Когерентная фазовая микроскопия

Размещено на http://www.allbest.ru/

Министерство образования и науки Российской Федерации

Федеральное государственное

бюджетное образовательное учреждение

высшего профессионального образования

Физический факультет

Кафедра оптики и биофотоники

Реферат

Специальность медицинская физика

Когерентная фазовая микроскопия

Рецензент: д. ф. - м. н, профессор Тучин В.В.

Реферат подготовил:

Студента 5 курса 551 гр.

Марченко Булат Владимирович

Саратов 2014



Введение

Изучение явлений самоорганизации и регуляции внутриклеточных процессов является одной из фундаментальных проблем биологии. В последние годы были разработаны новые методы микроскопии, основанные на использовании современных достижений когерентной оптики, спектроскопии и компьютерной техники, и достигнуты важные результаты в молекулярной биомеханике. Например, методы флуоресцентной микроскопии в сочетании с видеосъемкой позволили измерить скорость вращения у-субъединицы изолированного АТФазного комплекса, который является самым миниатюрным естественным молекулярным мотором. Для определения углового положения, связанного с г-субъединицей маркированного актинового филамента, были использованы методы флуоресцентной микроскопии и видеомикроскопии. [1]

Методы многофотонной флуоресцентной микроскопии [2] успешно развиваются и привлекают все возрастающее внимание. Спектральная фильтрация и высокое разрешение по времени затухания флуоресценции позволили отождествить некоторые белки, их пространственное распределение и динамику. Разработанный метод многофокусной мультифотонной микроскопии (Multifocal Multiphoton Microscopy -- MMM), в котором сканирование поверхности образца производилось одновременно 30 сфокусированными пучками излучения импульсного титан-сапфирового лазера, позволил значительно сократить время измерений. Комбинация МММ с (4я) - микроскопией позволила увеличить аксиальное разрешение до 100150 нм. В этом методе исследуемый объект помещался в интерференционное поле, создаваемое встречными когерентными пучками, исходящими из двух симметрично расположенных объективов.

В качестве примера измерений динамических процессов в клетке отметим метод темнопольной точечной микроскопии (Point Dark Field Microscopy). Этот метод был использован для исследования в реальном времени АТФ-стимулированных флуктуаций мембраны эритроцита. Его сущность заключалась в фотоэлектрической регистрации изменений интенсивности света в поле зрения микроскопа при смещении края объекта относительно оптической оси объектива.

Применение лазеров в микроскопии позволило разработать методы манипуляции микрочастицами и внутриклеточной хирургии, реализовать принцип конфокальной микроскопии, управлять спектральными и временными характеристиками флуоресценции, повысить точность измерений и быстродействие приборов [2].

Анализ изображений в современных микроскопах осуществляется с помощью компьютеров. Принципиальное значение имеет характер первичной информации, которая закодирована в изображении и подвергается последующей обработке. В классической оптической микроскопии обычно используются естественные изображения объектов, в которых информация связана с двумерным распределением интенсивности (или яркости) рассеянного объектом излучения некогерентного источника. Для усиления контраста во многих случаях используются селективное окрашивание органелл и различные оптические методы (фазового и дифференциального интерференционного контраста), а также компьютерные методы обработки изображений, например вычитание фона. Такие изображения, в которых информация представлена распределением интенсивности или спектральной плотности рассеянного объектом излучения, мы будем называть амплитудными, в отличие от других -- так называемых функциональные изображений. В функциональных микроскопических изображениях первичная информация может быть представлена двумерным распределением параметра, не связанного непосредственно с топологией объекта. Таким параметром, например, может быть спектральная плотность флуоресценции, спектр вынужденного комбинационного рассеяния или время релаксации возбужденных состояний. Интенсивность и спектры флуктуаций оптических параметров объекта могут быть характерными параметрами при измерениях в фазовых микроскопах . Важное отличие фазовых методов состоит в том, что фаза является "естественно” нормированной величиной в основном интервале определения 2я и ее значения при использовании когерентных источников света могут измеряться с большой точностью.

Вполне естественно, что функциональные изображения содержат дополнительную к классическим изображениям информацию и имеют ряд необычных свойств. В частности, следует отметить в фазовых изображениях возможность сверхразрешения и регистрации локальных динамических процессов.

