Кількісна полімеразно-ланцюгова реакція у моніторингу пацієнтів з хронічною мієлоїдною лейкемією

Размещено на http://www.allbest.ru/

Державна установа «Інститут патології крові та трансфузійної медицини» НАМН України», Львів, Україна

Кількісна полімеразно-ланцюгова реакція у моніторингу пацієнтів з хронічною мієлоїдною лейкемією

М.І. Вороняк

М.В. Кокоруз

С.С. Худзій

І.М. Юрчишак

С.П. Міляшкевич

Н.В. Шелеп

Резюме

мутований ген полімеразно-ланцюговий реакція

Актуальність. З появою у лікувальній практиці інгібіторів тирозинкінази (ІТК) наступних поколінь у хворих з хронічною мієлоїдною лейкемію (ХМЛ) надважливим є своєчасна діагностика, моніторинг мінімальної залишкової хвороби (MRD) та ефективності терапії за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції (PCR).

Метою роботи було визначення експресії мутованого гена BCR-ABL1 шляхом оцінювання відсоткового співвідношення кількості копій гена BCR-ABL1 до кількості копій контрольного гена ABL1 методом кількісної полімеразно-ланцюгової реакції в реальному часі (RQ-PCR).

Матеріали та методи. У роботі використовували зразки периферичної крові 116 пацієнтів з підозрою на ХМЛ та вже з встановленим діагнозом. Методом RQ-PCR було проведено 172 молекулярно-генетичні дослідження.

Результати. В 11 первинних пацієнтів дана мутація не виявлена. У решту хворих було встановлено чи підтверджено наявність транскриптів b2a2, b3a2.

Висновки. Ретельний регулярний моніторинг ХМЛ за допомогою методу RQ-PCR є на сьогоднішній день обов'язковим діагностичним дослідженням, яке допомагає лікарям-гематологам скоригувати схему лікування пацієнтів.

Ключові слова: химерний ген BCR-ABL1; хронічна мієлоїдна лейкемія; інгібітори тирозинкінази; ампліфікація; мРНК.

Quantitative polymerase chain reaction in monitoring of patients with chronic myeloid leukemia

M.I. Voroniak, M.V. Kokoruz, S.S. Hudzij, I.M. Yurchyshak, S.P. Mylyashkevich, N.V. Shelep

State Institution «Institute of Blood pathology and Transfusion medicine of NAMS of Ukraine», Lviv, Ukraine

Abstract

Background. Using of the next generation of modern tyrosine kinase inhibitors (such as dasatinib, nilotinib, bosutinib, ponatinib, etc. ) in the treatment of patients with chronic myeloid leukemia (CML) require timely diagnosis, monitoring of minimal residual disease and treatment efficacy by polymerase chain reaction (PCR). The determination of expression of chimeric BCR-ABL1 gene by estimating the percentage ratio of copies of the BCR-ABL11 gene to the number of the ABL1 control gene by quantitative real-time polymerase chain reaction (RQ-PCR) was the aim of our study.

Materials and Methods. The samples ofperipheral blood from 116 patients (55 men and 61 women, aged 21 to 86 years) with suspected CML or diagnosed CML were used in our study. For the period 2018-2019, 172 molecular genetic analysis were performed on the CFX96™ Real-Time System (Bio-Rad, USA) with using AmpliSens Leucosis Quantum M-bcr-FRT-M PCR kit. The amplification was performed in 2 replications for each sample. The results were analized by CFX Manager TM Software 3.0 software according to the criteria of Working definitions of Molecular Response in CML. The detection of mRNA of the BCR-ABL1 gene included: extraction of total RNA from peripheral blood cells by the Chomczynski method; reverse transcription of RNA into cDNA and real-time amplification. In our experiment we used: ABL1 gene - as a reference gene (housekeeping gene) and 5 BCR-ABL1 traceable calibration plasmids. Negative controls and positive controls (quantitatively characterized mRNA fragments of BCR-ABL1 gene) we used for control on the quality of basic steps of analysis.

