Вплив наночастинок оксиду цинку на прооксидний та проапоптичний ефекти гліфосату

Размещено на http://www.allbest.ru/

Вплив наночастинок оксиду цинку на прооксидний та проапоптичний ефекти гліфосату

Я.Ю. Петренко, М.М. Корда, Тернопільський національний медичний університет імені І.Я. Горбачевського

Резюме

Незважаючи на повсякденне зростання темпів використання наноматеріалів, недостатньо уваги приділяється можливому негативному впливу наночастинок на здоров'я людей та на безпеку навколишнього середовища. Характерна для наночастинок здатність посилювати транспорт хімічних речовин і лікарських засобів у клітини через бар'єри організму визначає актуальність питання про можливість потенціювання токсичної дії хімічних контамінантів при їх сумісному з наночастинками надходженні в організм.

Мета дослідження -- оцінити інтегральний ефект наночастинок оксиду цинку та хімічного токсиканту гліфосату на ступінь утворення активних форм оксигену і процеси апоптозу та некрозу нейтрофілів крові.

Методи дослідження. Досліди виконані на щурах-самцях, яким вну- трішньошлунково протягом 14 днів вводили у вигляді суспензії 0,5 мл наночастинок ZnO у дозі 100 мг/кг та гліфосат (у формі гербіциду Раундапу) в дозі 250 мг/кг маси тіла. Токсиканти вводили сумісно та окремо. Тварин виводили з експерименту на 15 добу. У нейтрофілах крові за допомогою цитофлюориметричного методу визначали утворення активних форм оксигену за допомогою дихлорфлуоресцеїну діацетату, інтенсивність апоптозу та некрозу -- за рівнем клітин, мічених аннексином V та пропідію йодидом, а також кількість клітин зі зниженим трансмембранним потенціалом мітохондрій.

Результати й обговорення. Максимальні зміни всіх показників виявлено в групі тварин, яким вводили наночастинки ZnO та гліфосат. При цьому у тварин цієї групи вміст активних форм оксигену, рівень апоптич- но та некротично змінених нейтрофілів крові, а також кількість клітин зі зниженим трансмембранним потенціалом мітохондрій збільшувалися достовірно порівняно з тваринами, яким вводили тільки гербіцид.

Висновок. Наночастинки оксиду цинку посилюють здатність гербіциду гліфосату збільшувати вміст внутрішньоклітинних активних форм оксигену, рівень апоптично і некротично змінених нейтрофілів крові, а також кількість клітин зі зниженим мітохондріальним трансмембранним потенціалом.

Ключові слова: наночастинки оксиду цинку, гліфосат, активні форми кисню, апоптоз, некроз.

The effect of zinc oxide nanoparticles on the prooxidant and proapoptic effects of glyphosate

The specific feature of nanoparticles to increase the transport of chemicals into cells through the membranes makes the problem of potentiating the toxic effect of chemical contaminants when they enter the tissues and organs of the body together with nanoparticles an urgent issue.

The purpose of this study was to evaluate the integral effect of zinc oxide nanoparticles and the chemical toxicant glyphosate on the formation of oxygen active forms and the processes of apoptosis and necrosis of blood neutrophils.

Research methods. Male rats were administered intragastrically with 0.5 ml of a ZnO nanoparticles suspension at a dose of 100 mg/kg and glyphosate (in the form of roundup herbicide) at a dose of 250 mg/kg of body weight for 14 days. Toxicants were administered simultaneously and separately. On the 15th day the formation of reactive oxygen species, the number of cells with a reduced mitochondrial transmembrane potential, and the intensity of apoptosis and necrosis were measured in blood neutrophils.

Results and discussion. It was established that the maximum changes of the intensity of release of oxygen active forms, the number of cells with a reduced mitochondrial transmembrane potential, and the level of blood neutrophils with apoptotic and necrotic changes occured in the group of animals that were injected with ZnO nanoparticles together with the glyphosate. It should be noted that in animals of this group all indicators increased significantly compared to rats that were administered with only herbicide.

Conclusion. Zinc oxide nanoparticles enhance the ability of the herbicide glyphosate to enhance the generation of intracellular active forms of oxygen, increase the number of cells with a reduced mitochondrial transmembrane potential, as well as the level of blood neutrophils with apoptic and necrotic changes.