Сделаем общее замечание к проблеме анализа динамических процессов, зафиксированных, например, в виде серии амплитудных видеоизображений.

В амплитудных изображениях практически невозможно получить воспроизводимые нормированные количественные данные о параметрах движения, поскольку контраст изображения, число различимых градаций в цвете, пространственное разрешение и другие характеристики зависят от многих неконтролируемых факторов (условий освещения, компенсации фона, спектральной чувствительности ПЗС-камеры и т.п.). В частности, в методе дифференциально-интерференционного контраста (DIC) в изображениях распределение интенсивности (или яркости) весьма сложным образом связано с ориентацией анизотропных элементов объекта относительно плоскости поляризации света.

Отсутствие нормированных параметров, не зависящих от условий освещения, является основной причиной, не позволяющей сравнивать результаты, полученные в амплитудных изображениях на различных приборах.

Тем не менее, с помощью современных компьютерных методов из амплитудных видеоизображений удается получить ограниченную количественную информацию о траектории движущихся частиц и о других динамических процессах. В качестве примера укажем разработанные для этой цели фирмой Hamamatsu оптоэлектронные приставки Argus-20-100. ПЗС-камеры этих приставок устанавливаются на обычных микроскопах и позволяют в реальном времени анализировать с помощью пакетов программ амплитудные изображения на мониторе компьютера. Приставка позволяет производить вычитание кадров и наблюдать изменения морфологии неокрашенных клеток с высоким пространственным разрешением, присущим дифференциальному контрасту. По-видимому, возможности этой техники в исследовании внутриклеточной динамики весьма ограничены, и о возможности получения других количественных характеристик, например, спектров флуктуаций и корреляционных функций, сведений нет.

Методы конфокальной микроскопии сейчас весьма популярны и оказались эффективными для реконструкции трехмерных изображений клеток и органелл. В основе этих методов лежит линейная зависимость интенсивности в сопряженной точке плоскости изображения от интенсивности рассеяния на локальной неоднородности в плоскости объекта. В проспектах фирм-поставщиков конфокальных микроскопов сообщается также о принципиальной возможности регистрации внутриклеточных динамических процессов. Однако в известной нам литературе нет публикаций с конкретными результатами таких измерений. По-видимому, это можно объяснить следующими причинами.

В конфокальных микроскопах фототок пропорционален локальной интенсивности рассеянного света, и поэтому возможна регистрация только оптически плотных элементов объекта. Следовательно, процессы, которые не сопровождаются заметными изменениями локальной оптической плотности объекта, не могут быть обнаружены.

Большие надежды на прогресс в микроскопии субмикронных структур в последнее десятилетие связаны с разработкой зондовых методов. В каталогах ряда фирм сообщается о туннельных, атомно-силовых и других типах микроскопов, обеспечивающих разрешение на атомном уровне. Известны также их оптические аналоги -- микроскопы ближнего поля. Как правило, в таких микроскопах изображение получают при растровом сканировании оптического зонда вдоль поверхности образца и регистрации интенсивности рассеянного излучения. Проведенные недавно прямые измерения внутриклеточной динамики в физиологическом буфере подтвердили перспективность зондовых методов, несмотря на ряд проблем (необходимость очистки и замены иглы, трудности совмещения с визуальным каналом).

Однако зондовые методы нельзя считать в полной мере неинвазивными, поскольку градиенты поля в окрестности зонда, механические возмущения, контакт с инородным материалом и другие факторы влияют на состояние объекта. Кроме того, здесь также справедливы замечания, высказанные ранее в связи с амплитудными изображениями. Измеряемая величина -- изменение интенсивности света на выходе оптического зонда -- должна быть нормирована. В противном случае ее трудно (или невозможно) сопоставить с физическими величинами, измеряемыми другими методами, и отождествить с принятыми в биологии параметрами. Чувствительность, разрешающая способность и быстродействие зондовых микроскопов вполне достаточны для решения многих задач исследования внутриклеточных процессов, но публикаций об их применении пока мало.