Results. The results were expressed as a percentage of the sum of copies of the chimeric gene BCR-ABL1 to the sum of copies of the control gene ABL1. In case of small number of transcripts copies b2a2, b3a2 - less than 3 copies, according to EUTOS 2014, the results were calculated as >3 copies in each replicate. The mutation was not detected in 11 primary patients. Transcripts b2a2, b3a2 had been detected or confirmed in other patients. We obtained the following results: >10% b2a2, b3a2 transcripts - 25 patients; 10% - 0.1% - 23; 0.1%-0.01% - 19; and 38 patients with deep molecular response (MR) (0. 01% - 0.001%).

Conclusions. The key to success in treating CML patients is regular monitoring of the therapy effectiveness for achieving deeper levels of MR. In particular, RQ-PCR allows to estimate the amount of BCR-ABL1 mRNA in the peripheral blood and bone marrow relative to an internal reference gene ABL. RQ-PCR is obligatory method in diagnostic CML that allows to choose the most optimal treatment strategy for patients with CML.

Keywords: fusion gen BCR-ABL1; chronic myeloid leukemia; tyrosine kinase inhibitors; amplification; mRNA.

Вступ

Прогрес науки та технологій зумовив суттєві досягнення в діагностиці та лікуванні значної кількості захворювань, які ще донедавна вважались невиліковними. Однією з таких патологій є ХМЛ.

ХМЛ виникає внаслідок неопластичної трансформації поліпотентної стовбурової гемопоетичної клітини. Це приводить до пошкодження всіх клітин кісткового мозку, включаючи гранулоцити, еритроїдні клітини і мегакаріоцити. За поширеністю ХМЛ займає п'яте місце в структурі гемобластозів (приблизно 15% діагностованих випадків лейкемій у дорослих людей). Захворюваність складає 1-2 випадки на 100 000 населення. Найчастіше хворіють особи віком від 40 до 50 років. У людей молодого віку ХМЛ зустрічалася раніше досить рідко. Однак, в останні 10 років ХМЛ усе частіше виявляють у хворих віком від 25 до 40 років. Основною причиною захворювання є реципрокна транслокація між 9 та 22 хромосомами t(9;22)(q34;q11), з утворенням так званої Філадельфійської хромосоми (Ph+- хромосома), яка виявляється в більшості (до 95%) хворих [1,2]. При цьому відбувається злиття гену ABL1, розташованого на хромосомі 9, з геном BCR, розташованому на хромосомі 22 з утворення химерного гену BCR-ABL1 [3].

Химерний білок BCR-ABL1, який синтезується внаслідок активації гена BCR-ABL1, володіє підвищеною тирозинкіназною активністю. В нормі активність тирозинкінази ABL1 в клітині регулюється іншими молекулами, але внаслідок перебудови вона підпадає під вплив сильного промотору з втратою регуляторних функцій. Саме це приводить до неконтрольованої проліферації клітин і розвитку неопластичних процесів [2, 3].

Структура цього злитого гена не є однорідною, як результат синтезуються декілька форм онкобілка BCR-ABL1, які викликають різні типи лейкемій. Для типової ХМЛ найбільш властивий білок з молекулярною масою 210 кДа (р210), синтез якого кодується транскриптами b2a2 (e13a2) або b3a2 (е 14а2), утвореними в результаті розриву в кластері М-bcr.

Діагноз ХМЛ встановлюється на підставі оцінки гематологічних показників у комбінації з морфологічним дослідженням кісткового мозку та обов'язковим підтвердженням наявності Ph-хромосоми за допомогою цитогенетичного дослідження та/або BCR-ABL1 транскрипту, який визначається методом PCR зі зворотною транскрипцією в зразках периферичної крові або кісткового мозку.

З появою в клінічній практиці ІТК, так званих таргетних препаратів, тобто специфічних препаратів ціленаправленої дії, вдалося значно продовжити тривалість життя пацієнтів, попередити розвиток фази акселерації та бластного кризу. Створення першого з них - іматинібу, стало революційною подією в галузі ціленаправленої протипухлинної терапії. З моменту введення іматинібу в 2000 році щорічна смертність від ХМЛ зменшилась з 10-20% до 1-2%, покращивши 10-річну виживаність приблизно від 20% до 80-90% [1].

