Роль регуляторів передачі сигналів G-білка сітківки людини на активність ГТФ-ази трансдуцину

Размещено на http://www.allbest.ru/

Роль регуляторів передачі сигналів G-білка сітківки людини на активність ГТФ-ази трансдуцину

Грановський Олексій Едуардович

PhD, доцент кафедри анатомії, фізіології людини та тварин

ДЗ "Луганський національний університет імені Тараса Шевченка", Україна

Внутрішня ГТФ-азна активність трансдуцину контролює інактивацію ефекторного ферменту, цГМФ-фосфодіестерази (ФДЕ), під час вимкнення зорового сигналу. Показано, що інгібіторна Y-субодиниця ФДЕ (Py), неідентифікований мембранний фактор і специфічний для сітківки член родини білків регуляторів передачі сигналів G- білка (RGS) прискорює гідроліз ГТФ трансдуцином. Ми експресували людський гомолог специфічного для сітківки миші RGS (hRGSr) у Escherichia coli та досліджували його роль у регуляції активності ГТФ-ази трансдуцину. Як і інші білки RGS, hRGSr взаємодіяв переважно з перехідною конформацією а-субодиниці трансдуцину, GtaGDPAlF4^-, тоді як його зв'язування з GtaGTPYS або GtaGDP було слабким. hRGSr і Py не конкурували за взаємодію з GtaGDPAlF4^-. Спорідненість взаємодії' Py- GtaGDPAlF4^- була помірно посилена додаванням hRGSr, яка виміряна за допомогою флуоресцентного аналізу зв'язування GtaGDPAlF4^- з Py, міченим 3-(бромацетил)-7-діетиламінокумарином (PyБК). Зв'язування hRGSr з GtaGDPAlF4^- у комплексі з PYБК призвело до максимального зниження флуоресценції БК на 40%, що дозволило оцінити афінність hRGSr до GtaGDPAlF4^- (Kd 35 нт). В одному дослідженні обороту hRGSr прискорював ГТФ-азну активність трансдуцину, відновленого за допомогою мембран зовнішнього сегмента стрижня (ЗСС), позбавленого сечовини, більш ніж у 10 разів до швидкості 0,23 с^-1. Додавання Py до відновленої системи знижувало рівень ГТФази, прискореної hRGSr (kcat 0,085 с^-1). ГТФ-азна активність трансдуцину та швидкість інактивації ФДЕ в нативних мембранах ЗСС у присутності hRGSr були підвищені в 3 рази або більше, незалежно від концентрацій мембрани.

У суспензіях ЗСС, що містять 30 цм родопсину, ці швидкості перевищували 0,7 с^-1. Наші дані свідчать про те, що ефекти hRGSr на активність ГТФ-ази трансдуцину послаблюються Py, але не залежать від ймовірного білкового фактора, що активує мембранну ГТФ-азу. Швидкість активності ГТФ-ази трансдуцину в присутності hRGSr є достатньою, щоб корелювати її з кінетикою відключення зорового каскаду in vivo. Ключові слова: фосфодіестерази (ФДЕ), регулятори передачі сигналів G-білка (RGS), сітківка, Y-субодиниця (Py), трансдуцин. фоторецепторних клітинах хребетних сигнал передається від світлоактивованого родопсину до ефекторного ферменту цГМФ - фосфодіестерази (ФДЕ) через гетеротримерний G-білок трансдуцин (Gtapy). GTP- зв'язана a-субодиниця трансдуцину (GtaGTP) знімає інгібування, яке

