіючих молекул у водному розчині - дезоксиолігонуклеотидів і ароматичних лігандів. Показано доцільність використання двомірних методик в даній роботі. Описано умови проведення експериментів і приготування розчинів. Зразки дезоксиолігонук-леотидів d(CpGpCpG), d(GpCpGpC), d(TpGpCpA), d(ApCpGpT), d(ApGpCpT), d(CpGpApA), d(ApApGpC), d(CpTpGpA), d(GpApApG), d(CpGpCpGpCpG), d(CpGpTpApCpG), d(TpApCpGpTpA), d(GpCpGpApApGpC), d(GpApCpApTpGpTpC) синтезовано компанією "Oswel DNA Service" (Великобританія). Використали барвники і антибіотики фірм "Sigma" і "Flukа" (США). Досліджовані речовини розчиняли у D2O з ізотопною чистотою 99.95% і ліофілізували в дейтерирований 0.1 M фосфатний буфер (pD 7.1). Концентрацію молекул визначали спектрофото-метрично за відомими молярними коефіцієнтами екстинції. Одномірні 1Н ЯМР спектри вимірювали на імпульсних спектрометрах з резонансною частотою 500 МГЦ ("JEOL GSX 500", “Bruker DRX 500”), двомірні гомоядерні спектри (2М - СОSY, 2М - NОESY, 2М - TOСSY) - на спектрометрах “Bruker DRX” (500 МГц) і “Bruker AMX” (600 МГц), а гетероядерні 1H - 31P (2М-НМВС) на спектрометрі “Bruker DRX” (500 МГц). При вимірі двомірних спектрів ЯМР зразки заздалегідь дегазували, продуваючи їх азотом. В концентраційних дослідженнях підтримували постійну концентрацію барвника послідовним доданням свіжоприготовленого розчину ліганда певної концентрації в початкову суміш олігонуклеотида і барвника. В процесі вимірів температура зразка стабілізувалась з похибкою ± 1К з допомогою терморегулятора BVT-3000 або "JEOL NM- GVT 3". Протонні хімічні зсуви вимірювались відносно внутрішнього стандарту - ТМА, бо його сигнал практично незалежить від рD і температури у водних розчинах нуклеотидів і після цього перераховували відносно ДСС (2.2-ди-метіл-2-силапентан-5-сульфокислота). Хімічний зсув ядер 31P визначали відносно резонансного сигнала фосфору буферного розчину. Виміри проводилися в стандартних ампулах з зовнішнім діаметром 5 мм, мінімальний об'єм розчину - 0.5 мл.

В третьому розділі подано результати досліджень самоасоціації в водному розчині молекул бар-вників, антибіотиків і дезоксиолігонуклеотидів. Основні характеристики самоасоціації ароматич-них лігандів, отримані на основі кооперативної і некооперативної моделей взаємодій молекул, з використанням експериментальних концентраційних і температурних залежностей протонних хі-мічних зсувів молекул, суттєво залежать від хімічної структури хромофорів і характеру бокових ланцюгів і груп досліджених біологічно активних сполук. Отримані дані (табл.1) показують, що при утворенні асоціатів молекул профлавіна, хромофор якого не містить бокових груп або ланцюгів, s < 0.5, для бромистого етидію і иодистого пропидію наявність бокових привісків в хромофорах знижує кооперативність (s = 0.89 ± 0.06), в той час як для актиноміцина D, до хромофору якого приєднані масивні пентапептидні кільця, параметр s ” 1.5 і процес самоасоціації носить антикооперативний характер. Параметр кооперативності дауноміцина (s ” 1.34) в межах похибки співпадає з величиною s, розрахованою для ногаламіцина (s ”1.37) в аналогічних експериментальних умовах. Це дозволяє зробити припущення, що ногалозний сахар в молекулі ногаламіцина і аміносахар в дауноміцині, приєднані однаковим чином до агликонового хромофору, створюють стеричні перешкоди при утворенні стопочних асоціатів в розчині. Найменше значення ентальпії по абсолютній величині отримано для реакції самоасоціації ногаламіцина, яке у 1.5 -2 рази менше DH для реакцій самоасоціації дауноміцина, актиноміцина D, акридинового оранжевого і профлавіна. Це пов'язано з суттєво меншим в порівнянні з іншими лігандами перекриттям ароматичних кілець ногаламіцина в агрегаті з-за наявності зв'язування з хромофором антибіотика непланарного біциклічного позитивно зарядженого аміносахара, створюючого стеричні перешкоди для паралельної орієнтації хромофорів при утворенні стопочного асоціата. Що ж стосується зміни ентропії DS, то значення цього параметру розрізняються ще в більшому ступені, ніж DH. Можна припустити, що при самоасоціації бромистого етидію, акридинового оранжевого, актиноміцина D, дауноміцина, иодистого пропидію і ногаломіцина більш суттєву роль, в порівнянні з профлавіном, грають гідрофобні взаємодії, яки дають позитивний внесок в DS. Це пов'язано з наявністю у хромофорів цих молекул досить масивних гідрофобних атомних груп і бокових ланцюгів, які внаслідок просторової укладки при утворенні дімерних комплексів витісняють молекули розчинника на околиці агрегатів і завдяки цьому, збільшують ентропію самоасоціації молекул.