Метою терапії ХМЛ іматинібом є пригнічення і максимальна еради- кація Рй+-клону. Залежно від результатів лікування розрізняють: добра відповідь (75%, повна ерадикація Рй+-клону); резистентність до препарату (первинна резистентність) чи набута під час терапії (вторинна). Залежно від ступеня резистентності виділяють субоптимальну відповідь (10-15%) та неефективність терапії (хворі з втратою відповіді). Пацієнти з недостатньою відповіддю вимагають до себе особливої уваги у зв'язку з необхідністю виявлення точної причини такої відповіді. Поява пацієнтів з рецидивом - це утворення резистентних клонів клітин, які несуть або генетичні мутації, або додаткові хромосомні аберації. Саме ця категорія хворих має найвищий ризик прогресування ХМЛ. Виникнення стійкості до ІТК є наслідком взаємодії багатьох факторів: схеми лікування, фармакодинаміки ІТК, генетичних змін, мутацій BCR-ABL1 кіназного домена, які роблять тирозинкіназу нечутливою до дії іматинібу, при цьому зберігається трансформуюча активність ферменту. Припускається, що виникнення мутацій викликає зміну конформації химерного білка тирозинкінази, внаслідок чого ускладнюється зв'язування іматинібу з аденозинтрифосфатною кишенею білка.

Одним з маркерів геномної нестабільності при ХМЛ виступає наявність точкових мутацій в гені BCR-ABL1. Заміна окремих амінокислот кіназного домена BCR-ABL1, здатна змінити цю структуру, а, отже, може значимо вплинути на зміну аффінності до ІТК і, в кінцевому підсумку, на зниження ефективності терапії, селекцію резистентних мутантних клонів і прогресію захворювання. Також змінюється фосфорилююча активність мутантної тирозинкінази, активуються додаткові сигнальні шляхи. На теперішній час у хворих з резистентністю до іматинібу в гені BCR-ABL1 виявлено понад 90 видів точкових мутацій [4].

Крім точкових мутацій, також виявлені мутації, що призводять до більш суттєвих змін структури білка BCR-ABL1: делеція 81 bp 3'-кінця екзону a4, інсерція 98-72 bp (вбудовування фрагмента довжиною 35 bp між екзонами 8 і 9), делеція екзону 7 зі складу мРНК BCR-ABL1, а також мутація G425Stop, що приводить до появи стоп-кодону в середній частині гена BCR-ABL1. Ці мутації призводять до появи вкорочених молекул білка BCR-ABL1, стійких до дії препаратів ІТК [5].

На сьогоднішній день розроблені препарати ІТК 2-го та 3-го покоління, більш ефективні в порівнянні з іматинібом - нілотиніб, дасатініб, босутініб та понатиніб, що дозволяють подолати проблеми з резистентністю і непереносимістю іматинібу у ряду хворих. В літературі з'явилися, так звані кольорові таблиці, в яких представлено резистентність відповідно до інгібуючої дії певного ІТК на різні види мутацій кіназного домена гена BCR-ABL1 [6]. Отже, при виборі стратегії лікування слід обов'язково враховувати тип мутації.

За останні десятиліття було розроблено багато нових молекулярно-генетичних технологій у діагностиці ХМЛ, щоб замінити трудоємкі цитогенетичні методи. До них відносяться методи, що визначають химерний ген BCR-ABL1 на рівні ДНК за допомогою геномної PCR, Саузерн-блот, FISH, на рівні РНК за допомогою нозерн-блоту або RQ-PCR, а також визначення рівня експресії химерного білка вестерн-блотом або імунопреципітацією [5]. Та найбільш поширеними на сьогодні молекулярно-генетичними дослідженнями в діагностиці ХМЛ є якісна мультиплексна PCR зі зворотною транскрипцією (для встановлення типу транскрипту гену BCR-ABL1 на момент верифікації), RQ-PCR та гніздова PCR для моніторингу відповіді на лікування та оцінки MRD. Кількісне дослідження здійснюється від моменту встановлення типу транскрипту та початку лікування ІТК. Згідно з European Leukemia Net (ELN) визначення ефективності лікування ІТК базується на цитогенетичній відповіді та MR осягнутих в 3, 6, 12 чи більше місяців. ELN рекомендує оцінювати MR до досягнення великої молекулярної відповіді (MMR) кожні три місяці, а після її осягнення кожні 3 чи 6 місяців. Обов'язковим є проведення RQ-PCR не рідше ніж кожні 6 місяців. При досягненні 4-log-5-log зменшення кількості транскрипту або негативного результату RQ-PCR подальший моніторинг за лікуванням проводиться з допомогою високоспецифічної гніздової PCR, яка складається з двох етапів: зовнішньої і внутрішньої (гніздової) PCR. Чутливість становить 1 клітина на 106 При 2-log збільшенні кількості транскрипту BCR-ABL1 під час лікування ІТК, а також при підтвердженні резистентності на певний ІТК слід провести дослідження на виявлення точкових мутацій кіназного домена BCR-ABL1 методом секвенування.