Накладається двома інгібіторними у-субодиницями ФДЕ (Py) на каталітичні ар субодиниці ферменту (РаР). Активація ФДЕ призводить до закриття цГМФ- керованих каналів у плазматичних мембранах фоторецепторів [1]. Інактивація ФДЕ є критичним компонентом механізму вимикання в каскаді зорової трансдукції. Ця інактивація контролюється внутрішньою ГТФазною активністю трансдуцину, яка гідролізує ГТФ до ГДФ. Зв'язаний з GDP Gta (GtaGDP) має суттєво знижену спорідненість до Ру і вивільняє Ру для повторного інгібування Pap [1]. Швидкість гідролізу GTP трансдуцином, виміряна in vitro, є надто низькою, щоб пояснити швидке вимикання фотовідповіді in vivo [2]. Було показано, що Ру - субодиниця і окремий мембранно-асоційований білковий фактор підвищують активність трансдуцину ГТФ-ази в активованому мембранозв'язаному комплексі трансдуцин-ФДЕ до рівня, порівнянного зі швидкістю інактивації трансдуцину в природних умовах. Нещодавнє дослідження показало, що специфічний для сітківки член сімейства RGS, RGSr, служить білком, що активує ГТФ-азу (ГАБ) для трансдуцину, надаючи додатковий вимір і без того складній картині регуляції активності ГТФ-ази трансдуцину [3]. Функціональні зв'язки між RGSr, у- субодиницею ФДЕ та ймовірним мембранним фактором ГАБ наразі не з'ясовані.

В цій роботі ми вивчаємо взаємодію між трансдуцином і специфічним RGS сітківки людини (hRGSr), а також регуляцію активності ГТФ-ази трансдуцину за допомогою hRGSr. Мета роботи дослідити вплив Ру і концентрації мембрани фоторецепторів на модуляцію активності ГТФ-ази hRGSr. трансдуцин сітківка мембрана

Послідовність, що кодує людський гомолог білка RGSr сітківки миші, була ампліфікована полімеразною ланцюговою реакцією з бібліотеки кДНК сітківки, субклонована у вектор pGEX-KG і експресована як злитий білок GST.

Щоб визначити, чи може Ру конкурувати з hRGSr за взаємодію з GtaGDPAlF4^-, ми спочатку протестували вплив Ру на зв'язування GtaGDPAF^- з GST-hRGSr. Навіть при високих концентраціях (до 30 рм) Ру не впливав на зв'язування GtaGDPAF^- з GST-hRGSr, іммобілізованим на глутатіон-агарозі. Далі ми досліджували вплив hRGSr на взаємодію між Ру і GtaGDPAlF4^- або GtaGTPyS за допомогою флуоресцентного аналізу. Додавання GtaGDPAlF4^- до флуоресцентно міченого Ру, РуБК, спричинило максимальне збільшення флуоресценції БК приблизно в 7,5 разів, тоді як GtaGTPyS посилив флуоресценцію РуБК більш ніж у 6 разів. Значення Kd для зв'язування GtaGDPAF^- і GtaGTPyS з РуБК становили 2,8 ± 0,1 і 2,1 ± 0,1 пм відповідно.

Афінність зв'язування GtaGDPAF^- з РуБК була дещо вищою в присутності 100 пм hRGSr (Kd 1,2 ± 0,1 пм), що свідчить про те, що hRGSr і Ру зв'язуються з GtaGDPAlF4^- неконкурентно. Додавання hRGSr не вплинуло на флуоресценцію лише РуБК, але призвело до залежного від дози зниження посилення флуоресценції РуБК, спричиненого зв'язуванням останнього з GtaGDPAlF4^-.

Флуоресценція була знижена максимально на 40% з IC 50 35 пм. Оскільки hRGSr і Ру взаємодіють з GtaGDPAF^- неконкурентно, це значення IC50 може служити оцінкою спорідненості взаємодії hRGSr з GtaGDPAF^-. У контрольних експериментах hRGSr не впливав на флуоресценцію комплексу GtaGTPyS*PyБК.

Вимірювання активності ГТФ-ази з однократним обертанням. Спочатку вимірювали активність ГТФ-ази трансдуцину у відновленій системі з мембранами сЗСС. Відповідно до попередніх досліджень, мембрани сЗСС не мають активності GAP мембранного фактора, а субодиниця Py не впливала на активність ГТФ-ази трансдуцину при використанні мембран сЗСС [4]. Розрахована швидкість гідролізу ГТФ трансдуцином (0,4 рм), відновленим за допомогою сЗСС, що містить 5 рм родопсину, становила 0,022+0,001 с^-1. Додавання 1 рм hRGSr призводило до прискорення активності ГТФ-ази більш ніж у 10 разів (k = 0,23 ± 0,01 с^-1). Базальна ГТФ-азна активність трансдуцину істотно не змінювалася в присутності 1 рм Py (k = 0,019 ± 0,003 с^-1). Проте Py суттєво знижував прискорену ГТФ-азну активність комплексу Gt+hRGSr (k = 0,085 ± 0,005 с^-1). У контрольних експериментах hRGSr, Py або обидва білки разом не мали помітного впливу на зв'язування [³⁵S] GTPyS з трансдуцином за аналогічних умов. Реакція була завершена менш ніж за 2 с.