Key words: zinc oxide nanoparticles, glyphosate, reactive oxygen species.

Кількість і різноманітність створюваних наноматеріалів стрімко зростає, а використання нанотехнологій і наноматеріалів стало одним із найперспективніших напрямів розвитку науки і техніки [1].

Наночастинки оксиду цинку (НЧ ZnO) є одними з найпопулярніших серед наночастинок оксидів металів, які виробляють у великій кількості та які знаходять застосування у багатьох промислових продуктах, таких як ґума, фарби, бетон, електроніка, різні покриття [2]. НЧ ZnO також мають багатообіцяючий потенціал використання у медицині, особливо в областях протипухлинної та антибактеріальної терапії, що пов'язано з їх здатністю стимулювати генерацію активних форм кисню (АФО), вивільняти іони цинку та індукувати апоптоз клітин. Крім того, показана ефективність НЧ ZnO для лікування діабету. НЧ ZnO використовують як наповнювачі в ортопедичних і зубних імплантатах, вони також демонструють чудові люмінесцентні властивості, що перетворило їх на одного з важливих кандидатів для біовізуалізації [3]. Завдяки здатності поглинати ультрафіолет наночастинки оксиду цинку дедалі частіше використовують у засобах особистої гігієни, косметичних та сонцезахисних засобах [4, 5].

Ключовою характеристикою НЧ ZnO, що відкриває перспективи їх застосування у медицині, є їхня здатність проникати через клітинні бар'єри і відігравати роль переносників різних молекул, необхідних для лікування та діагностики. Таке широке використання НЧ ZnO не може не викликати побоювань щодо можливих негативних наслідків їх взаємодії з тканинами та органами живих організмів. На сьогодні дані щодо токсичності НЧ ZnO вельми неоднозначні [6, 7, 8, 9].

Здатність НЧ ZnO здійснювати транспортування певних речовин у клітини зумовлює актуальність питання про потенційну можливість посилення токсичної дії класичних полютантів навколишнього середовища при їх сумісному надходженні в організм разом з наночастинками. До глобальних забруднювачів довкілля належать гербіциди, найпоширенішим з яких є гліфосат. Препарати на основі гліфосату застосовують більш ніж у 130 країнах. Останнім часом з'являється дедалі більше нових даних про небезпечність гліфосату, зокрема щодо його онкогенної дії, генотоксично- сті, здатності індукувати апоптоз і некроз в клітинах та спричиняти ендокринні порушення. Також відомо, що гліфосат викликає порушення в імунній системі, такі тяжкі хвороби, як діабет, ожиріння, астму, хворобу Альцгеймера, лімфоми, лейкози у дітей, нейродегенеративні хвороби та інші важкі недуги [10].

Мета дослідження -- оцінити інтегральний ефект наночастинок оксиду цинку та хімічного токсиканту гліфосату на рівень утворення активних форм оксигену і процеси апоптозу та некрозу нейтрофілів крові.

Методи дослідження

В експериментах використовували безпородних щурів-самців масою 180 г. Під час дослідів тварини перебували на стандартному раціоні віварію відповідно до санітарно-гігієнічних норм. Усі етапи експериментів затверджені комітетом з біоетики Тернопільського національного медичного університету імені І. Я. Горбачевського (Протокол № 73 від 3 квітня 2023 р.) та виконані згідно з міжнародними вимогами про гуманне поводження з тваринами відповідно до загальних етичних вимог «Європейської конвенції із захисту хребетних тварин, яких використовують в експериментальних та інших наукових цілях» (Страсбург, 1986).

Піддослідні тварини були поділені на такі групи: І - інтактні (контрольні) щурі, яким одноразово внутрішньошлунково вводили фізіологічний розчин (0,5 мл/кг); ІІ -- щури, яким щоденно внутрішньошлунково впродовж 14-ти діб вводили 0,5 мл суспензії НЧ оксиду цинку у фізрозчині в дозі 100 мг/кг маси тіла; ІІІ -- щури, яким щоденно внутрішньошлунково впродовж 14-ти діб вводили 0,5 мл розчину гербіциду Раундапу з розрахунку дози гліфосату 250 мг/кг маси тіла; XV -- щури, яким щоденно внутрішньошлунково впродовж 14-ти діб вводили 0,5 мл суспензії НЧ оксиду цинку у розчині Раундапу (дози НЧ і гліфосату були такими ж, як у групах ІІ і ІІІ).

