Регуляция состояния кроветворных предшественников в костном мозге при адъювантном артрите после применения криоконсервированных клеток плаценты

Размещено на http://allbest.ru

Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины

Регуляция состояния кроветворных предшественников в костном мозге при адъювантном артрите после применения криоконсервированных клеток плаценты

А.Н. Гольцев, Е.Д. Луценко, Т.Г. Дубрава

Харьков

Резюме

Установлено, что терапевтический эффект вводимых криоконсервированных клеток плаценты в отношении гемопоэтического звена при АА обусловлен изменением пролиферативной активности клеток КМ, что проявлялось в снижении содержания СВ34+СВ38- популяции и ИПА. Различия в проявлении функциональной активности криоконсервированных клеток плаценты КД и КП на 14-е сутки развития АА определялись различиями в регуляции количества CB117+ клеток.

Ключевые слова: кроветворные предшественники, артрит, криоконсервирование, плацента

Резюме

Регуляція стану кровотворних попередників у кістковому мозку при ад'ювантному артриті після застосування кріоконсервованих клітин плаценти

А.М. Гольцев, О.Д. Луценко, Т.Г. Дубрава

Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків

Встановлено, що терапевтична дія уведених клітин плаценти (КД і КП) відносно гемопоетичної ланки при АА зумовлена зміною проліферативної активності клітин КМ, що проявлялось в зменшенні вмісту СВ34+СВ38- популяції та ІПА. Різниця в прояві функціональної активності кріоконсервованих клітин плаценти - КД і КП на 14-у добу розвитку АА визначалася різницею в регуляції кількості CB117+ клітин.

Ключові слова: кровотворні попередники, артрит, кріоконсерву- вання, плацента.

Summary

Regulation of hemopoietic precursor state in the bone marrow at adjuvant arthritis by application of cryopreserved placenta cells

N. Goltsev, E.D. Lutsenko, T.G. Dubrava

Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov

It is established, that the therapeutic effect of injected cryopreserved placenta cells in the attitude of hemopoiesis at АА is caused by change of bone marrow cell activity, that was shown in decrease of the CD34+CD38- cell population content and IPA. The distinctions in manifestation of cryopreserved placenta cells functional activity at the 14 day of development АА are determined by different regulation of CD117+ cell amount.

Key words: hemopoietic precursors, arthritis, cryopreservation, placenta.

Введение

Нарушения в системе кроветворения являются одним из важных патогенетических звеньев в развитии ревматоидного артрита, что определяет актуальность поиска эффективных средств восстановления гематологических показателей при данной патологии.

Наличие кроветворных предшественников и гемопоэзрегулирующих субстанций в плаценте может быть предпосылкой ее использования в качестве терапевтического средства при лечении такого рода заболеваний. Ранее было показано наличие в гомогенате клеток плаценты человека (ГПЧ) регуляторов функционального статуса кроветворных предшественников различной степени коммитированности (КОЕс-8 и КОЕс-12) [1].

Авторами было установлено также, что стимуляция колониеобразования в селезенке у облученных реципиентов криоконсервированным материалом уступает нативному, что связано со снижением функционального потенциала используемых клеток после криоконсервирования.

Известно, что по мере дифференцировки стволовые кроветворные клетки (СКК) изменяют свои фенотипические характеристики [6]. Клетки с фенотипом CD34+CD38- считают полипотентными стволовыми кроветворными клетками (ПСКК), в то время как CD34+CD38+ представляют собой более продвинутые в дифференцировке предшественники.

Популяция СD34+CD38- способна дифференцироваться в различные типы клеток (клетки крови, кардиомиоциты, гепатоциты) в зависимости от микроокружения. Именно эти клетки ответственны за длительность приживления костного мозга [5].

Трансмембранный рецептор СП117/с-Кі1, кодируемый протоонкогеном с-kit, - характерный маркер как для стволовых, так и коммитированных клеток в миелоидном, эритроидном и мегакариоцитарном направлениях клетках [4]. СП117/с-Кй является рецептором стволовоклеточного фактора -SCF (фактора Стила), недостаток которого, как и его рецептора, приводит к снижению количества СКК и предшественников в КМ [8].

Цель работы - изучение особенностей действия вводимой криоконсервированной в различных условиях суспензии клеток плаценты (СКП) на гемопоэтические предшественники с фенотипом CD34+CD38- и CD117+ в КМ животных с АА.