Параметри самоасоціації дезоксиолігонуклеотидів в водному розчині, розраховані в основному з використанням моделі двох станів “мономір - дуплекс” за експерименальними кон-центраційними і температурними залежностями протонних хімічних зсувів олігонуклеотидів. Ототожнення сигналів в спектрах ЯМР отримано на підставі аналізу двомірних гомоядерних CОSY, NOESY, ТОCSY і двомірних гетероядерних НМВС експериментів. Виявлені групи протонів атомів, що належать окремій основі або дезоксирибозному кільцю, проведено сиквенційне віднесення. По термодинамічній стабільності самокомплементарні дуплекси олігонуклеотидів розташо-вуються таким чином: d(CGCGCG) 2 > d(GACATGTC)2 > d(CGTACG) 2 > d(TACGTA) 2> d(CGCG)2 > d(GCGC)2 > d(TGCA)2 > d(ACGT)2 > d(AGCT)2; для несамокомплементарних дезокситетрануклеотидів стабільність димірних комплексів має вигляд: d(CGAA)2 ” d(AAGC)2 > d(CTGA)2 > d(GAAG)2. Міцність дуплексів залежить від нуклеотидного складу і числа пірімідін - пуринових дільниць в послідовності. Особливе положення по термічній стабільності серед вивчених дезоксиолігонуклеотидів займає дезоксигептануклеотид d(GCGAAGC), що містить паліндромну послідовність в ланцюзі і здатний утворювати шпилькову структуру у водному розчині. Гептамір d(GCGAAGC) утворює шпильку з короткою GAA - петлею, винятково тривку до дії температури (Тm=78є ? ). При цьому стебло шпильки гептаміра, складається з двох пар основ, приймає конформацію близьку В - формі.

В четвертому розділі викладено результати дослідження взаємодії барвника бромистого етидію з дезоксиолігонуклеотидами d(CpGpCpG), d(GpCpGpC), d(TpGpCpA), d(ApCpGpT), d(ApGpCpT), d(CpGpApA), d(ApApGpC), d(CpTpGpA), d(GpApApG), d(GpCpGpApApGpC), d(GpApCpApTpGpTpC) і методика розрахунку параметрів комплексоутворення цих молекул у водному розчині за експериментальними даними одномірної і двомірної ЯМР - спектроскопії. Аналіз 2M ЯМР - спектрів показав, що молекули барвника здебільшого інтеркалюють в пірімідін - пуринові сайти самокомплементарних олігонуклеотидних дуплексів і несамокомплементарних одноланцюгових фрагментів ДНК. Виявлено типи реакцій, яки адекватно відбивають процеси комплексоутворення барвника з дезоксиолігонуклеотидами різноманітної довжини і вторинної структури.

Для кількісної оцінки взаємодії молекул бромистого етидію з дезоксиолігонуклеотидами використовувались різні схеми утворення молекулярних комплексів, які враховують зв'язування з одні-єю (N) і двома (N2) нитками олігомерів ароматичного ліганда (D). Математичні моделі комплексоутворення молекул засновано на адитивній схемі для спостерігаємих протонних хімічних зсувів в розчині:

де - хімічні зсуви протонів ліганда в мономірі (D1), димірі (D2) і в складі комплексів з олігоміром;,, - мольні частки барвника в мономірі, димірі і в складі комплексів з однією і двома нитками дезоксиолігонуклеотидів відповідно; n - кількість молекулярних форм. При визначенні параметрів комплексоутворення молекул враховувалися закон збереження маси і закон діючих мас для молекулярних реакцій в розчині. Розрахунок параметрів моделей проводився шляхом мінімізації квадратичного функціонала - нев'язки експериментальних ( концентраційні і температурні залежності протонн их хімічних зсувівь ЕВ) і розрахункових залежностей хімічних зсувів протонів ліганда. Мольні частки барвника розраховувались за законом діючих мас, з урахуванням рівнянь матеріального балансу для ЕВ і дезоксиолігонуклеотидів. Розрахункові значення констант утворення комплексів ЕВ з олігомірами ДНК, дозволяючими зробити висновок про селективність зв'язування барвника з різними сайтами нуклеотидних послідовностей. Термодинамічні параметри визначено шляхом встановлення температурних залежностей мольних часток комплексів (рівноважних констант реакцій) виходячи з експериментальних температурних залежностей протонних хімічних зсувів досліджуємих молекул. Використали регресійні рівняння у формі многочленів другого і третього порядків для апроксімації експериментальних залежностей. Термодинамичні параметри DH, DS і DG комплексоутворення молекул визначено з використанням формалізму Вант - Гоффа. Аналіз показує, що вміст в розчині різноманітних типів комплексів “дезоксиолігонуклеотид - барвник” залежить від температури розчину, співвідношення вхідних концентрацій взаємодіючих молекул, послідовності основ і довжини ланцюга дезоксиолігонуклеотидів.

Аналіз динамічної рівноваги різних типів комплексів в розчині дозволяє встановити внесок кожного комплексу в експериментальний хімічний зсув і визначити в них значення граничних хімічних зсувів протонів, дозволяючих з'ясувати структурні особливості утворюємих молекулярних асоціатів. Значення термодинамичних параметрів комплексоутворення EB з вивченими дезоксиолігонуклеотидами свідчать, що всі реакції комплексоутворення ЕВ з дезоксиолігонуклеотидами є екзотермічними, але абсолютні значення ентальпій цих реакцій суттєво розрізняються. Утворення 1: 2 комплексів барвника з дуплексами дезокситетрануклеотидів характеризується близькими значеннями DH і DS, при цьому при зв'язуванні бромистого етидію з одноланцюговими тетрануклеотидами величини DH і D S значно більші за абсолютною величиною (на малюнку 2 трикутники (5) і квадрати (¦)). Для 1: 1 комплексів барвника з одинокою формою тетрануклеотидів розрахункові параметри DH і D S мають близькі значення як для само-, так і несамокомплементарних дезокситетрануклеотидів, виняток складає лише послідовність d(GAAG), яка містить тільки пуринові основи в ланцюзі (самий нижній квадрат (¦)). При утворенні 2 : 2 комплексів барвника з самокомплементарними дезокситетранук-леотидами абсолютні значення ентальпії і ентропії вищі, ніж DH і DS при зв'язуванні однієї молекули барвника з тетрануклеотид-ними дуплексами. В 2: 2 комплексах, імовірно, деякий вклад в негативне значення DS вноситься збільшенням жорсткості дуплекса внаслідок інтеркаляції молекул барвника, що призводить до зменшення ентропії внаслідок обмеження числа можливих конформаційних станів молекул. Спостерігаємі відмінності в значеннях термординамічних параметрів комплексоутворення ЕВ з дезоксиолігонуклеотидними дуплексами можуть бути зумовлені внеском від декількох факторів вклю-чаючи: молекулярні взаємодії (водневі зв'язки, гідрофобні, Ван- дер - Ваальсові і электростатичні взаємодії); конформаційні зміни в олігонуклеотидах; вивільнення протиіонів або протонів і зміни гідратаціі при зв'язуванні молекул. Позитивний ентропійний внесок визначається гідрофобними взаємодіями, зумовленими переносом молекул барвника з розчинника в інтеркаляційний сайт. Значний внесок від гидрофобних взаємодій має місце для 1:2 комплексів ЕВ з дезоксиолігонук-леотидними дуплексами, які характеризуються меншими абсолютними значеннями ентропії у порівнянні з реакціями утворення інших типів молекулярних комплексів в розчині.