Евтаназію щурів здійснювали шляхом кровопускання під тіопентал-на- трієвим наркозом (40 мг/кг маси тварини) на 15-ту добу від початку експерименту.

Застосовували нанопорошок оксиду цинку (ZnO, 99+%, 20-30 nm) виробництва «US Research Nanomaterials, Inc.» (США) і Раундап (Монсанто) з вмістом гліфосату 450 г/л. Диспергування НЧ у фізіологічному розчині чи розчині Раундапу проводили за допомогою ультразвукового диспергатора УЗДН-М750Т (20-25 кГц, 750 Вт) протягом 5 хв.

Після осадження еритроцитів популяцію нейтрофілів крові отримували за допомогою центрифугування лейкоцитарної зависі на подвійному градієнті щільності 1,077 і 1,093 фіколу-верографіну. Після 40 хв центрифугування при температурі 4°С і швидкості 1500 об/хв утворювалися дві фази. Відбирали нижню фазу, яка на 98-99% була популяцією нейтрофілів [11]. Відсоток життєздатних клітин оцінювали у цитометричній камері за реакцією з трипановим синім, при цьому життєздатними вважали незабарвлені клітини. Використовували клітинні суспензії, ступінь забарвленості клітин в яких не перевищувала 25%.

Рівень активних форм оксигену у нейтрофілах крові визначали за допомогою барвника із заблокованою флюоресценцією - дигідродихлорфлюоресцеїну диацетату (ДХФ-ДА) («Sigma Aldrich», USA) за допомогою методу проточної цитофлуориметрії [12, 13].

За присутності внутрішньоклітинних активних форм кисню ДХФ-ДА окислюється до 2,7 - дихлорфлюоресцеїну, який флуоресцує в ділянці зеленого спектра, що дозволяє аналізувати клітини за інтенсивністю свічення барвника. Аналіз зразків клітин проводився на проточному цитометрі Epics XL («Beckman Coulter», США). Значення досліджуваного параметра виражали у відсотках.

Рівень мембранного потенціалу мітохондрій (Ащ) визначали за допомогою методу проточної цитофлуориметрії, використовуючи набір реактивів «MitoScreen» («BD Pharmigen», США) [12, 14], ключовим реагентом якого є флюорохром JC-1. Мономер JC-1 проникає через мітохондріальну мембрану клітини, внаслідок чого всередині мітохондрії формуються JC-1-агрегати, що характеризуються червоним спектром світіння. При деполяризації мітохондріальної мембрани JC-1 не накопичується всередині мітохондрії і знаходиться в цитоплазмі у вигляді мономерної форми, яка характеризується зеленим спектром світіння. Зразки аналізували на проточному цитометрі Epics XL («Beckman Coulter», США), визначаючи процентний вміст нейтрофілів з нормальним значенням Ащ і процент клітин із зниженим значенням Ащ. Результати представляли у відсотках (співвідношення числа нейтрофілів зі зниженим мітохондріальним трансмембранним потенціалом і загальної кількості клітин).

Оцінку апоптозу і некрозу нейтрофілів крові проводили за допомогою методу проточної цитофлуориметрії [15] із використанням FITC-міченого анексину V з набору реагентів «AnNEXIN V FITC» («Beckman Coulter», США). Аналіз зразків проводили на проточному цитометрі Epics XL («Beckman Coulter», США), визначаючи декілька параметрів: мале кутове світлорозсіювання (FSC), що характеризує розмір клітини, бічне світлорозсіювання (SSC), що характеризує цитоплазматичні, а також мембранні особливості клітини, і показник зеленої флюоресценції (флюоресцеїн ізотіоціанат -- FITC -- 530 нм). Досліджувану популяцію клітин розміщали в координатах FSC і SSC, потім аналізували на наявність флуоресценції в координатах на основі Dot Plot (двопараметрична гістограма). Отримані результати представляли у відсотках (співвідношення числа аннексин-позитивних клітин до загальної кількості фракції нейтрофілів). Дискримінаційний аналіз типу клітинної смерті включав: 1-й квадрант - клітини негативні за анексином і позитивні за PI -- некроз; 2-й квадрант -- нейтрофіли позитивні за PI і анексином -- пізня стадія апоптозу або некроз; 3-й квадрант -- нейтрофіли негативні за PI і анексином -- життєздатні клітини; 4-й квадрант -- нейтрофіли, позитивні за анексином і негативні за PI -- рання стадія апоптозу.