Фазовые изображения представляют собой двумерное распределение фазы, или оптическую разность хода (ОРХ) интерферирующих лучей. Традиционная область применения фазовых микроскопов -- профилометрия микроструктуры поверхности и микроэлектроника. Геометрическая высота профиля H(r) оптически однородных непрозрачных объектов связана с фазой отраженной волны ц(r) очевидным соотношением:

H(r)=, H(x,y)=

В изображениях оптически неоднородных прозрачных объектов ОРХ в известном приближении пропорциональна локальной проекции показателя преломления n(r) на направление z луча:

h(r)= =

h(x,y)= =

Для измерений фазы, или ОРХ, используются интерференционные микроскопы с модуляцией фазы опорной волны. В многошаговых методах фазовой микроскопии с помощью координатно-чувствительного фотоприемника (обычно ПЗС-камер) при фиксированных значениях фазы опорной волны регистрируют и вводят в память компьютера определенное число паттернов интенсивности интерференционного поля и вычисляют для каждого пикселя изображения значения локальной фазы, или ОРХ. Здесь X, Y -- координаты в плоскости изображения, q -- индекс фазы опорной волны.

Для интенсивности интерференционного поля, представленной в виде

фиксированных значениях фазы опорной волны

=

где q = 1,2, 3,..., и, фаза определяется по формулам

соответственно для четырех (n = 4) и для пяти (n = 5) шагов. По записанным в память компьютера паттернам в каждом пикселе изображения по приведенным алгоритмам могут быть вычислены локальные значения фазы.

Многошаговый метод обеспечивает высокую точность измерений для стационарных интерференционных полей, быстродействие и большое число пикселей. Основные недостатки многошаговых методов связаны с тем, что локальные значения фазы определяются через величины , измеренные в различные моменты времени. Поэтому флуктуации интенсивности и частоты источника излучения, а также вибрации и механическая нестабильность интерферометра ограничивают точность измерений. По этой же причине этим методом практически невозможна регистрация внутриклеточных динамических процессов.

Одна из основных проблем микроскопии, актуальность которой возрастает в функциональных изображениях, состоит в интерпретации полученной информации. В связи с этим вполне оправдана тенденция к созданию многофункциональных микроскопов с широким использованием для обработки изображений современной вычислительной техники.



1. Физические основы когерентной микроскопии

микроскопия оптический корреляционный внутриклеточный

Ниже мы более подробно рассмотрим метод получения фазовых изображений, в котором было реализовано одно из решений проблемы внутриклеточной динамической микроскопии.

При практической реализации методов фазовой микроскопии неизбежно возникает ряд принципиальных препятствий. Действительно, нативный биообъект в тонком слое in vitro представляет собой структурированную, оптически неоднородную анизотропную среду, которую нельзя описать одной функцией координат в плоскости изображения.

Например, распределение оптической плотности, или ОРХ, в фазовых изображениях связано с проекцией тензора показателя преломления n(r, t), и отождествление органелл клетки можно производить на основании априорной информации (более плотное ядро, возрастающие градиенты плотности вблизи мембран клеток и т.д.). Препараты биообъектов для in vitro микроскопии обычно представляют собой помещенный в кювету или нанесенный на стеклянную пластину слой буферного раствора с суспензией клеток или органелл. Поэтому адекватной физической моделью биообъекта (рис. 1) в ограниченном поле зрения объектива Л может служить слой иммерсионной жидкости с показателем преломления п0 под покровным стеклом C, в который вкраплена оптическая неоднородность с размером d, толщиной H и тензором показателя преломления n(r,w,t) где n зависит от щ -- частоты источника света. В каждой точке плоскости изображения (X, Y) с помощью фотоприемного устройства измеряется интенсивность интерференционного поля и фаза рассеянной волны.

В приближении эйконала поле рассеянной волны E(r, t), где r[x, у, z] -- координаты вблизи плоскости объекта, можно представить локальными плоскими волнами



E(r,t)=

где E0(r) -- медленно меняющаяся функция координат, , S(r) -- эйконал, удовлетворяющий условию. В геометро-оптическом приближении

фаза рассеянной волны пропорциональна проекции показателя преломления в точке (х,у) в плоскости объекта

Оптическая система микроскопа отсекает в поле E(r, t) высокие пространственные частоты и переносит модулированную объектом i-ю волну в плоскость X, Y изображения

где -- когерентная передаточная функция объектива [11, 23], ? -- обозначение свертки.