Материалы и методы

Работа выполнена на мышах линии СВА/Н, массой 16-18 г. Клетки плаценты выделяли из хориального участка зрелой плаценты у мышей 18-19 суток гестации по методу [4]. Криоконсервирование СКП проводили в криопробирках (Nunk, Roskilde, Denmark). К 0,5 мл СКП, содержащей 5х10⁶ клеток, медленно добавляли 0,5 мл 20% раствора криопротектора ДМСО (КД) или ПДС (КП), таким образом, чтобы конечная концентрация криопротектора составила 10%. Образцы были криоконсервированы на программном замораживателе УОП-1.

АА индуцировали субплантарным введением полного адъюванта Фрейнда, в дозе 0,05 мл/мышь, содержащей 1,5 мг/мл Micobacterium tuberculosis на 100 г массы животного. Степень отека оценивали по отношению диаметра опытного голеностопного сустава к интактному и выражали в виде индекса артрита.

Нативную или криоконсервированную СКП (нСКП и кСКП соответственно) вводили на 7-е сутки развития АА в дозе 5х10⁶ клеток на мышь.

Животные были разделены на группы по 7 мышей: 1 - с АА, 2 - введение животным с АА нСКП, 3- введение кКСП с 10% ДМСО (суспензия КД), 4 - введение кКСП с 10% ПДС (суспензия КП), 6 - введение интактным животным ЗФР (контроль).

Эффект лечения АА оценивали по индексу артрита и содержанию в КМ клеток с фенотипическими признаками стволовых кроветворных клеток (СКК), экспрессирующих маркеры CD34+CD38+ и CD117+, которые определяли с помощью МАТ фирмы BD Pharmingen и Abcam по протоколам производителей на проточном цитофлуориметре FACS Calibur (Becton Dickinson, USA).

Результаты и обсуждение

После применения нативных и криоконсервированных в различных условиях СКП динамика снижения индекса артрита была различной (рис. 1). Его минимизация после введения нСКП была установлена на 14-е сутки, КД - на 28-е,

Рис. 1. Индекс артрита до и после введения СКП

Примечание: * - достоверные отличия при сравнении исследуемой группы и группы животных с АА, р<0,05.

Неоднократно указывалось на нарушение при развитии АИЗ состояния гемопоэтической системы [2].

Действительно, в динамике развития АА установлено, что на фоне снижения в 1,2 раза в сравнении с контролем количества клеток на бедро (рис.2), повышалось содержание обеих субпопуляций компартмента СКК: на 14-е сутки - количество CD34+CD38- клеток - в 1,7 раза (рис.3) , CD117+ клеток - в 1,3 раза (рис.4), на 28-е сутки - в 3,8 раза и 3,6 раза соответственно.

Таким образом, выраженность этого процесса была выше у более потентных CD34+CD38- клеток.

Рис. 2. Содержание ядерных клеток в КМ при АА после введения СКП

Примечание: * - достоверные отличия при сравнении исследуемой группы с контрольной, р<0,05.

Рис. 3. Количество СД34+38- клеток, индекс пролиферативной активности (ИПА) в КМ у животных с АА до и после введения СКП

Примечание: здесь и далее см. рис. 2.

Рис. 4. Количество СД117+ клеток в костном мозге животных с АА после применения клеток плаценты

Это согласуется с результатами [1] об увеличении в 2,4 раза количества более потентных КОЕс-12 в КМ животных с АА в этот же срок. Вероятно, недостаток в КМ более дифференцированных кроветворных предшественников по принципу обратной связи активирует процессы пролиферации более потентных клеток стволового компартмента.

Для оценки выраженности проявления функционального потенциала СКК нами был использован индекс пролиферативной активности (ИПА) [2], определяемый как отношение процентного содержания менее дифференцированных СКК к более дифференцированным клеткам, то есть%СП34+ЄП38- /%CD117+.

На фоне повышения содержания обеих субпопуляций СКК при АА выраженность этого процесса у более потентных СКК была выше, что подтверждалось и повышением ИПА - в 1,3 раза (14-е сут) и 1,1 раза (28-е сут) (рис. 5).