Цікаво відзначити, що величина DH для 1: 2 комплексу з дуплексом гептаміра, "що містить балжи" приймає проміжне значення (верхній плюс (:)) між самокомплементарними тетрануклеотідами і дезоксиоктануклеотидом (чорно-білі трикутники і нижнє коло (n)). Що стосується комплексів ЕВ зі стеблом шпильки, то DH (другий знизу плюс (:)) декілька менша, ніж при зв'язуван-ні барвника з самокомплементарним дезокситетрануклеотидом, а з петлею шпильки -DH (нижній плюс (:)) порівняна з ентальпією комплексоутворення ЕВ з одноланцюговою послідовністю d(GAAG) (нижній чорно - білий квадрат). Особливе місце займає дезоксиоктануклеотид, де 1:2 комплекс відповідає найменшому значенню DS, яке зростає по абсолютній величині із збіль-шенням числа інтеркальованих молекул в дуплекс октаміру (кола (n)). Останнє, певно, пов'язане із збільшенням жорсткості і, відповідно, обмеженням можливих конформаційних станів молекул по мірі збільшення числа інтеркальованих лігандів. Слідує підкреслити, що кожний з знайдених термодинамічних параметрів є величина, що враховує різноманітні вигляди взаємодій при утворенні комплексів. Ентальпію реакції комплексоутворення барвника з двоспіральною ДНК можна уявити в вигляді суми, принаймі, шести факторів(DНi): розсуву знаходящихся в стані вертикальної стэкинг-взаємодії пар основ в дуплексі з утворенням порожнини для вбудови молекули (DН1); стекинг - взаємодії азотистих основ з хромофором барвника в місці інтеркаляції (DН2); электричні взаємодії між катіонами ліганда і негативним зарядом фосфатних груп нуклеотиів (DН3); зміна сольватної оболонки при утворенні комплексу (DН4); зміна конфігурації ліганда при зв'язуванні з ДНК (DН5); специфічні водневі зв'язки, що може утворювати барвник в комплексі (DН6). Негативний ентальпійний вклад звичайно вносять складові DН2, DН3 і DН6, а позитивний - DН1, DН4 і DН5. При оцінці величини DН можуть бути враховані також додаткові складові, зокрема, у тому випадку, якщо інтеркалятор викликає значні конформаційні зміни в ДНК.

В п'ятому розділі викладено основні результати дослідження комплексоутворення дауноміци-на з самокомплементарними фрагментами ДНК (d(CGCG), d(GCGC), d(TGCA), d(ACGT), d(AGCT), d(CGTACG), d(CGCGCG), d(TACGTA)) і з несамокомплементарним дезоксигеп-тануклеотидом d(GCGAACG)). Дауноміцин - антибіотик антрациклинової групи, використо-вується в клінічній практиці для хіміотерапії ракових захворювань. Хромофор придає його структурі схожість з молекулами ароматичних барвників. Медикобіологічну дію дауноміцину зв'язують з впливом на ядро клітини і його інтеркаляцією в ДНК. Аналіз гомоядерних і гетероядерних спектрів ЯМР розчинів DAU з дослідженими самокомплементарними дезоксиолігонуклеотидами показав, що місцем переважного зв'язування антибіотика з олігомірами є термінальний сайт олігонуклеотидних дуплексів.