Модуляция волнового фронта в плоскости объекта с точностью до высоких пространственных частот переносится в плоскость изображения

,

X/х = Y/у = М

линейное оптическое увеличение. Интерферометры позволяют измерить разность фаз

рассеянной объектом волны

или ОРХ в различных точках волнового фронта. Функции и мы будем дальше рассматривать как фазовые изображения объекта n(х,у,z). Следует напомнить, что функции определены с точностью до аддитивной константы и далеко не всегда являются однозначной характеристикой объекта. Например, может зависеть от числовой апертуры объектива, точности фокусировки, поляризации проходящей волны.

В приближении геометрической оптики локальная неоднородность n(х,у,z) с большим поперечным размером (d?л) и аксиальной высотой будет иметь фазовый "портрет”

где ОРХ

есть "проекция” функции в пределах интегрирования соответственно 0 и . Для оптически однородного объекта (n, Н) в иммерсионной среде по

Напомним, что X, Y и х, у -- координаты сопряженных точек в плоскостях изображения и объекта. Естественно, что в таком "портрете” невозможно разделить вклады высоты и показателя преломления .

Такая же неопределенность возникает в слоистой среде, когда измеряется суммарный вклад отдельных слоев

Из (1) следует, что в фазовых изображениях должны быть систематические отличия в геометрической и "фазовой” высотах. "Фазовая” высота зависит от локальной разности проекций показателей преломления, например, в неоднородности n(r,щ,t) и буфера по на рис.1. Обычно

и поэтому фазовая высота (ОРХ) меньше реальной (геометрической) толщины:

Интерпретация фазовых "портретов”

значительно усложняется при d 1, когда приближение геометрической оптики некорректно. В фазовом ”портрете” происходит дифракционное искажение размеров и формы субволновых структур оптической неоднородности Кроме того, при 1 снижается общий фазовый контраст. Из сказанного следует, что для корректной интерпретации фазовых изображений с субволновыми структурами всегда желательна априорная информация об оптической модели объекта.

В связи с большим значением для прижизненной микроскопии информации о внутриклеточных процессах рассмотрим более обстоятельно ограничения, связанные с разрешающей способностью оптической системы в функциональных изображениях. Понятие когерентной передаточной функции (или функции зрачка), с которой связан критерий разрешения, корректно для амплитудных изображений и только в параксиальном приближении. Вполне естественно, что критерий Рэлея, основанный на модели двух идентичных точечных амплитудных объектов, неприменим в общем случае к функциональным, а также к фазовым изображениям. Наиболее простым примером некорректности критерия Рэлея в функциональных изображениях, т.е. обнаружения элементов объекта на расстоянии, меньшем л/2, является модель двух неидентичных по спектру точечных источников. В этом случае проблема разрешения сводится к точности определения координат источников при измерении спектральной плотности их излучения с помощью двух согласованных фильтров. Возможность сверхразрешения для квазиточечных объектов, различающихся по спектральным характеристикам, была подтверждена экспериментально методами флуоресцентной и многофотонной микроскопии. В функциональных изображениях точечные объекты могут отличаться разнообразными признаками, в том числе спектром флуктуаций или параметрами движения. Поэтому, как правило, критерии разрешения в функциональных изображениях оказываются энергозависимыми, и при достаточно высоком отношении сигнал/шум может быть реализовано сверхразрешение.

Сверхразрешение наблюдалось в фазовых изображениях также при регистрации динамических процессов. В этом случае в качестве критерия разрешения использовалось минимальное расстояние вдоль скан-линии между максимумами спектральной плотности компонент.

Однако этот подход не объясняет сверхразрешение в фазовых тест-объектах а также наблюдаемое методом дифференциального интерференционного контраста (DIC) в изображениях амплитудных объектов. В фазовых изображениях параметр сверхразрешения при достаточно высоком контрасте, когда

достигал. Это противоречие с классической теорией оптических систем может быть устранено, если принять во внимание, что понятие когерентной передаточной функции точки справедливо только для параксиального приближения [23, 24].

