Розробка технології отримання фактора VIII зсідання крові з використанням макропористих кремнеземних сорбентів із іммобілізованими активними барвниками

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Розробка технології отримання фактора VIII зсідання крові з використанням макропористих кремнеземних сорбентів із іммобілізованими активними барвниками

Н.О. Шурко, Т.В. Даниш

Державна установа «Інститут патології крові та трансфузійної медицини НАМН України», Львів, Україна

Резюме

виробництво білків плазми крові препарат фактора зсідання крові

Актуальність. Фракціонування білків плазми крові залишається важливим біотехнологічним підходом з метою одержання терапевтичних препаратів, необхідних для лікування низки хвороб людини, особливо захворювань крові. Для забезпечення оптимальної терапії пацієнтів останніми роками особливо розвивалась технологія виробництва білків плазми крові, зокрема фактора зсідання VIII (FVIII). Основним промисловим методом отримання плазмового препарату FVIII був і залишається метод іонообмінної хроматографії. Стаття присвячена розробці нової технології одержання очищеного препарату FVIII зсідання крові, яка поєднує методи фракціонування, іонообмінної та барвник-лігандної хроматографій.

Мета роботи: розробка методу одержання високоактивного препарату фактора VIII зсідання крові із застосуванням біоспецифічних кремнеземних сорбентів із іммобілізованими активними барвниками.

Матеріали і методи. Фракціонування, іонообмінна та барвник-лігандна хроматографії.

Результати. Створено нову технологію отримання високоочищеного препарату FVIII зсідання крові. Продемонстровано, що використання іонообмінної та барвник-лігандної афінної хроматографії дозволяє отримати FVIII з Кріопре- ципітату зі ступенем очищення від 129 до 242 разів та збереження до 73-76% початкової активності. Явище негативної афінної сорбції забезпечує майже 96% вихід продукту, а основні втрати від початкової активності FVIII (до 27%) відбулися саме на стадії іонообмінної хроматографії. Було встановлено, що комбінація стадій попередньої фракціонування, іонообмінної та афінної хроматографії забезпечує ступінь очищення 239-700 разів, залежно від типу сорбенту.

Висновки. Створена нова технологія очищення FVIII зсідання крові. Отримано препарат FVIII з максимальною специфічною активністю (50,58 ±1,68) МО/мг білка.

Ключові слова: фракціонування плазми; хроматографія; активні барвники, фактор VIII зсідання крові.

Abstract

CREATION OF TECHNOLOGY OF OBTAINING OF BLOOD COAGULATION FACTOR VIII WITH THE USE OF MACROPOROUS SILICA SORBENTS WITH IMMOBILIZED ACTIVE DYES

N.O. Shurko, T.V. Danysh

State Institution «Institute of Blood Pathology and Transfusion Medicine of NAMS of Ukraine», Lviv, Ukraine

Background. The fractionation of human plasma remains important method the biotechnological approach to make life-saving protein therapeutics required to treat many human diseases, especially blood diseases. The technology for the production of blood plasma proteins, in particular factor VIII coagulation (FVIII), have evolved in the last few years to provide optimized therapy to patients. The ion-exchange chromatography remains a main method of obtaining ofplasma concentrate of FVIII. The active dyes are important alternatives to natural ligands for specific affinity chromatography. The paper is devoted to development of a new method to obtain purified preparation of the blood coagulation FVIII in combination with fractionation methods, ion exchange and affinity dye-ligand chromatography. Purpose of the study: to develop a method of obtaining of highly active concentrate of blood coagulation FVIII with the use of affinity chromatography on dye-silica carriers.

Materials and methods. Precipitation of proteins, ion-exchange chromatography and dye-ligands affinity chromatography.

Results. We have created a new technology for obtaining a highly purified preparation of the blood coagulation FVIII. It has been demonstrated that the use of ionexchange chromatography and dye-ligand affinity chromatography allows obtaining FVIII from Cryoprecipitate with a degree of purification of 129 to 242 times and preservation of up to 73-76% of the initial activity. The phenomenon of negative affinity sorption provides almost 96% yield of the product and the main losses from the initial activity of FVIII (up to 27%) occurred at the stage of ion-exchange chromatography. It has been found that the combination of pre-fractionation, ion-exchange and affinity chromatography stages provides a purification rate of239-700 times, depending on the type of selected sorbents.

Conclusions. The new technology of purification of blood coagulation of FVIII was create. Received the concentrate of FVIII with a specific activity of50. 58±1. 68 IU/mg protein.

Keywords: plasma fractionation; chromatography; active dyes; factor coagulation VIII.

Вступ

З метою корекції дефіциту FVIII та для запобігання кровотеч у пацієнтів з гемофілією А проводять замісну терапію, яка полягає у введенні плазмових або рекомбінантних препаратів цього фактора [1, 2].