Порівняння розрахованих рівноважних констант утворення різноманітних типів комплексів DAU з дослідженими дезокситетрануклеотидами показує, що якісно вони співвідносяться один з іншим приблизно однаковим чином. Разом з тим, значення констант для реакцій комплек-соутворення ЕВ з аналогічними тетрануклеотидами в ідентичних експериментальних умовах сут-тєво відрізняються як в якісному, так і в кількісному відношенні. Імовірність утворення комплексу 1: 2 DAU з будь - якою з розглянутих послідовностей суттєво вище, ніж інших комплексів у водному розчині. При цьому K2 приблизно на порядок перевищує відповідні значення констант для реакцій утворення подібного типу комплексів між вивченими тетрануклеотидами і бромистим етидієм. З таблиці 4 видно, що значення рівноважної константи K4, яка характеризує імовірність утворення в розчині комплексу 2:2 DAU з будь - яким з розглянутих дезокситетрануклеотидів, незалежно від числа пірімідін-пуринових або пурин-пірімідінових сайтів в послідовності, досить низькі, тобто зв'язування другої молекули антибіотика з дуплексом тетрамірів має явно антикооперативний характер. Цей факт, з урахуванням даних 2М - NOESY і результатів дослідження комплексоутворення ароматичних барвників профлавіну і бромістого етидію з аналогічними дезокситетрануклеотидами в ідентичних експериментальних умовах, однозначно свідчить, що місцями переважної посадки антибіотика DAU є як мінімум триплетні нуклеотидні послідовності. При цьому порівняльний аналіз равноважних констант K2 дозволяє зробити висновок, що три послідовні GC-пари основ в ланцюгах двоспиральних тетрамірів d(GCGC) 2 і d(CGCG)2 є більш прийнятними місцями зв'язування антибіотика в порівнянні з триплетами, вміщуючими дві сусідні G?C-пари, фланковані AT-пароюЧ основ в d(TGCA)2. Сиквенс-специфічність взаємодії антибіотика практично не виявляється при заміні AT - і GC-пар в триплетній дільниці зв'язування. Певно це пов'язано з тим, що дезокситетрануклеотиди не утворюють “ідеальний” дуплекс у розчині при кімнатній температурі і настільки коротких фрагментах ДНК слабко виявляється сиквенс - специфічне зв'язування масивного ліганда, яким є антибіотик DAU. Слід додати, що в комплексах зі всіма вивченими тетрамерними послідовностями - d(ACGT), d(AGCT), d(TGCA), d(GCGC) і d(CGCG), за умови, що хромофор DAU інтеркалює в термінальний сайт тетрануклеотиду, аміносахарне кільце розташовується в малій канавці подвійної спіралі в області GC-пари, яка є менш прийнятною дільницею при зв'язуванні DAU з дуплексом, ніж AT-пара азотистих основ. Щоб зме-ншити вплив недосконалості структури олігонуклеотидного дуплекса, досліджувалося комплексо-утворення DAU з самокомплементарними гексануклеотидами d(CGTACG), d(CGCGCG) і d(TACGTA) у водному розчині. Отримані дані якісно узгоджуються з результатами по зв'язуванню DAU з дезокситетрануклеотидами. Так, імовірність утворення 1:2 комплексу DAU з гексаміром (К2) багато вище, ніж утворення будь -яких інших комплексів антибіотик - гексануклеотид. Рівноважні константи K4 утворення 2:2 комплексу мають порівняно низькі значення, незважючи на наявність в гексамірній послідовності двох триплетних дільниць - потенційних місць зв'язування DAU з олігонуклеотидом. Отже, процес встроювання другої молекули DAU в гексамірний дуплекс в розчині має анти-кооперативний характер. Останнє, певно, пов'язане з особливостями взаємодії ДНК і антибіотика, що містить масивне, позитивно заряджене аміносахарне кільце, утворююче певні стеричні перешкоди при приєднанні до гексамірного дуплексу другої молекули DAU. Слід помітити, що термодинамічний аналіз комплексоутворення антрациклінових антибіотиків з ДНК свідчить про великий внесок у вільну енергію (~8,4 кДж/моль), пов'язаний з розташуванням аміносахарного кільця дауноміцину в малій канавці подвійної спіралі ДНК, а також про наявність енергетичної заборони на зміну стереохімії аміносахарного кільця. Результати експериментів вказують на те, що аміносахарне кільце необхідно для забезпечення максимальної кількості ван-дер-ваальсових контактів між хромофором антибіотика і парами основ ДНК. Порівняння розрахованих значень K2 для трьох вивчених молекулярних систем (DAU - гексамір) показує, що триплет, вміщуючий дві сусідні CG-пари, фланкований AT-парою в d(CGTACG) послідовності, є більше прийнятною дільницею для зв'язування DAU з дуплексом, ніж триплет з трьома послідовними CG-парами основ в d(CGCGCG) або триплет d(TAC) в d(TACGТА). Звідси слідує, що DAU виявляє певну сайт-специфічність при заміщенні CG-пари на AT-пару в малій канавці дуплексу гексаміра. Аналіз показує також, що певну специфічність DAU виявляє при зв'язуванні з d(CpG)-сайтом в одн-ониткових послідовностях дезоксигексануклеотидів. Розрахунки комплексоутворення дауноміци-ну з дезоксигептануклеотидом d(GpCpGpApApGрC), що містить паліндромну послідовність в ланцюзі і формуючим шпилькову структуру у водному розчині показали, що зв'язуванням другої молекули антибіотика з гептаміром можно знехтувати. Константа утворення 1: 1 комплексу DAU зі шпилькою ((72 ± 12)·103 л/моль, D1+N L D1N L), подібно комплексоутворенню бромистого етидію, значно менша відповідних значень константи зв'язування ліганда з димірною формою гептануклеотида К3 при Т = 298 К. Очевидно, імовірність зв'язування як барвника, так і антибіотика зі шпильковою структурою менша, ніж з диміром дезоксигептануклеотида.