Под динамическим процессом в фазовом объекте мы подразумеваем равномерную выборку значений ОРХ в определенной области координат в плоскости изображения X, Y, где т=0,1,2,..., -- время измерения одного пикселя. Для определенности мы предположим, что измеряемые физическими методами флуктуации значений причинно связаны с зависящей от времени компонентой показателя преломления

где r(x, у, z) -- координаты в плоскости объекта. Нас в дальнейшем будут интересовать пространственно-временные характеристики флуктуирующей компоненты ) и связанные с ними движения. Выделение полезной биологической информации из эквивалентно решению обратной задачи -- нахождению динамических параметров системы по измеренным в плоскости изображения значениям фазы рассеянной волны. Некорректность задачи и неоднозначность решений, как отмечалось ранее, связаны с измерением одной величины (ОРХ), в которую дают вклады многие параметры. Поэтому следует формально рассматривать в качестве функционала от многих переменных.

Физические причины, приводящие к временным изменениям в биообъектах, могут быть весьма разнообразны.

Например, флуктуации в ограниченной области координат X, Y, соответствующей проекции клеточной мембраны со встроенными ионными каналами и ферментными комплексами, могут быть следствием конформационных изменений белков, локальных вариаций мембранного потенциала и т.п., не связанных с трансляционным движением объекта в целом. Такие процессы практически недоступны наблюдениям методами классической микроскопии, поскольку малые изменения показателя преломления не влияют на интенсивность рассеянного излучения.

Другим примером локальных изменений связанных с трансляционным движением, могут быть хорошо известные движения вдоль микротрубочек макромолекул, митохондрий и других органелл, наблюдаемые методами флуоресцентной микроскопии и DIC- видеомикроскопии .

В фазовых изображениях такие объекты формально можно представить функцией координат центра (r, t) частицы с фиксированным объемом V и показателем преломления

где u -- проекция средней скорости на траекторию r(t). Если регулярное трансляционное движение сопровождается случайными или периодическими флуктуациями, то это приведет к появлению соответствующих компонент в спектрах фазовых флуктуаций.

В дальнейшем мы ограничимся видами движений, которые можно представить функциями с разделяющимися переменными координат и времени

-- функции, удовлетворяющие граничным условиям, -- собственные значения частоты, т = 1,2,... При этом предполагаем, что внутри конечного объема V происходят локальные синхронные колебания. Следовательно, измерения ОРХ h(r, t) в принципе могут дать ряд значимых динамических параметров объекта: локальные частоты собственных колебаний , радиусы и времена корреляции, а также другие характеристики, известные из статистической теории открытых систем.



Ниже мы приведем результаты измерений конкретных процессов, а здесь ограничимся замечанием, что в реальных условиях внутриклеточной микроскопии вклад отдельных макромолекул в оказывается значительно ниже порога чувствительности интерферометров. При отсутствии взаимной корреляции в спектрах будут преобладать стохастические компоненты.

В связи с этим рассмотрим зависимость средней интенсивности флуктуаций фазы от взаимной корреляции движений между элементами объекта. Предположим, что при когерентном освещении поверхности объекта источником с частотой щ рассеянную волну Es(t) на площадке изображения S с координатами центра X, Y можно представить сверткой

(2)



где P(X/M -- x, Y/M -- у) -- когерентная передаточная функция, M -- коэффициент линейного увеличения оптической системы,

, (3)

— поле вторичных источников от N элементов с амплитудами и фазами

Пусть эти N идентичных по размерам динамических объектов расположены вблизи фокальной плоскости внутри слоя с границами z = ±H/2 (рис. 2) и могут быть представлены не зависящей от координат скалярной функцией показателя преломления

Предположим далее, что S есть площадь пикселя в плоскости изображения, размер которого ограничен дифракцией на апертуре объектива. Тогда интегрирование в (2) должно происходить по площади круга радиуса w, где w есть физическое пространственное разрешение микроскопа. Естественно, эквивалентная процедура усреднения может быть произведена также в плоскости изображения X, Y на круге с площадью

W/w = M.



Фотоприемник в плоскости изображения регистрирует среднюю по площади пикселя S интенсивность интерференционного поля

2

Где -- комплексная амплитуда опорной волны. Из переменной составляющей фототока по некоторому алгоритму может быть определено среднее по площади S значение фазы интерференционного сигнала .