Критерії оптимальної відповіді на терапію ІТК:

повна гематологічна відповідь - відсутність спленомегалії; відсутність у результатах аналізу периферичної крові незрілих форм гранулоцитів, таких як мієлоцити, промієлоцити або бласти; лейкоцити менше ніж 10х 109/л; тромбоцити <450х 109/л; базофіли <5%.

велика цитогенетична відповідь (MCyR) - відсоток клітин Ph+ при цитогенетичному дослідженні <35%; і/або рівень транскрипту BCR/ABL1 при дослідженні методом RQ-PCR <10%, яких досягнуто через 3 міс.;

повна цитогенетична відповідь (CCyR) - відсутність Ph+ клітин при цитогенетичному дослідженні; і/або BCR/ABL1<1% до 6 міс. від встановлення діагнозу;

MMR - BCR/ABL1<0,1%; до 12 міс. від встановлення діагнозу і будь-коли пізніше [1].

У хворих під час хронічної фази, у яких в результаті застосування терапії першої лінії досягнуто т. зв. глибокої MR тривалістю більше 2-х років можна розглянути (лише у межах клінічних випробувань) припинення лікування ІТК згідно з рекомендаціями European Treatment and OutcomeStudy (EUTOS) [7, 8].

Cучасне визначення глибокої MR є наступним:

MR4 (>4-log зменшення від базової лінії IRIS): а) рівень транскрипту BCR-ABL1IS <0,01% або б) не виявлено жодної копії гена BCR-ABL1IS на 10 000-31 999 ABL1 транскрипту чи 24 000-76 999 GUSB транскрипту;

MR4,5 (>4,5-log): а) рівень транскрипту BCR-ABL1IS <0,0032% або б) не виявлено жодної копії гена BCR-ABL1IS на 32 000-99 999 ABL1 чи 77 000-239 999 GUSB транскриптів;

MR5 (>5-log): а) рівень транскрипту BCR-ABL1IS <0,001% або б) не виявлено жодної копії гена BCR-ABL1IS на >100 000 ABL1 чи >240 000 GUSB транскриптів (рис. 1) [7, 9, 10, 11].

Отже, своєчасна оцінка ефективності терапії ITK за допомогою молекулярно-генетичних методів дозволяє підібрати оптимальну схему терапії та покращити тривалість і якість життя у хворих з ХМЛ.

Рисунок 1. Рівні MR при ХМЛ [11].

MCyR - велика цитогенетична відповідь; CCyR - повна цитогенетична відповідь; MR - молекулярна відповідь.

Метою роботи було визначення експресії мутованого гена BCR-ABL1 шляхом оцінювання відсоткового співвідношення кількості копій гена BCR-ABL1 до кількості копій контрольного гена ABL1 методом RQ-PCR.

Матеріали і методи

У роботі використовували зразки крові пацієнтів з підозрою на ХМЛ та вже з встановленим діагнозом, що знаходились на обстеженні і лікуванні в ДУ «Інститут патології крові та трансфузійної медицини НАМН України» у м. Львів. За період 2018-2019 рр. було проведено 172 молекулярно-генетичні дослідження периферичної крові, отриманої від 116 пацієнтів: 55 чоловіків та 61 жінки у віці від 21 до 86 років.