На базі розрахункових значень індукованих хімічних зсувів протонів антибіотика і даних про внутрішньо- і міжмолекулярних NOE контактів визначені структури DAU з дезоксиолігонуклео-тидними дуплексами (1:2 комплекси). Розраховувалося екранування необмінюючихся протонів хромофора DAU парами GЧC, CЧG і AЧT в інтеркальованих комплексах при варіації конформа-ційних параметрів спіралі (табл. 5). На малюнку 3 в якості прикладу представлена у двох проекціях найбільш імовірна структура комплексу 1:2 DAU з гексануклеотидом d(ТpАpCpGpTpA). Хромофор антибіотика в олігонуклеотидах розташовується перпендикулярно осі спіралі на рівних відстанях від площин верхньої і нижньої пари основ і повернуто на кут ~ (90°-140°) відповідно по відношенню до площини нижньої пари основ, в результаті чого залишок розташовується в малій бороздці подвійної спіралі і, фактично, блокує третю пару основ, що мабуть є основною причиною низької імовірності зв'язування другої молекули антибіотика з коротким дезокситетрануклеотидним дуплексом. Важливо відзначити, що раскручування спіралі в місці інтеркаляції практично буде відсутнє і не перевищує 4° (W=36° - 32°). Це добре узгоджується з даними рентгеноструктурного аналізу подібних молекулярних структур. Спосте-рігаємі відмінності в конформаційних параметрах інтеркальованих комплексів, загалом, зумовлені особливостями "укладки" аміносахарного кільця DAU в малій канавці олігонуклеотидних дуплек-сів різноманітної послідовності основ в ланцюзі і особливостями двоспіральних структур тетра - і гексануклеотидів при кімнатних температурах.

Термодинамічні параметри - ентальпія і ентропія комплексоутворення дауноміцина з дослід-женими олігомірами ДНК узагальнені на мал. 4. З малюнку видно, що кожний тип комплексів (1:1, 1:2, 2:1, 2:2) з самокомплементарними дезокситетра - і гексануклеотидами характеризуються близькими значеннями термодинамічних параметрів.Виняток складає 1: 2 комплекс DAU з дезо-ксигексаміром d(CGTACG)2, при утворенні якого DH і DS значно менші за абсолютною величи-ною в порівнянні з термодинамічними параметрами подібних комплексів антибіотика з гексамі-рами інших нуклеотидних послідовностей. 1: 1 комплекси характеризуються більшими по абсо-лютній величині значеннями DH і DS, що свідчить про суттєвий внесок конформаційних перебу-дов в одноланцюговій нуклеотидній послідовності при комплексоутворенні молекул. Разом з тим, комплекси DAU з однонитковими послідовностями відповідають меншим значенням DG.

Цікаво відзначити, що термодинамічні параметри комплексоутврення DAU зі шпилькою гепта-міру знаходяться на прямій, відповідній комплексам DAU з одноланцюговими дезоксиолігонуклеотидами. Разом з тим DH і DS для комплексу DAU з дуплексом гептаміру знаходиться на прямій, що описує термодинамичні параметри зв'язування DAU з дуплексами самокомплементарних дезоксиолігонуклеотидів. Таким чином, наведені термодинамічнні параметри свідчать про існування сиквенс - специфічного зв'язування DAU з дезоксигексануклеотидами і про істотню роль гідрофобних взаємодій, зв'язаних з укладкою аміносахара антибіотика в малій канавці подвійної спіралі, при утворенні комплексів DAU з дуплексами само- і несамокомплементарних дезоксиолігонуклеотидів. Певну роль при цьому грає також утворення водневих зв'язків між атомами хромофора антибіотика і азотистими основами, які характеризуються як негативними значеннями D H, так і DS.