Базальна ГТФ-азна активність трансдуцину в суспензії необроблених нативних мембран ЗСС, що містить 5 рм родопсину та 0,41 рм трансдуцину, була вищою (k = 0,052 ± 0,002 с^-1), ніж у відновленій системі з сЗСС. Однак підвищення активності трансдуцин-ГТФ-ази за допомогою hRGSr було лише в 3,3 рази (k = 0,17 ± 0,01 с^-1). можливо, наявність ФДЕ, що містить субодиницю Py, у нативних препаратах ЗСС перешкоджала більшому посиленню активності ГТФази шляхом hRGSr, як видно за допомогою сЗСС. Щоб перевірити цю ідею, ми підготували гіпотонічно промиті дЗСС мембрани, збіднені ФДЕ. Активність ГТФ- ази в суспензіях дЗСС, що містять 5 рм родопсину і 0,38 рм трансдуцину (k = 0,031 ± 0,001 с^-1), прискорювалася в 7,5 разів (k = 0,23 ± 0,02 с^-1) з додаванням hRGSr. Субодиниця Py збільшила активність ГТФ-ази трансдуцину більш ніж у 2 рази до швидкості 0,075 ± 0,003 с^-1. Вплив hRGSr і Py на трансдуцин не був адитивним [5].

Крім того, ГТФ-азна активність трансдуцину була нижчою в присутності як hRGSr, так і Py (k = 0,18 ± 0,01 с^-1), ніж у присутності одного hRGSr. Цікаво, що hRGSr підвищував швидкість ГТФ-ази в суспензіях необроблених ЗСС до рівнів, подібних до тих, що були в суспензіях мембран дЗСС, відновлених Py.

Було показано, що ГТФ-азна активність трансдуцину підвищується зі збільшенням концентрації ЗСС мембран, ймовірно, через дію передбачуваного мембранного фактора GAP [4].

При низьких концентраціях ЗСС-мембран комплекс GtaGTP^Py дисоціює з PaP і є переважно розчинним. Збільшення мембранної концентрації зміщує рівновагу в бік мембраннозв'язаного комплексу (GtaGTP^PaPy2 [6], що дозволяє взаємодіяти GtaGTP із передбачуваним фактором GAP.

Розрахована швидкість гідролізу ГТФ у суспензії нативних ЗСС-мембран, що містить 30 рм родопсину, була в 3 рази вищою (k = 0,16 ± 0,02 с^-1), ніж при використанні 5 рм родопсину. hRGSr був принаймні таким же ефективним при більш високих концентраціях мембран ЗСС, як і в розбавлених суспензіях ЗСС. ми оцінили, що швидкість гідролізу ГТФ в суспензіях ЗСС, що містять 30 рм родопсину в присутності 1 рм hRGSr, становить 0,7 с^-1.

Прискорення інактивації ФДЕ hRGSr. ми виміряли інактивацію ФДЕ в суспензіях вибілених нативних мембран ЗСС за допомогою аналізу виділення протонів. Активацію та інактивацію ФДЕ контролювали після додавання ГТФ в умовах одноразового обертання за допомогою рН-мікроелектрода.

Активність ФДЕ була максимальною менш ніж через 1 с після додавання ГТФ. Тому ми не змогли вирішити фазу активації. Як було показано раніше, швидкість інактивації ФДЕ може бути добре апроксимована, підігнавши фазу інактивації з єдиною експоненціальною функцією спаду (4). Активність ФДЕ в аналізі пропорційна концентрації активного GtaGTP.

Зміну рН внаслідок гідролізу цГМФ в умовах одноразового обертання ГТФ можна описати за допомогою експоненціальної функції: рН = ApH max (1 -e^-kt) або [цГМФ]гідролізований = A [цГМФ]max(1-e^-kt). Активність ФДЕ є похідною цієї функції, і вона спадає з константою інактивації k з рівняння вище. У розведених суспензіях нативних ЗСС (5 рм родопсину) ФДЕ інактивувалась зі швидкістю 0,096 с^-1.