Використання препарату Кріопреципітат залишилось у минулому через низку причин: незначну концентрацію FVIII в препараті, що не дає можливості досягнути необхідного рівня гемостазу; високий вміст нецільових білків, що призводить до навантаження реципієнта чужорідним білком; небезпеку зараження вірусними інфекціями; високу ймовірність виникнення посттрансфузійних реакцій тощо [3].

Застосування нових терапевтичних плазмових та рекомбінантних препаратів FVIII робить можливим лікування пацієнтів очищеними, стандартизованими, біологічно активними, вірус-безпечними продуктами на противагу використання свіжозамороженої плазми та кріопреципітату [4].

Вміст різноманітних білків у біологічних рідинах, зокрема в плазмі, знаходиться у дуже широких межах. Так, одні білки присутні в високих концентраціях і складають до 90% загального вмісту (альбумін, Ig G, Ig A, фібриноген, антитрипсин, трансферин, гемопексин) [5]. Ці білки заважають виділенню інших, що є в значно нижчих концентраціях. Тому процес отримання факторів зсідання крові, зокрема FVIII, вимагає попередніх етапів концентрування цих білків: кріопреципітації, переосадженння неорганічними солями та розчинниками, різні види хроматографічних процесів, тощо [4, 6].

Сучасні підходи потребують стандартизації хроматографічного процесу з точки зору селективності, специфічності, багатократного застосування, зменшення собівартості, простоти регенерації сорбенту. Це досягається шляхом створення нових підходів у виборі лігандів та матриць [4, 7].

Основними перевагами використання біоімітуючих барвників-лігандів є їх низька вартість, легкість іммобілізації, висока адсорбційна ємність, можливість стерилізації, легкість регенерації, стійкість до хімічного і біологічного розкладу, тощо. Основний недолік використання цих синтетичних лігандів полягає в тому, що процес вибору конкретної біомолекули є емпіричним і вимагає прецизійного скринінгу при розробці методу [8, 9]. Нами проводяться дослідження щодо можливості застосування барвник-лігандної хроматографії у створенні технологій отримання факторів протромбінового комплексу (ППСБ), зокрема тромбіну, факторів VII, IX та X [10].

Мета дослідження: розробка методу одержання високоактивного препарату фактора VIII зсідання крові із застосуванням біоспецифічних кремнеземних сорбентів із іммобілізованими активними барвниками.

Матеріали і методи

Іонообмінну хроматографію антигемофільного фактора виконували при кімнатній температурі на DEAE-Sepharose FAST FLOW, рН 7,4. Використали колонку розміром (2x5) см². Розчин Кріопреципітату готували на буферному розчині з рН 7,4. Кінцева концентрація солей перед нанесенням становила: 10,0 мМ Na-цитрат, 0,1 М NaCl, 0,5 мМ CaCl2, 2,0 г/л L-лізину, 8,0 г/л L-гліцину. Після нанесення вихідного розчину Кріопреципітату сорбент промивали вихідним буфером згідно методики. Елюцію проводили 0,3 М розчином NaCl. Відбирали фракції елюату з найвищою активністю FVIII та проводили хроматографію при рН 7,4 на кремнеземних сорбентах з іммобілізованими барвниками. Розмір колонок з афінними сорбентами становив (2x5) см². Хроматографію проводили при кімнатній температурі.

Статистичну обробку матеріалу проводили за допомогою пакету прикладних програм для Windows: Ехсеї та Statistica 17 ESPP. У роботі використовували описову статистику, кореляційний аналіз та двовибірковий t-тест з різними дисперсіями. Перевірку на нормальність розподілу проводили за критеріями Колмогорова-Смірнова. Вірогідність отриманих результатів оцінювали на рівні достовірності не менше 95% (Р<0,05).

Результати

Попередніми дослідженнями з'ясовано, що FVIII не сорбується жодним зі синтезованих сорбентів, однак питома активність у розчині зростає, а, відповідно, відбувається процес очищення. Це можна пояснити сорбцією супутніх білків (явище негативної афінної сорбції). Дані підтверджуються статистично двовибірковим t-тестом з різними дисперсіями при визначенні значущості різниці між групами.

Для з'ясування причини чи зростання питомої активності FVIII в процесі негативної афінної сорбції з досліджуваними сорбентами пов'язане лише з можливим зменшенням вмісту альбуміну, проводили електрофоретичне дослідження зразків в нативних умовах на ацетат-целю- лозних мембранах.

Представлені дані наочно демонструють, що не має суттєвих змін у співвідношенні між альбуміновою та глобуліновими фракціями (табл. 1). Тобто, очищення FVIII відбувалось не лише завдяки сорбції альбуміну як нецільового білка, але й інших, зокрема протромбіну, що належить до а- глобулінів, фібриногену та інших факторів зсідання, що входять до складу Р-глобулінів тощо.