ВИСНОВКИ

ароматичний молекула iнтеркалятор нуклеотидний

1. Розроблена методика проведення експерименту і обробки експериментальних даних дозволяє отримати кількісні дані про параметри комплексоутворення ароматичних біологічно активних молекул з фрагментами ДНК, розрахувати параметри подвійної спіралі і орієнтацію хромофорів лі-гандів в інтеркальованих комплексах “ДНК - ліганд”, використовуючи індуковані хімічні зсуви, екрануючи дію нуклеотидних пар на протони ліганду і дані 2М - NOE спектрів, а також розрахувати внески різноманітного типу реакцій в сумарні теплові і ентропійні ефекти взаємодіючих молекул при спільній обробці концентраційних і температурних залежностей протон-них хімічних зсувів молекул.

2. Показано, що характеристики реакцій самоасоціації ароматичних лігандів, отримані на основі кооперативної і некооперативної моделей взаємодії молекул, суттєво залежать від хімічної структури хромофорів і характеру бокових ланцюгів і груп досліджених біологічно активних сполук.

Дослідження самоасоціації дезоксиолігонуклеотидних послідовностей різноманітної довжини і нуклеотидного складу дозволяє розмістити cамокомплементарні дуплекси олігонуклеотидів (ds-ДНК) за термодинамічною стабільністю в наступному ряді: d(CGCGCG)2 > d(GACATGTC)2 > d(CGTACG)2 > d(TACGTA)2 > d(CGCG)2 > d(GCGC)2 > d(TGCA)2 > d(ACGT)2 > d(AGCT)2, а диміри несамокомплементарних дезокситетрануклеотидів в такий послідовності: d(CGAA)2 ” d (AAGC)2 > d (CTGA)2 > d(GAAG)2. Стабільність дуплексів залежить від нуклеотидного складу і числа пірімідін - пуринових дільниць в послідовності. Особливе положення по термічній стабіль-ності серед вивчених дезоксиолігонуклеотидів займає дезоксигептануклеотід d(GCGAAGC), що містить паліндромну послідовність в ланцюзі і здатний утворювати шпилькову структуру у водному розчині. Гептамір d(GCGAAGC) утворює шпильку з короткою GAA - петлею, винятково тривку до дії температури (Тm = 78о С). При цьому стебло шпильки гептаміеру, що складається з двох пар основ, приймає конформацію близьку до В - форми.

3. Розроблені методики визначення сиквенс - специфічного зв'язування ароматичних лігандів з олігонуклеотидними послідовностями різної вторинної структури (ssДНК, ds-ДНК, шпількови структури). Виявлені типи реакцій, які адекватно відбивають процеси комплексоутворення барвника бромистого етидію і антибіотика дауноміцину з послідовностями різноманітного нуклеотид-ного складу, довжини і вторинної структури в розчині, визначено константи рівноваги в реакціях зв'язування лігандів з дезоксиолігонуклеотидами, встановлено характерні особливості геометрії різноманітного типу комплексів. Показано, що вміст в розчині різноманітних типів комплексів “дезоксиолігонуклеотид - ліганд” залежить від температури розчину, співвідношення вхідних концентрацій взаємодіючих молекул, послідовності основ і довжини ланцюга дезоксиолігонуклеотидів.

4. Встановлена переважна взаємодія бромистого етидію з pyr - pur послідовністю основ в самокомплементарних олігонуклеотидних дуплексах і несамокомплементарних одноланцюгових фрагментах ДНК. Виявлена значно менша імовірність зв'язування ЕВ з сайтами одноланцюгових пос-лідовностей, що містять однакові типи основ (pyr - pyr або pur - pur) в ланцюзі. Отримані результати свідчать про те, що вибірковість зв'язування ЕВ з пірімідін - пуриновою послідовністю викликана головним чином різноманітними конформаційними перебудовами олігонуклеотидів при ін-теркаляції барвника.

5. Дауноміцин практично не виявляє сиквенс - специфічність взаємодії з одно- і двоспіральними дезокситетрануклеотидами. Антибіотик здебільшого интеркалює в кінцеві сайти вивчених олігонуклеотидів, при цьому аміносахар DAU розташовується в малій канавці дуплекса олігоміру, частково перекриваючи третю пару основ.