Естественно, что вклад рассеянной объектом волны

в фазу переменной составляющей фототока будет определяться статистическими характеристиками и

Определим зависимость между флуктуациями и в двух предельных случаях, предполагая отсутствие амплитудных флуктуаций. Тогда для малых флуктуаций

и

При отсутствии корреляции в фазовых флуктуациях динамических объектов:

корреляционная функция фазы интерференционного сигнала

(4)

будет в N раз меньше корреляционной функции фазы изолированного динамического объекта

В другом предельном случае полной фазовой корреляции

(5)

равные корреляционные функции фазы интерференционного сигнала и объекта.

Формулы (4) и (5) находятся в согласии с хорошо известным выводом о том, что в некоррелированных процессах суммируются интенсивности, а в коррелированных -- амплитуды.

В соответствии с моделью на рис.2 корреляция между фазами в различных элементах динамического объекта возможна только при корреляции соответствующих флуктуаций коэффициента преломления



Если в спектрах флуктуаций отдельных элементов были доминирующие частотные компоненты, то при наличии корреляции их спектральная плотность

также возрастет в N раз. Для малых индексов модуляции спектры флуктуаций показателя преломления и фазы будут идентичны.

Из этого также следует, что преобладающий вклад в будут давать кооперативные процессы с радиусами корреляции, соизмеримыми или большими размера пикселя. При частичной корреляции процессов их интенсивность при прочих равных условиях будет убывать с ростом числа N независимых элементов вместе с квадратом отношения радиуса корреляции R к разрешающей способности

.

Для иллюстрации рассмотрим численный пример. Предположим, что локальное изменение показателя преломления с амплитудой Sn(t) = 0,1 вызвано конформационными переходами в ферментном комплексе (например, в АТФазном) в области с линейными размерами 20 х 10 х 10 нм3 и объемом 2 х 10 - 6 мкм3. Эти комплексы расположены в виде тонкого слоя толщиной Н = 20 нм в фокальной плоскости объектива фазового микроскопа с линейным разрешением W = 0,1 мкм. Для максимального числа ферментных комплексов на площади дифракционного пятна



соответствующего одному пикселю в плоскости изображения, получаем значение При интенсивности флуктуаций ОРХ одного комплекса

и при отсутствии корреляции сумма вкладов в ОРХ от всех элементов будет

В противоположном случае полной корреляции флуктуации всех комплексов суммарная интенсивность будет равна . При пороговой чувствительности hmin= 0,5 нм некогерентные флуктуации не будут заметны на фоне шумов, а при когерентном сложении они дадут превышение над уровнем шумов S/N = 4. При наличии в коррелированных флуктуациях гармонической компоненты со временем когерентности 10 с в фурье-спектре ей будет соответствовать спектральная плотность . [3]

2. Компьютерный фазовый микроскоп

Оптическая схема компьютерного фазового микроскопа "Эйрискан" [27] (рис. 3), разработанного на базе интерференционного микроскопа МИИ-4 ЛОМО, является модификацией схемы микроинтерферометра Линника. В качестве источника когерентного излучения использовался одномодовый гелий-неоновый лазер ЛГ-207А (л= 633 нм), что обеспечивало высокую точность фазовых измерений и некритичность к разности хода опорного и объектного лучей. Линейно-периодическая модуляция фазы опорной волны осуществлялась зеркалом с пьезопреобразователем. Для регистрации интерференционного сигнала и его аналого-цифрового преобразования в локальные значения фазы использовались координатно-чувствительный фотоприемник-диссектор ЛИ-620 и электронный блок.

Диссектор представляет собой электронно-оптический преобразователь с внешним фотоэффектом (без накопления заряда), с фотоэлектронным умножителем и магнитным переносом потока электронов в плоскость диафрагмы с малым отверстием. Сканирование проецированного на фотокатод изображения осуществляется магнитным полем. Пространственное разрешение, зависящее от диаметра отверстия диафрагмы, было около 200 линий. Размер и положение области сканирования определялись программой. Поле микроскопа могло изменяться в пределах 5-50 мкм, максимальная размерность изображения по одной координате -- 1024 пикселя. Ограниченная шумами чувствительность была около hmin= 0,5 нм, периодичность выборки и скорость ввода изображения определялась частотой модуляции 1 кГц (или 1 мс на пиксель). Измеряемый объект (клетки, органеллы) размещался в кювете с объемом 0,3 мл между полированной кремниевой подложкой и покровным стеклом. Внешний вид прибора "Эйрискан” показан на рис. 4. Кювета с объектом располагалась на предметном столе. Измерения производились в отраженном свете.