Таблиця 1. Співвідношення між альбуміновою та глобуліновими фракціями у досліджуваних зразках

У зв'язку з тим, що основним хроматографічним методом при одержанні комерційних препаратів FVIII є метод іонообмінної хроматографії, проведено додаткове використання цього методу в одній схемі отримання концентрату фактора з «Кріопреципітату». Для забезпечення коелюції FVIII разом з фактором фон Віллебранда використовували розчин, що містив 0,3 М розчин NaCl. Результати досліджень представлені в табл. 2.

Оскільки з'ясовано, що FVIII не зв'язується із досліджуваними сорбентами, основний пік його активності збирали на виході із фракціями проскоку.

Таблиця 2. Хроматографічне очищення фактора VIII зсідання крові (M±m, n=5)

Сучасна технологічна схема одержання факторів зсідання крові - не лише комбінування різних хроматографічних методів, але й застосування етапів попереднього фракціонування. Наступний фрагмент нашого дослідження передбачав поєднання методів сорбції/осадження доміш- кових білків з іонообмінною та афінною хроматографіями (див. табл. 3).

Проведено аналогічні дослідження лише за однієї відмінності: на хроматографічну колонку з DEAE-Sepharose наносили забуферений розчин Кріопреципітату, з якого попередньо видаляли нецільові білки з використанням Al(OH)₃ та ПЕГ-4000.

Таблиця 3. Активність фактора VIII на технологічних етапах (M±m, n=5)

Обговорення

З отриманих даних випливає, що застосування іонообмінної хроматографії на DEAE-Sepharose та афінної хроматографії на кремнеземних макропористих сорбентах забезпечує одержання FVIII з кріопреципітату зі ступенем очищення від 129 до 242 разів (залежно від типу афінного сорбенту) та збереженням до 73-76% вихідної прокоагулянтної активності. При цьому слід зауважити, що основні втрати від вихідної активності FVIII (до 27%) відбувались на етапі іонообмінної хроматографії. Очищення фактора на кремнеземних сорбентах здійснювалось завдяки явищу негативної афінної хроматографії, що забезпечувало практично стовідсотковий вихід продукту [11]. Це є суттєвою перевагою методу негативної афінної сорбції в технології отримання очищеного препарату [12].

Завдяки проведенню попередніх етапів фракціонування, досягнуто вищого ступеня очищення FVIII (в 2-3 рази вищі у порівнянні з схемою без попереднього фракціонування). Отримані результати можуть свідчити про те, що видалені нецільові білки (білки Ш1СБ, фібриноген, тощо) не заважають зв'язуванню FVIII з іонообмінником, що, в свою чергу, веде до кращого очищення досліджуваного білка. Слід зауважити, що втрати від вихідної активності практично не відрізнялись від попереднього дослідження, а рівень питомої активності зріс практично вдвічі (505,80х10^-1 у порівнянні з 210,60х10^-1 МО/мг білка) (табл. 2, 3).

Висновки

Розроблений метод очищення FVIII зсідання крові на макропористих кремнеземних сорбентах з іммобілізованими активними барвниками має низку переваг над розповсюдженими методами іонообмінної хроматографії у технології отримання фактора і може бути впроваджений в практику лабораторного та промислового виробництва, стати основою для розробки терапевтичного препарату, а також для наукових досліджень. Отримано препарат FVIII зі максимальною специфічною активністю (50,58±1,68) МО/мг білка.

Література

Morfini M, Coppola A, Franchini M, Di Minno G. Clinical use of factor VIII and factor IX concentrates. Blood Transfusion. 2013; 11 (Suppl 4):55-63. doi: 10.2450/2013.010s.

McEneny-King A, Iorio A, Foster G, Edginton AE. The use of pharmacokinetics in dose individualization of factor VIII in the treatment of hemophilia A. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 2016;12(11):1313-21.

doi: 10.1080/17425255.2016.1214711.

Любчак ВВ. Проект щодо реорганізації переробки плазми крові. Україна. Здоров'я нації. 2012; 2(2/3):48-50. Доступно. http://nbuv. gov. ua/UJRN/Uzn_2012_2-3_10.

Burnouf T, Seghatchian J. «Go no Go» in plasma fractionation in the world's emerging economies: Still a

Morfini M, Coppola A, Franchini M, Di Minno G. Clinical use of factor VIII and factor IX concentrates. Blood Transfusion. 2013;11(Suppl 4):55-63. doi: 10.2450/2013.010s.