6. Порівняльний аналіз параметрів комплексоутворення DAU c послідовностями з шести нуклеотидів однозначно свідчить про переважне зв'язування антибіотика з триплетною нуклеотидною дільницею, яка містить дві CG-пари, фланкировані AT-парою в гексамірі d(CGTACG)2 у порівнянні з триплетами d(CGC) і d (ТАC) в дуплексах d(CGCGCG)2 і d(ТАCGТА)2. Експеримен-тальні дані дозволяють зробити висновок про те, що гідрофобні взаємодії аміносахарного залишку антибіотика в малій бороздці подвійної спірали ДНК вносять значний вклад в утворення комплексів DAU з ДНК. DAU виявляє певну специфічність зв'язування з d(CpG) - сайтом в однониткових послідовностях дезоксигексануклеотидів. Розраховані найбільш імовірні структури 1: 2 комплексів “DAU - олигонуклеотид” в розчині добре узгоджуються зі структурами подібних комплексів у кристалічному стані, визначеними засобами рентгеноструктурного аналізу.

7. Методика аналізу температурних залежностей хімічних зсувів протонів ліганду дозволяє диференціювати внески різноманітних реакцій комплексоутворення в сумарні тепловий і ентропійний ефекти при взаємодії ароматичної сполуки з дезоксиолігонуклеотидами в розчині. Аналіз термоди-намічних параметрів комплексоутворення досліджених ароматичних лігандів з дезоксиолігонук-леотидами різноманітного нуклеотидного складу і вторинної структури дозволили виявити наступні загальні закономірності:

а) комплекси 1:2, які відповідають енергетично більш вигідному зв'язуванню лігандів з самокомплементарними дуплексами ДНК, характеризуються меншими абсолютними значеннями DH і DS у порівнянні з іншими типами комплексів, що дозволяє зробити висновок про суттєву роль гидрофобних взаємодій при утворенні таких комплексів.

б) комплексоутворення ароматичних лігандів з одноланцюговими послідо-вностями характеризуються близькими значеннями DH і DS незалежно від їх нуклеотидного складу, що свідчить про значно меншу специфіку зв'язування ароматичних молекул з нуклеотидними послідовностями ssДНК.

в) абсолютні значення DH і DS комплексів досліджених лігандів з ds-ДНК зменшуються із збільшенням довжини нуклеотидної послідовності. Термодинамічні параметри комплексоутворення ЕВ з самокомплементарним октаміром ДНК узгоджуються з даними для полідезоксири-бонуклеотидів і макромолекули ДНК, визначеними мікрокалориметрично.

с) взаємодія лігандів з некомплементарним дезоксигептануклеотидом, який вміщує паліндромну послідовність в ланцюзі і здатен утворювати стабільну шпилькову структуру у водному розчині, характеризується двома різноманітними значеннями DG, які відповідають зв'язуванню з дуплексними і одноланцюговими фрагментами ДНК.

Обмірковуєтся роль довжини олігонуклеотидних дуплексів і можливість перенесення отриманих термодинамічних параметрів комплексоутворення ароматичних лігандів з ds - ДНК на полі-мірну молекулу. Показано, що самокомплементарні дезоксигекса- і дезоксиоктануклеотиди є до-брими модельними системами для дослідження термодинамики зв'язування ароматичних лігандів з макромолекулою ДНК.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1.Веселков А.Н., Дымант Л.Н., Барановский С.Ф., Болотин П.А., Паркес Х.Е., Дэвис Д. Исследование самоассоциации бромистого этидия в водном растворе методом 1Н - ЯМР - спектроскопии // Хим. физика.- 1994. - Т.13. - №11. - С. 70 - 78.

2.Веселков А.Н., Дымант Л.Н., Барановский С.Ф., Болотин П.А., Паркес Х. Е., Дэвис Д. Исследование самоассоциации антибиотика актиномицина D в водном растворе методом 1Н - ЯМР - спектроскопии // Журн. структ. химии.- 1995.- T.36.- N 1. - C.81-88.

3.Веселков А.Н., Дымант Л.Н., Болотин П.А., Барановский С.Ф., Паркес Х., Дэвис Д. Исследование взаимодействия бромистого этидия с дезокситетрарибонуклеозидтрифосфатом 5'-d(GpCpGpC) методом 1Н -ЯМР -спектроскопии // Молекулярн. биология.-1995. -T.29.- N2.-C.326 -338.

4.Веселков А.Н., Дымант Л.Н., Болотин П.А., Барановский С.Ф., Завьялова О.С, Веселков Д.А., Паркес Х., Дэвис Д. Исследование комплексообразования бромистого этидия с самокомплементарным дезокситетрануклеотидом 5'-d(ApGpCpT) методом одномерной и двумерной 1Н ЯМР-спектроскопии // Биофизика.- 1995.- Т.40. - С.1189 -1201.