Зразки крові забирали натщесерце у пробірки з 6% розчином ЕДТК (1:20). Важливим чинником, що суттєво впливає на якість виділеної РНК, є час від моменту забору крові до часу виділення лейкоцитів (не більше 24 год). Для нормалізації кількості РНК в реакції індивідуально для кожного пацієнта використовували необхідний об'єм крові, що містить 2х107 лейкоцитів. В подальшому еритроцити лізували гемолітичним розчином. Для роботи використовували набір реагентів AmpliSens Leucosis Quantum M-icr-FRT-M PCR kit, що призначений для якісного та кількісного виявлення мРНК химерного гена BCR-ABL1 і мРНК гена ABL1 в клінічному матеріалі методом PCR з гібридизаційно-флуоресцентною детекцією продуктів ампліфікації в режимі «реального часу». Лейкоцити відмивали 0,1М фосфатним буфером з рН 7,4. Виявлення мРНК гена BCR-ABL1 включало: екстракцію тотальної РНК з клітин периферичної крові за методом Хомчинського (RIBO-zol-D варіант 100); проведення реакції зворотної транскрипції (REVERTA-L варіант 100) та реакцію ампліфікації продуктів у режимі реального часу (PCR kit варіант FRT). Ампліфікація проводилася на двох реакційних сумішах: визначення фрагмента гена M-BCR-ABL1 (p210) - транскрипти b2a2 і b3a2 та фрагмента мРНК гена ABL1 в якості ендогенного внутрішнього контролю та гена-нормалізатора. Екстракцію РНК та постановку ампліфікації проводили на приладі CFX96™ Real-Time System виробництва фірми Bio-Rad (США). Як ДНК-калібратори використовувати РНК-вмісні фагові препарати b3a2 та b2a2 з відомими концентраціями. В кожній ампліфікації використовували 5 ДНК-калібраторів для побудови калібрувальних кривих для обох PCR-сумішей. З метою підтвердження відсутності контамінації кожну серію експериментів супроводжували постановкою негативних контролів (НК). Для контролю за якістю проходження основних етапів аналізу обов'язковим є використання високо- та низькоконцентрованих позитивних контролів (ПК-1 і ПК-2), що являють собою кількісно охарактеризовані фрагменти мРНК BCR-ABL1. Кожен зразок ставили у двох повторах для гена BCR-ABL1 та гена ABL1. Якщо хоча б один із повторів є позитивним, то результат всього дослідження слід вважати позитивним. Результати ампліфікації реєстрували по каналу флуоресценції HEX. Обробка результатів проводилась за допомогою програми CFX Manager TM Software 3.0 згідно з критериями Working definitions of Molecular Response in CML (2013) [9].

Результат подається як (сума копій BCR-ABL1 з усіх повторів)/(сума копій ABL1)*100%. У випадку малої кількості копій химерного гена (<3 копій), згідно з EUTOS 2014, результат слід виражати як >3 копій у кожному повторі.

Якщо BCR-ABL1 не виявляється у жодному з повторів того самого зразка, то заключний результат рекомендовано представляти як: не виявлено BCR-ABL1 в сумі копій контрольного гена всіх повторів.

Якщо кількість ABL1 <10000 копій хоча б в одному повторі, результат вважається не валідним. Також якщо параметри PCR, а саме: ефективність реакції нижче 95-105%, коефіцієнт кореляції (R2) при побудові калібрувальної кривої <0,98, визначено значення порогового циклу Ct для НК, розраховані концентрації ПК-1/ПК-2 не вкладаються у зазначений діапазон або співвідношення концентрацій M-BCR-ABL1/N-ABL1 для зразків у двох повторах відрізняється більше ніж у 4 рази, то експеримент слід повторити, починаючи з першого етапу аналізу.

Результати

Серед 116 пацієнтів, що звернулися в ДУ «Інститут патології крові та трансфузійної медицини НАМН України» 73 хворим провели RQ-PCR одноразово, 30 хворим двічі та 13 - тричі. В 11 первинних пацієнтів дана мутація не виявлена. У решту хворих було встановлено чи підтверджено наявність транскриптів b2a2, b3a2. У цієї категорії пацієнтів виявили наступні результати: >10% (відповідає бластному кризу) - 25 хворих; 10%-0,1% - 23; 0,1%-0,01% - 19; та серед групи пацієнтів, що осягнули глибоку MR (0,01%-0,001%) - 38 хворих. Результати виражали у відсотковому співвідношенні кількості копій гена BCR-ABL1 до кількості копій контрольного гена ABL. Пацієнтам з даною патологією в залежності від відповіді на лікування для оцінки ефективності терапії та моніторингу MRD проводили RQ-PCR кожні 3-6-12 місяців за скеруванням лікаря-гематолога. За результатами наших досліджень простежується закономірність : у більшості пацієнтів, які приймають ІТК спостерігається зменшення експресії гену BCR-ABL1, а у випадку зниження чи втрати MR, виявлялося, що частина пацієнтів (з різних причин) переставала вживати ІТК. Але в певної частини пацієнтів втрата MR не була пов'язана з відміною ІТК, що, ймовірно, пов'язано з виникненням вторинних мутацій в гені BCR-ABL1.