McEneny-King A, Iorio A, Foster G, Edginton AE. The use of pharmacokinetics in dose individualization of factor VIII in the treatment of hemophilia A. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 2016;12(11):1313-21.

doi: 10.1080/17425255.2016.1214711.

Lyubchak VV. [The project on reorganization of blood plasma processing]. Ukraine. The nation's health. 2012;2(2/3):48-50. Accessibly. http://nbuv.gov.ua/UJRN/ Uzn_2012_2-3_10. (in Ukrainian).

Burnouf T, Seghatchian J. «Go no Go» in plasma fractionation in the world's emerging economies: Still a question asked 70 yearsafter the COHN process was developed. Transfusion Apheresis Science.

2014;51(2):113-9.

doi: 10.1016/j.transci.2014.10.002

Burnouf T. An overview of plasma fractionation. Annals of Blood. 2018;3(33):1-10.

doi: 10.21037/aob.2018.05.03.

Kang L, Zhang Y, Luo J, Su Z. Separation of coagulation factor VIII with high activity using gigaporous anion exchange chromatography. Chinese journal of chromatography. 2012;30(6):618-23.

doi: 10.3724/sp.j.1123.2012.01036

Willjams S, Morton P, Baines D. Synthetic ligand affinity chromatography purification of human serum albumin and related fusion proteins. Methods in Molecular Biology. 2014;1129:181-95.

doi: 10.1007/978-1-62703-977-2_16.

Li Z, Rodriguez E, Azaria S, Peka- rek A, Hage DS. Affinity monolith chromatography: A review of general principles and applications. Electrophoresis. 2017; 38(22-23): 283750. doi: 10.1002/elps.201700101.

Chronopoulou E, Labrou NE. Synthesis and application of dye-ligand affinity adsorbents. Methods in Molecular Biology. 2014; 1129:263-76. doi: 10.1007/978-1-62703-977-2_21.

Шурко НО, Даниш ТВ, Воро-

няк МІ. Застосування барвник-лі- гандної хроматографії для очищення фактора VIII зсідання крові.

Біологічні студії. 2017; 11(1):67- 74. doi: 10.30970/sbi. 1101.508. question asked 70 yearsafter the COHN process was developed. Transfusion Apheresis Science. 2014; 51(2):113-9.

doi: 10.1016/j.transci.2014.10.002

Burnouf T. An overview of plasma fractionation. Annals of Blood. 2018; 3(33):1-10.

doi: 10.21037/aob.2018.05.03.

Kang L, Zhang Y, Luo J, Su Z.

Separation of coagulation factor VIII with high activity using giga- porous anion exchange chromatography. Chinese journal of chromatography. 2012; 30(6):618-23.

doi: 10.3724/sp.j.1123.2012.01036

Willjams S, Morton P, Baines D. Synthetic ligand affinity chromatography purification of human serum albumin and related fusion proteins. Methods in Molecular Biology. 2014;1129:181-95.

doi: 10. 1007/978-1-62703-977-2_16

Li Z, Rodriguez E, Azaria S, Peka- rek A, Hage DS. Affinity monolith chromatography: A review of general principles and applications. Electrophoresis. 2017; 38(22-23):2837- 50. doi: 10.1002/elps.201700101.

Chronopoulou E, Labrou NE. Synthesis and application of dye-ligand affinity adsorbents. Methods in Molecular Biology. 2014; 1129:263-76. doi: 10.1007/978-1-62703-977-2_21.

Shurko NO, Danysh TV, Voro- nyak MI. [Application of dye-ligand chromatography for purification of coagulation factor VIII]. Studia Biologica. 2017;11(1):67-74 (in Ukrainian). doi: 10.30970/sbi.1101.508.

Шурко НО, Даниш ТВ. Створення технології отримання фактора VIII зсідання крові з використанням методу афінної хроматографії на кремнеземних сорбентах. Біологія тварин. 2016;18(2): 152-9. doi: 10.15407/animbiol18.02.152.

Farrugia A. Factor VIII manufactured from plasma - the ups and downs, and the up again: a personal journey - part 1: history of the development of plasma-derived factor VIII therapies. Annals of Blood. 2018;3(2):1-11.

doi: 10.21037/aob.2018.02.04.

Надійшла 29.10.2019

Контакти: dtaras2006@ukr.net

Shurko NO, Danysh TV. [Development of technology of blood coagulation factor VIII purification by the method of affinity chromatography on silica sorbents]. The Animal Biology. 2016; 18(2):152-9. (in Ukrainian).

doi: 10.15407/animbiol18.02.152.

Farrugia A. Factor VIII manufactured from plasma - the ups and downs, and the up again: a personal journey - part 1: history of the development of plasma-derived factor VIII therapies. Annals of Blood. 2018;3(2):1-11.

doi: 10.21037/aob.2018.02.04.

Размещено на Allbest.ru