Статистичну обробку цифрових даних здійснювали за допомогою програмного забезпечення STATISTICA 6.0 з використанням параметричних методів оцінки одержаних даних. Для всіх показників розраховували значення середньої арифметичної вибірки (M), її дисперсії і помилки середньої (m). Достовірність різниці значень між незалежними кількісними величинами встановлювали за допомогою критерію Манна--Уїтні. Зміни вважали статистично достовірними, коли р<0,05.

Результати й обговорення. Відомо, що, порівняно з іншими клітинами організму, продукція АФО є найбільш значущою в нейтрофільних лейкоцитах. Індукція окисного стресу ініціює розвиток програмованої загибелі нейтрофілів, які швидко вступають на шлях спонтанного апоптозу, що не потребує будь-якого зовнішнього сигналу для їх відмирання.

Введення дослідним тваринам наночастинок ZnO в дозі 100 мг/кг маси тіла тварин супроводжувалося зростанням генерації активних форм оксигену нейтрофілами крові та збільшенням кількості клітин зі зниженим мітохондріальним трансмембранним потенціалом, проте такі зміни виявилися статистично недостовірними.

На відміну від групи тварин, які отримували наночастинки ZnO, введення щурам гліфосату у формі гербіциду Раундапу в дозі 250 мг/кг маси тіла зумовило виражені зміни досліджуваних показників. Так, генерація активних форм оксигену нейтрофілами крові достовірно (в 1,9 раза, p<0,05) зростала порівняно з показниками контрольної групи тварин. Під впливом гербіциду в 1,7 раза (p<0,05) також зростала кількість нейтрофілів зі зниженим мітохондріальним трансмембранним потенціалом порівняно із показниками інтактних тварин.

Найбільш суттєві зміни показників зареєстровано у групі тварин, яким сумісно вводили НЧ ZnO та гліфосат. У цьому випадку генерація активних форм оксигену нейтрофілами крові була максимальною і в 3,1 раза (p<0,05) перевищувала показники контролю. Також у 2,8 раза (p<0,05) зростала кількість клітин зі зниженим мітохондріальним трансмембранним потенціалом порівняно з показниками контрольної групи тварин, що може якраз бути наслідком посиленого утворення АФО в клітинах (табл. 1). Важливо зазначити, що у групі тварин, яким вводили наночастинки і гліфосат, досліджувані показники були достовірно вищими порівняно з тваринами, які отримували тільки гліфосат. Очевидно, це свідчить про те, що наночастинки посилюють здатність гербіциду стимулювати утворення радикалів кисню у нейтрофілах крові.

Після введення дослідним тваринам НЧ ZnO досліджувана популяція нейтрофілів характеризувалася переважно живими і невеликою кількістю апоптичних і некротичних клітин -- підвищення вмісту PI+ і AnV+ нейтрофілів було незначним і ці показники статистично не відрізнялися від таких у контрольних тварин (табл. 1).

На відміну від групи щурів, які отримували НЧ ZnO, введення гербіциду гліфосату в дозі 250 мг/кг маси тіла тварин викликало достовірні зміни показників апоптозу і некрозу гепатоцитів. Так, рівень РІ+ клітин, які характеризують інтенсивність некротичних процесів, перевищував показник норми в 1,6 раза (p<0,05). Відсоток ANV+ нейтрофілів, який відповідає за ранній апоптоз, перевищував аналогічний показник контрольної групи тварин в 1,9 раза (р<0,05).

Таблиця 1. Вплив наночастинок оксиду цинку та гліфосату на вміст активних форм оксигену та показники апоптозу нейтрофілів (М±ш, n=8)

Примітки: ' -- зміни достовірні порівняно з показниками контрольних тварин (p<0,05); · - зміни достовірні порівняно з показниками тварин, яким вводили гліфосат (p<0,05). N -- кількість тварин у групі.