Обговорення

Молекулярні вимірювання здійснені з допомогою RQ-PCR виражають співвідношення кількості гена BCR-ABL1 до внутрішнього контрольного гена (BCR, ABL1, GUSB). Але слід прийняти до уваги, що чутливість методу та результати варіюють від лабораторії до лабораторії, оскільки використовуються різні протоколи, реактиви, внутрішні контрольні гени та гени-калібратори. Тому результат слід подавати у міжнародній шкалі (IS), де 100% BCR-ABL1IS (відповідно до International Randomized Study of Interferon (IRIS) and STI571) відповідає стандартизованій базовій лінії, а 3- log зменшення кількості химерного гена від базової лінії визначається поняттям MMR (BCR-ABL1<0,1%, або MR3). Для вираження результату у IS кожна лабораторія повинна мати власні протоколи дослідження та отримати свій власний корегуючий коефіцієнт - фактор конверсії (CF - Conversion Factor), який визначається шляхом обміну зразками з референтною лабораторією (такою у Європі є референс-лабораторія в Мангеймі, Німеччина), чи шляхом використання наборів і реагентів, що були калібровані World Health Organization International Genetic Reference Panel для кількісного BCR-ABL1 мРНК. Згідно з сучасними вимогами лабораторії повинні досягнути такого рівня чутливості методики, щоб визначати MR4,5, тобто слід так оптимізувати протокол роботи, щоб у тому ж об'ємі кДНК, у якому досліджуємо BCR-ABL1 визначати більшу кількість копій контрольного гену (ABL1>32000 чи GUSB>77000) [7, 9].

Метод PCR застосовується як для діагностики ХМЛ, так і для моніторингу MRD в процесі терапії. Чутливість цього методу висока і дозволяє виявити одну єдину клітину зі специфічною ДНК або РНК серед 104-105 клітин. Молекулярний моніторинг рівня р210 BCR-ABL1 транскрипта за допомогою RQ-PCR використовується в якості оцінки відповіді на лікування у пацієнтів з ХМЛ. Це особливо важливо при терапії ХМЛ ІТК, коли резидуальна кількість лейкемічних клітин нижче рівня чутливості цитогенетичного дослідження.

З кожним роком все більш зрозумілими стають механізми виникнення та протікання ХМЛ, покращуються методи лікування. Поряд з вдосконаленням препаратів ІТК [12, 13] створюються принципово нові лікувальні препарати, зокрема, алостеричний інгібітор BCR-ABL1 - асцитініб [14] та інгібітор синтезу білків сінрібо [15]. Зокрема, RQ-PCR відіграє фундаментальну роль у діагностиці та моніторингу процесу лікування новітніми препаратами.

Висновки

З появою у лікувальній практиці високоспецифічного ІТК - іматинібу, а згодом наступних поколінь інгібіторів (дасатініб, нілотініб, босутиніб, понатиніб) у хворих швидко досягається CCyR, і тому для подальшого дослідження ефективності лікування та моніторингу за рівнем експресії химерного гена у таких хворих використовують різноманітні модифікації PCR. Метод RQ-PCR дозволяє визначати динаміку рівня BCR-ABL1 мРНК у периферичній крові і кістковому мозку хворих на ХМЛ під час лікування та відслідковувати MRD у пацієнтів, що досягли дуже низького рівня захворювання. Тому поняття MR та його кількісне вираження потребує стандартизованого визначення. А ретельний регулярний моніторинг MR допоможе лікарям-гематологам вибрати найбільш відповідний препарат та оптимізувати стратегію лікування пацієнтів із даною патологією.

Література

1. Jabbour E., Kantarjian H. Chronic myeloid leukemia: 2018 update on diagnosis, therapy and monitoring. Am J Hematol. 2018;93(3):442-59. https://doi.org/10.1002/ajh.25011.