Программное обеспечение позволяло получать двумерные псевдоцветные топограммы, профили фазовой высоты и ее дисперсию в произвольных сечениях, запись временных процессов вдоль произвольной линии в топограмме, вычитание тренда и экспорт файлов в кодах ASC-II.

В микроскопе был реализован компенсационный метод измерения фазы по одному значению фототока за период модуляции. В этом методе фиксировался момент компенсации, а мгновенное значение фазы определялось по длительности нормированного временнОго интервала. Тестирование микроскопа производилось на эталонированных полупроводниковых микроструктурах и сферах латекса диаметром 100 нм. Измерения методом динамической фазовой микроскопии (ДФМ) осуществлялись в следующей последовательности.

3. Получение фазового изображения

Фототок диссектора пропорционален интенсивности распределения интерференционного поля

=2

в каждом пикселе X, Y изображения. В электронном блоке определялось локальное значение фазы за период модуляции Т методом временных интервалов. Фазовое изображение в виде матрицы значений с максимальными значениями координат
Мх, Му (0 < X < Мх, 0 < Y < Му) растра сохранялось в компьютере для последующей обработки. Время ввода изображения равно

В фазовом изображении объекта определялась область, в которой необходимо получить информацию о динамических процессах.

4. Параметры временной выборки

В методе ДФМ информацию о флуктуациях ОРХ получают на отрезке с координатами и В фазовом изображении объекта фиксируют координаты и и затем периодически с интервалом выборки



обратно пропорциональна длине скан-линии L, поэтому при заданном периоде модуляции Т = 1 мс необходимо находить компромиссное значение частоты Найквиста и длины скан-линии L.

5. Корреляционный и спектральный анализ

Статистический анализ процессов производился путем обработки -матрицы в математических программах. "Спектральные портреты” позволяли определить спектральную плотность в фиксированных j точках скан-линии и найти "профиль” спектральной компоненты = const. Корреляторы позволяли определить основные статистические характеристики процессов: интенсивность флуктуаций ОРХ (h,(t)2), время когерентности, радиус корреляции, гистограммы и т.п., а также сравнить эти функции с профилем ОРХ h(Xj) и установить связь флуктуаций с морфологией объекта.

Методом ДФМ можно было также получить ограниченную информацию о параметрах трансляционного движения частиц (рис. 5а). Предположим, что сферическая частица диаметра d движется в плоскости х, у с постоянной скоростью v под углом к направлению скан-линии S. На трек-диаграмме (рис. 5б) "след" от пересечения частицей скан-линии за время имеет вид эллипса с углом наклона большой оси ,

.

Горизонтальное сечение эллипса в средней его части дает профиль фазовой высоты и позволяет определить диаметр частицы, профиль которой h(x) показан на рис.5г. Если движение частицы неравномерно и она, например, имеет кроме постоянной компоненты скорости v периодические осцилляции координат с частотой

То на границах ее следа будут наблюдаться характерные осцилляции (рис. 5в). [3]



Заключение

В живой клетке на различных уровнях ее организации одновременно происходит много биохимических реакций и биофизических процессов, которые сопровождаются изменением локальных макроскопических параметров и в принципе могут быть зарегистрированы оптическими методами. Изменения показателя преломления наиболее заметны в фазовых изображениях, которые относятся к широкому классу функциональных изображений. Применение когерентных источников света позволило не только повысить точность измерений в фазовых микроскопах, но также реализовать качественно новый метод динамической фазовой микроскопии (ДФМ). Этот метод основан на равномерной выборке значений ОРХ вдоль скан-линии в фазовом изображении объекта и на последующем спектральном и корреляционном анализе сигналов. Простые физические соображения показывают, что преобладающий вклад во флуктуации ОРХ дают процессы с большим радиусом корреляции, который в случае синхронного движения макромолекул может заметно превосходить их поперечный размер.



Список литературы

1. Bruce A В et al. Molecular Biology of the Cell 3rd ed. (New York: Garland Publ., 1994)

2. Straub M, Hell S W App. Lett. 73 1769 (1998)

3. V.P. Tychinskil Coherent phase microscopy of intracellular processes (Moscow State Institute for Radio-engineering, Electronics and Automation, 2001)

Размещено на Allbest.ru