Найбільшою мірою інтенсивність процесів апоптозу і некрозу нейтрофілів крові підвищувалася у щурів, яким вводили наночастинки оксиду цинку разом з гліфосатом. У тварин цієї групи відсоток РІ+ клітин перевищував норму в 2,5 раза (р<0,05), а відсоток ANV+ нейтрофілів - у 3,4 раза (р<0,05). Як і у випадку з показниками, що характеризують інтенсивність утворення АФО і кількість клітин зі зниженим мітохондріальним трансмембранним потенціалом, відсотки РІ+ і AnV+ нейтрофільних лейкоцитів у групі тварин, які піддавалися комбінованому впливу наночастинок і хімічного токсину, були достовірно вищими порівняно з такими у щурів, яким вводили тільки гліфосат.

Активація програмованої клітинної загибелі, яка є найважливішим механізмом контролю клітинних популяцій у багатоклітинному організмі, безпосередньо пов'язана з розвитком оксидативного стресу [16]. Зі свого боку, причиною оксидативного стресу при дії на клітини хімічних токсикантів, у тому числі і гліфосату, можуть бути кілька факторів, зокрема, здатність токсину впливати на експресію генів, які відповідальні за синтез антиоксидантних ензимів, або його вплив на процеси синтезу таких білків на рівні рибосом [17], можливість стимуляції під впливом токсину внутрішньоклітинних каскадних механізмів із залученням прозапальних цитокінів, які зумовлюють посилення генерації АФО, безпосередній вплив токсину на антиоксиданти ензиматичної чи неензиматичної природи, зокрема, його здатність блокувати функціональні амінокислотні групи в молекулах ензимів чи, наприклад, сульфгідрильні групи відновленого глутатіону [18, 19].

Активні форми оксигену призводять до дезінтеграції внутрішньої мі- тохондріальної мембрани, що викликає падіння мітохондріального трансмембранного потенціалу, набухання матриксу з наступним розривом зовнішньої мембрани мітохондрій і звільненням проапоптотичних протеїнів (AIF, Smac, прокаспаза 9, цитохром с) із міжмембранного простору в цитозоль. Вихід цитохрому с призводить до значного підвищення внутрішньоклітинного вмісту АФО, активації каспазного каскаду і, в результаті, до апоптозу [20, 21]. У роботі [22] показано, що під впливом гліфосату знижується потенціал мітохондріальної мембрани й активується апоптоз клітин, що зумовлено надекспресією апоптичних генів каспази-3 і каспази-4 і зниженням рівня експресії антиапоптичних генів Survivin і BCL-XL.

Отримані нами дані, які свідчать про здатність НЧ ZnO посилювати негативні ефекти гербіциду на нейтрофіли, найбільш імовірно обумовлені здатністю наночастинок здійснювати транспортування гліфосату всередину клітини через плазматичну мембрану, що призводить до підвищення концентрації токсину в цитоплазмі клітин крові. Крім того, НЧ, завдяки їх унікальним специфічним властивостям (наявність заряду й електронної провідності, висока реакційна здатність поверхні, фотохімізм), здатні безпосередньо впливати на біомембрани та макромолекули, пошкоджувати ДНК, порушувати процеси метаболізму ксенобіотиків в ендоплазматичному ретикулумі, що може призвести до потенціювання токсичного ефекту гліфосату.

Висновок

Наночастинки оксиду цинку здатні посилювати прооксидний ефект гліфосату на нейтрофіли крові, а також його проапоптичний і пронекротичний ефекти.

цинк кров оксисен гліфосат

Посилання

1. Pratima A.N. Nanotechnology and its Applications in Medicine. Medicinal Chemistry. 2015;5(2): 081-089.

2. Jiang J., Cai J. The advancing of zinc oxide nanoparticles for biomedical applications. Bioinorganic Chemistry and Applications. 2018;

3. Mirzaei H., Darroudi M. Zinc oxide nanoparticles: biological synthesis and biomedical applications. Ceramics International. 2017; 43 (1): 907-914.

4. Трахтенберг І.М., Дмитруха Н.М. Наночастинки металів, методи отримання, сфери застосування, фізико--хімічні та токсичні властивості. Український журнал з проблем медицини праці. 2013; 4 (37): 62--74.

5. Zhang Y., Nayak T.R., Hong H., Cai W. Biomedical applications of zinc oxide nanomaterials. Current molecular medicine. 2013;13(10): 1633-1645.