Рис. 5. Индекс пролиферативной активности (ИПА) в КМ у животных с АА до и после введения СКП

Данный факт указывает на превалирование пролиферативного потенциала СКК животных с АА над дифференцировочным в эти сроки. На 28-е сутки показатель ИПА был ниже по сравнению с 14-и сутками, что может свидетельствовать о снижении темпов пролиферации и истощении пула клеток, что подтверждается снижением количества ядерных клеток в бедре (рис. 2). артрит гематологический клетка плацента

На 14-е сутки терапевтическое действие СКП наблюдалось в группе с введением КП, при этом отмечалось повышение количества ядерных клеток в 1,2 раза, относительное содержание СП 117+ клеток в 1,7 раза, однако ИПА оставался выше контроля.

Отсутствие эффекта при введении КД на 14-е сутки в отличие от нСКП и КП возможно обусловлено разнонаправленным действием вводимых суспензий на СП117+ клетки. На 28-е сутки в группах с введением КД и КП наблюдали лечебный эффект, при этом оба препарата повышали количество ядерных клеток (в 1,7 раза и 1,9 раза соответственно). На этом фоне было установлено снижение ИПА (в 2,3 и 1,2 раза соответственно).

Представленные данные свидетельствуют о перераспределении субпопуляционного состава клеток стволового компартмента в гемопоэтическом плацдарме при АА и корригирующем влиянии на эти изменения клеток плаценты. Возможность регуляции состояния кроветворных предшественников у животных с АА введением СКП подтверждается наличием гемопоэзиндуцирующего потенциала этой ткани. Так, например, показано существование гемопоэтических кластеров в плаценте, определяемых по экспрессии маркеров СД31,СД34, Kit, формируемых из аллантоиса и регулируемых эндотелиальными клетками плаценты через SCF/Kit сигналирование [7].

Выводы

1. В динамике развития АА (на 14-е и 28-е сутки) в условиях ингибиции медуллярного кроветворения в сравнении с контролем установлено повышение концентрации в костном мозге СП117+ и СП34+СП38- клеток, причем в большей степени у более потентных СКК.

2. Проявление лечебного эффекта в отношении гемопоэтической системы реципиентов с АА препаратами КД и КП (на 28-е сутки) обусловлено коррекцией под их влиянием пролиферативной активности клеток КМ, в частности, снижением содержания СП34+СП38- и ИПА.

3. Условия криоконсервирования СКП определяют различия в проявлении функциональной активности КД и КП (на 14-е сут.) и могут быть связаны с разнонаправленной регуляцией содержания CD117+ клеток в КМ.

Литература

1. Ответ лимфогемопоэтической системы организма на введение продуктов фетоплацентарного комплекса / А.Н. Гольцев, Л.В. Останкова, Е.Д. Луценко [и др.] // Проблемы криобиологии. - 2000. - № 2. - С. 15-30.

2. Состояние стволового гемопоэтического компартмента на разных этапах развития адъювантного артрита / А.Н. Гольцев, Л.В. Останкова, Т.Г. Дубрава [и др.] // Світ медицини та біології. - 2009. - № 2. - С. 73-80.

3. Гривцова Л.Ю. Субпопуляции трансплантируемых стволовых кроветворных клеток / Л.Ю. Гривцова, Н.Н. Тупицын // Современная онкология. - 2006. - Т. 8, № 1. - С. 1-16.

4. Приготування, зберігання та клінічне використання кріоконсервованої суспензії плаценти: метод. рекоменд. / наук. ред. А.І. Грищенко [та ін.]. - Харків. -1997. - 10 с.

5. Cardozo A.A. Release from quiescence of CD34+CD38- human umbilical cord blood cells reveals their potentiality to engraft adults / A.A. Cardozo, Li Ma-Lin, P. Batard // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1993. - V. 90. - Р. 8707-8711.

6. A stem cell molecular signature / N.B. Ivanova, J.T. Dimos, Schaniel [et al.] // Science. - 2002. - Vol. 298 - P. 601-604.

7. A Regulation of hematopoietic cell clusters in the placental niche through SCF / Kit signaling in embryonic mouse / T. Sasaki, C. Mizuochi, Horio Yuka [et al.] // Development. - 2011. - 137 - P. 3941-3952.

8. Kit Regulates Maintenance of Quiescent Hematopoietic Stem Cells / L.A. Thoren, K. Liuba, D. Bryder, J.M. Nygren // The Journal of Immunology - 2008. - 180. - P. 2045-2053.

Размещено на Allbest.ru