2. Yu S., Cui M., He X., Jing R., Wang H. A review of the challenge in measuring and standardizing BCR-ABL1. Clin Chem Lab Med. 2017;5 5(10): 1465-73. https://doi.org/10.1515/cclm-2016-0927.

3. Глузман Д.Ф., редактор. Діагностика мієлоїдних новоутворень і гострих лейкозів: науково-методичний посібник. Ін-т експерим. патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України. Київ: ДА, 2016. 123 с.

4. Bixby D., Talpaz M. Mechanisms of resistance to tyrosine kinase inhibitors in chronic myeloid leukemia and recent therapeutic strategies to overcome resistance. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2009;(1):461-76. https://doi.org/10.1182/asheducation-2009.1.461.

5. Мисюрин А.В., Мисюрина Е.Н., Тихонова В.В., Крутов А.А., Кесаева Л.А., Финашутина Ю.П. и др. Частота встречаемости мутаций киназного домена гена BCR-ABL у больных хроническим миелолейкозом, резистентных к терапии иматинибом. Российский биотерапевтический журнал. 2016; 4(15): 102-9. DOI: 10.17650/17269784-2016-15-4-102-109.

6. Nicolini F.E., Basak G.W., Kim D.W. Overall survival with ponatinib versus allogeneic stem cell transplantation in Philadelphia chromosomepositive leukemias with the T315I mu-.

7. Jabbour E., Kantarjian H. Chronic myeloid leukemia: 2018 update on diagnosis, therapy and monitoring. Am J Hematol. 2018;93(3):442-59. https://doi.org/10.1002/ajh.25011

8. Yu S., Cui M., He X., Jing R., Wang H. A review of the challenge in measuring and standardizing BCR-ABL1. Clin Chem Lab Med. 2017;5 5( 10): 1465-73. https://doi.org/10.1515/cclm-2016-0927.

9. Gluzman D.F., redactor. [Diagnosis of myeloid tumors and acute leukemias: a scientific-methodical manual]. RE Kavetsky Institute of Experimental Pathology, Oncology and Radiobiology, National Academy of Sciences of Ukraine. Kyiv: DIA, 2016. 123 р. Ukrainian.

10. Bixby D., Talpaz M. Mechanisms of resistance to tyrosine kinase inhibitors in chronic myeloid leukemia and recent therapeutic strategies to overcome resistance. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2009;(1):461-76. https://doi.org/10.1182/asheducation-2009.1.461.

11. Misyurin A.V., Misyurina E.N., Tichonova V.V., Krutov A.A., Kesaeva L.A., Finashutina Yu.P., et al. BCR-ABL gene kinase domain mutation frequency in imatinib resistant chronic myeloid leukemia patients. Russian journal of biotherapy. 2016; 4(15): 102-9. DOI: 10.17650/1726-97842016-15-4-102-109.

12. Nicolini F.E., Basak G.W., Kim D.W. Overall survival with ponatinib versus allogeneic stem cell transplantation in Philadelphia chromosomepositive leukemias with the T315I tation. Cancer. 2017; 23(15):2875-80. https://doi.org/10.1002/cncr.30558.

13. Cross N.C., White H.E., Colomer D., Ehrencrona H., Foroni L., Gottardi E., Lange T., et al. Laboratory recommendations for scoring deep molecular responses following treatment for chronic myeloid leukemia. Leukemia. 2015;29(5):999-1003. https://doi.org/10.1038/leu.2015.29.

14. Izzo B., Gottardi E.M., Errichiello S., Daraio F., Barate C., Galimberti S. Monitoring Chronic Myeloid Leukemia: How Molecular Tools May Drive Therapeutic Approaches. Front Oncol. 2019;9:833. https://doi.org/10.3389/fonc.2019.00833.

15. Cross N., Muller M., Pane F., Hochhaus A EUTOS Molecular Monitoring Steering Group. Working definitions of molecular response in CML. Blood. 2013:1-6.

16. http://www.gbmh.es/files/memorias/1387357636.pdf.

17. Chauhan R., Sazawal S., Pati H. Laboratory Monitoring of Chronic Myeloid Leukemia in Patients on Tyrosine Kinase Inhibitors. Indian J. Hematol Blood Transfus. 2018; 34(2):197-203. https://doi.org/10.1007/s12288-018-0933-1.