6. Леоненко Н.С., Демецька О.В., Леоненко О.Б. Особливості фізико-хімічних властивостей та токсичної дії наноматеріалів -- до проблеми оцінки їхнього небезпечного впливу на живі організми (огляд літератури). Сучасні проблеми токсикології, харчової та хімічної безпеки. 2016;1: 64--77.

7. Silva E.Da., Kembouchea Y., Tegnera U., Baunb A., Keld A. Jensen Interaction of biologically relevant proteins with ZnO nanomaterials: Aconfounding factor for in vitro toxicity endpoints. Toxicology in Vitro. 2019;56:41-51.

8. Akhtar M.J., Ahamed M., Kumar S., Khan M.M., Ahmad J., Alrokayan SA. Zinc oxide nanoparticles selectively induce apoptosis in human cancer cells through reactive oxygen species. International Journal of Nanomedicine. 2012;7:845-57.

9. Sharma V., Anderson D., Dhawan A. Zinc oxide nanoparticles induce oxidative DNA damage and ROS-triggered mitochondria mediated apoptosis in human liver cells (HepG2). Apoptosis. 2012; 17(8): 852-70.

10. Tarazona J.V., Court-Marques D., Tiramani M., Reich H., et al. Glyphosate toxicity and carcinogenicity: a review of the scientific basis of the European Union assessment and its differences with IARC. Arch Toxicol. 2017; 91:2723-2743.

11. Нейко Є.М., Герич П.Р., Островський М.М., Томащук Л.М. Кисень залежні функції фагоцитів у хворих на хронічне обструктивне захворювання легень. Здобутки клінічної і експериментальної медицини. 2010;1:100-104.

12. John J. Haddad. Redox regulation of pro-inflammatory cytokines and IkB a/ NF-kB nuclear translocation and activation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 2002; 296(4): 847-856.

13. Elbim C., Lizard G. Flow cytometric investigation of neutrophil oxidative burst and apoptosis in physiological and pathological situations. Cytometry A. 2009; 75(6): 475-481.

14. Noseykina E.M., Schepetkin I.A., Atochin D.N. Molecular Mechanisms for Regulation of Neutrophil Apoptosis under Normal and Pathological Conditions. J Evol Biochem Physiol. 2021;57(3):429-50.

15. Fox S., Leitch A.E., Duffin R., Haslett C., Rossi A.G. Neutrophil apoptosis: relevance to the innate immune response and inflammatory disease. J Innate Immun. 2010;2(3):216-227.

16. Kwiatkowska M., Michalowicz J., Jarosiewicz P., Pingot D., Sicinska P., et al. Evaluation of apoptotic potential of glyphosate metabolites and impurities in human peripheral blood mononuclear cells (in vitro study). Food and Chemical Toxicology. 2020; 135,

17. De Melo M.S., Nazari E.M., Mtiller Y.M.R., Gismondi E. Modulation of antioxidant gene expressions by Roundup® exposure in the decapod Macrobrachium potiuna. Ecotoxicol. Environ. Saf. 2020; 190:1100-1186.

18. Tang Q., Tang J., Ren X., Li C. Glyphosate exposure induces inflammatory responses in the small intestine and alters gut microbial composition in rats. Environ. Pollut. 2020. 261:114129.

19. Qiu S., Fu H., Zhou R., Yang Z., Bai G., Shi B. Toxic effects of glyphosate on intestinal morphology, antioxidant capacity and barrier function in weaned piglets. Ecotoxicol. Environ. Saf. 2020. 187:109846.

20. Sharma V., Singh P., Pandey A.K., Dhawan A. Induction of oxidative stress, DNA damage and apoptosis in mouse liver after sub-acute oral exposure to zinc oxide nanoparticles. Mutation Research. 2012; Jun 14; 745(1-2): 84-91.

21. Goldblatt Z.E., Cirka H.A., Billiar K.L. Mechanical Regulation of Apoptosis in the Cardiovascular System. Ann Biomed Eng. 2021; 49(1):75-97.

22. Zhao Y., Sun J., Zhang X., Jin Q., Gao Q. Glyphosate decreases bovine oocyte quality by inducing oxidative stress and apoptosis. Zygote. 2022 Oct;30(5):704-711.

Размещено на Allbest.ru