У присутності hRGSr швидкість інактивації ФДЕ посилювалася до 0,31 с^-1. Збільшення /Сінакт (0,3 рази) добре корелювало зі зменшенням максимальних кількостей цГМФ, гідролізованого в присутності hRGSr. Крім того, прискорення інактивації ФДЕ, спричинене hRGSr, було пропорційним підвищенню активності ГТФ-ази трансдуцину.

Далі ми перевірили вплив концентрації ЗСС на мембрані на модуляцію інактивації ФДЕ hRGSr.

Швидкість інактивації ФДЕ (0,26 с^-1) була значно вищою в суспензіях мембран ЗСС, що містять 30 рМ родопсину, ніж у розведених суспензіях ЗСС. Однак ця підвищена швидкість не супроводжувалася еквівалентним зниженням максимальної кількості гідролізованого цГМФ, оскільки початкова активність ФДЕ після додавання ГТФ була вищою. Раніше було показано, що активація ФДЕ трансдуцином більш ефективна при вищих концентраціях фоторецепторних мембран [5]. Додавання 1 рм hRGSr до мембран ЗСС, що містять 30 рм родопсину, призвело до 3-кратного збільшення швидкості інактивації ФДЕ. Швидкість інактивації ФДЕ досягала 0,75 с^-1 і добре корелювала зі швидкістю ГТФ-ази (0,7 с^-1), виміряною за тих же умов. Щоб визначити, чи може hGRSr служити антагоністом ФДЕ і блокувати активацію ферменту, ми виміряли вплив hRGSr на GTPyS-індуковану активність ФДЕ в суспензіях мембран ЗСС, що містять 5 рм родопсину. Швидкості індукованого GTPyS гідролізу цГМФ істотно не впливали на hRGSr. У присутності відносно високих концентрацій hRGSr (5 рМ) активність ФДЕ пригнічувалася лише на 1 5%.

Висновки

Ми досліджували регуляцію активності ГТФ-ази трансдуцину RGSr людини та вивчили вплив Ру і концентрації мембрани фоторецепторів на функціональну активність hRGSr. Наші результати підтверджують дані про те, що RGS сітківки тісно зв'язується з перехідною конформацією трансдуцину, GtaGDPAlF4^-, і розширюють це спостереження, показуючи, що він також слабко взаємодіє з GtaGTPyS і GtaGDP. Використовуючи флуоресцентний аналіз взаємодії між РуБК і GtaGDPAlF4^-, ми продемонстрували, що Ру і hRGSr взаємодіють з GtaGDPAlF4^- неконкурентно.

Крім того, афінність взаємодії Ру/ GtaGDPAF^- була помірно посилена в присутності hRGSr. Це збільшення афінності може відображати стабілізацію конформації GtaGDPAF^-, яка взаємодіє з Ру з високою афінністю. Зв'язування hRGSr з GtaGDPAlF4^- впливає на конформацію Gta, що призвело до зменшення максимального посилення флуоресценції, викликаного зв'язуванням

GtaGDPAF^- з РуБК. Ми використали цей ефект для оцінки спорідненості взаємодії hRGSr/ GtaGDPAlF4^- (~35 нм). Цікаво, що GtaGTPyS і GtaGDPAlF4^- мали однакову високу спорідненість до Ру і значно різну спорідненість до hRGSr, що підтверджує висновок, що GtaGDPAlF4^- має різні інтерфейси для взаємодії з Ру і hRGSr.

Зв'язування білків RGS з ділянками перемикання G-білків підтверджує ідею, що білки RGS можуть служити антагоністами для деяких ефекторів [7]. У наших експериментах початкові швидкості гідролізу цГМФ у суспензіях мембран ЗСС після додавання ГТФ не змінювалися в присутності hRGSr. Подібним чином hRGSr мало впливає на активність ФДЕ в мембранах ЗСС, стимульованих GTPyS. Схоже, що основний спосіб дії RGS у сигнальній системі трансдуцин/ФДЕ полягає у прискоренні G-білка та інактивації ефектора, а не в блокуванні активації ефектора.