18. Mahon F.X., Etienne G. Deep Molecular Response in Chronic Myeloid Leukemia: The New Goal of Therapy? Clin Cancer Res. 2014; 20(2):310-22. https://doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-13-1988.

19. Soverini S., Benedittis C., Mabcini M., Martinelli G. Best Practices in Chronic Myeloid Leukemia Monitoring And Management. Oncologist. 2016;21(5):626-33. https://doi.org/10.1634/theoncologist.2015-0337 mutation. Cancer. 2017;123(15):2875-80. https://doi.org/10.1002/cncr.30558.

20. Cross N.C., White H.E., Colomer D., Ehrencrona H., Foroni L., Gottardi E., Lange T., et al. Laboratory recommendations for scoring deep molecular responses following treatment for chronic myeloid leukemia. Leukemia. 2015;29(5):999-1003. https://doi.org/10.1038/leu.2015.29.

21. Izzo B., Gottardi E.M., Errichiello S., Daraio F., Barate C., Galimberti S. Monitoring Chronic Myeloid Leukemia: How Molecular Tools May Drive Therapeutic Approaches. Front Oncol. 2019;9:833. https://doi.org/10.3389/fonc.2019.00833.

22. Cross N., Muller M., Pane F., Hochhaus A. EUTOS Molecular Monitoring Steering Group. Working definitions of molecular response in CML. Blood. 2013:1-6.

23. http://www.gbmh.es/files/memorias/1387357636.pdf.

24. Chauhan R., Sazawal S., Pati H. Laboratory Monitoring of Chronic Myeloid Leukemia in Patients on Tyrosine Kinase Inhibitors. Indian J Hematol Blood Transfus. 2018; 34(2):197-203. https://doi.org/10.1007/s12288-018-0933-1.

25. Mahon F.X., Etienne G. Deep Molecular Response in Chronic Myeloid Leukemia: The New Goal of Therapy? Clin Cancer Res. 2014; 20(2):310-22. https://doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-13-1988.

26. Soverini S., Benedittis C., Mabcini M., Martinelli G. Best Practices in Chronic Myeloid Leukemia Monitoring And Management. Oncologist. 2016;21(5):626-33. https://doi.org/10.1634/theoncologist.2015-0337.

27. Rivera-Torres J., San Jose E. Src Tyrosine Kinase Inhibitors: New Perspectives on Their Immune, Antiviral, and Senotherapeutic Potential. Front. Pharmacol. 2019;10(1001):1-7. https://doi.org/10.3389/fphar.2019.01011.

28. Westerweel P.E., Boekhorst P.A., Levin M.D., Cornelissen J.J. New Approaches and Treatment Combinations for the Management of Chronic Myeloid Leukemia. Front Oncol. 2019;9:665. https://doi.org/10.3389/fonc.2019.00665.

29. Yakhni M., Briat A., El Guerrab A., Furtado L., Kwiatkowski F., Miot-Noirault E., Cachin F., et al. Homo-harringtonine, an approved antileukemia drug, suppresses triple negative breast cancer growth through a rapid reduction of anti-apoptotic protein abundance. Am J Cancer Res. 2019;9(5):1043-60.

30. Rivera-Torres J., San Jose E. Src Tyrosine Kinase Inhibitors: New Perspectives on Their Immune, Antiviral, and Senotherapeutic Potential. Front. Pharmacol. 2019;10(1001):1-7. https://doi.org/10.3389/fphar.2019.01011.

31. Westerweel P.E., Boekhorst P.A., Levin M.D., Cornelissen J.J. New Approaches and Treatment Combinations for the Management of Chronic Myeloid Leukemia. Front Oncol. 2019;9:665. https://doi.org/10.3389/fonc.2019.00665.

32. Yakhni M., Briat A., El Guerrab A., Furtado L., Kwiatkowski F., Miot-Noirault E., Cachin F., et al. Homo-harringtonine, an approved antileukemia drug, suppresses triple negative breast cancer growth through a rapid reduction of anti-apoptotic protein abundance. Am J Cancer Res. 2019;9(5):1043-60.

Размещено на Allbest.ru