Вимірювання активності ГТФ-ази в умовах одноразового обертання, представлене в цьому дослідженні, демонструє, що hRGSr може різко збільшити kcat гідролізу ГТФ трансдуцином.

Вплив hRGSr на активність ГТФ-ази трансдуцину був послаблений, але не усунений Ру. Навіть у присутності Ру, hRGSr прискорював активність ГТФ-ази в 3 рази. Наші дані вказують на те, що Ру послаблює ефекти RGSr алостерично, а не конкурентно. Згідно з попередніми спостереженнями, швидкість гідролізу ГТФ була значно вищою в більш концентрованих суспензіях фоторецепторних мембран [4]. hRGSr був настільки ж потужним, як і GAP для трансдуцину, незалежно від концентрації мембрани, що вказує на те, що: по-перше, ймовірний фактор GAP мембрани для трансдуцину являє собою окремий білок, не схожий на RGS, і по-друге, мембранний фактор не конкурує з hRGS для зв'язування з трансдуцином. Нещодавно виявлений другий специфічний для сітківки білок RGS (RET-RGS1) є мембранозв'язаним білком і тому є потенційним кандидатом на ймовірний фактор GAP [8]. Наше дослідження показує, що RET - RGS1 і неідентифікований фактор GAP, ймовірно, є різними білками. Швидкість інактивації ФДЕ збільшувалася за допомогою hRGSr пропорційно прискоренню швидкості ГТФ-ази. Наші дані підтверджують висновок, що активність ГТФ-ази трансдуцину контролює інактивацію ФДЕ [5]. Швидкості гідролізу GTP та інактивації ФДЕ (0,7 с^-1), що спостерігаються при відносно високих концентраціях мембран фоторецепторів у присутності RGS, є адекватними для пояснення швидкої кінетики вимкнення в каскаді візуальної трансдукції in vivo.

Список використаних джерел

1. Artemyev, N. O.(1997). Binding of Transducin to Light-Activated Rhodopsin Prevents Transducin Interaction with the Rod cGMR Rhosphodiesterase y- Subunit. Biochemistry .36 (14), 4188-4193. https://doi.org/10.1021 /bi963002y

2. Schnapf, J. L., Nunn, B. J., Meister, M., & Baylor, D. A. (1990). Visual transduction in cones of the monkey Macaca fascicularis. The Journal of physiology, 427, 681-713. https://doi.org/10.1113/jphysiol.1990.sp018193

3. Chen, C. K., Wieland, T., & Simon, M. I. (1996). RGS-r, a retinal specific RGS protein, binds an intermediate conformation of transducin and enhances recycling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 93(23), 12885-12889. https://doi.org/10.1073/pnas.93.23.12885

4. Angleson J.K., & Wensel, T.G. (1994). Enhancement of rod outer segment GTPase accelerating protein activity by the inhibitory subunit of cGMPphosphodiesterase. Journal of Biological Chemistry, 269(23), 16290-16296. https://doi.org/10.101 6/S0021 -9258(17)34006-1.

5. Грановський, О. (2024). Роль субодиниць Py в механізмах пригнічення активності фосфодіестераз (ФДЕ). Scientific Collection "InterConf+", (44(197), 282-286. https://doi.org/10.51582/interconf.19-20.04.2024.029

6. Aplin, C., Cerione, Richard A. (2024). Probing the mechanism by which the retinal G protein transducin activates its biological effector PDE6.Journal of Biological Chemistry, 300 (2), 105608. https://doi.org/10.1016/j.jbc.2023.105608

7. Gulati, G., Gaonkar, K.S., Kamraj, B. et al. (2012). Structure based energy calculation to determine the regulation of G protein signalling by RGS and RGS-G protein interaction specificity. Interdiscip Sci Comput Life Sci 4, 173-182. https://doi.org/10.1007/s12539- 012-0130-0

8. Tian, M., Ma, Y., Li, T., Wu, N., Li, J., Jia, H., Yan, M., Wang, W., Bian, H., Tan, X., & Qi, J. (2022).

9. Functions of regulators of G protein signaling 16 in immunity, inflammation, and other diseases. Frontiers in molecular biosciences, 9, 962321. https://doi.org/10.3389/fmolb.2022.962321

Размещено на Allbest.ru