Вплив фотодинамічної вірусінактивації плазми крові на фракційний склад білків та активність факторів системи гемостазу

Размещено на http://www.allbest.ru/

ДУ «Інститут гематології та трансфузіології НАМН України»

ВПЛИВ ФОТОДИНАМІЧНОЇ ВІРУСІНАКТИВАЦІЇ ПЛАЗМИ КРОВІ НА ФРАКЦІЙНИЙ СКЛАД БІЛКІВ ТА АКТИВНІСТЬ ФАКТОРІВ СИСТЕМИ ГЕМОСТАЗУ

С.Ю. Сергутіна, А.С. Тимченко, С.В. Бурнаєва

Київ

Резюме

У роботі наведено дані щодо впливу різних режимів експериментальної фотодинамічної вірусінактивації на показники фракційного складу білків і активність факторів системи гемостазу плазми крові донорів.

Ключові слова: плазма крові донорів, фотодинамічна вірусінактивація, загальний білок, фракційний склад, фактори системи гемостазу.

Резюме

ВЛИЯНИЕ ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ВИРУСИНАКТИВАЦИИ ПЛАЗМЫ КРОВИ НА ФРАКЦИОННЫЙ СОСТАВ БЕЛКОВ И АКТИВНОСТЬ ФАКТОРОВ СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА

С.Ю. Сергутина, А.С. Тимченко, С.В. Бурнаева

ГУ «Институт гематологии и трансфузиологии НАМН Украины», Киев

В работе приведены данные о влиянии различных режимов экспериментальной фотодинамической вирусинактивации на показатели фракционного состава белков и активность факторов системы гемостаза плазмы крови доноров.

Ключевые слова: плазма крови доноров, фотодинамическая вирусинактивация, общий белок, фракционный состав, факторы системы гемостаза.

Annotation

INFLUENCE OF PHOTODYNAMIC VIRUS INACTIVATION OF BLOOD PLASMA ON FRACTIONAL COMPOSITION OF PROTEINS AND ACTIVITY OF FACTORS OF HAEMOSTASIS SYSTEM

S.Yu. Sergutina, A.S. Timchenko, S.V. Burnayeva SI «Institute of Haematology and Transfusiology of NAMS of Ukraine», Kyiv

The data about the influence of the different regimes of experimental photodynamic virus inactivation on the indices of peptide's fractional composition and activity of the factors of haemostasis system are given in the article.

Key words: donor blood plasma, photodynamic virus inactivation, whole protein, fractional composition, factors of haemostasis system.

Вступ

Однією з пріоритетних задач сучасної виробничої трансфузіології є забезпечення інфекційної безпеки біопрепаратів, які отримують із плазми крові донорів [1]. Найефективнішим і перспективним є шлях підвищення інфекційної безпеки за рахунок впровадження сучасних методів інактивації та/або деконтамінації патогенів у плазмі крові донорів, одним із яких є фотодинамічна вірусінактивація. Але процес знезараження може негативно вплинути на якість білкових компонентів плазми.

Мета роботи - дослідити вплив різних режимів експериментальної фотодинамічної вірусінактивації з використанням фотосенсибілізатора метиленового синього і дозованого опромінення ультрафіолетовим і видимим світлом на показники білкового складу і лабільні білки системи гемостазу (фактори зсідання крові).

Матеріали і методи

гемостаз вірусінактивація фотосенсибілізатор білок

У дослідах використовували зразки свіжозамороженої плазми (СЗП) крові донорів, інфіковані вірусами гепатиту В або С, що були відбраковані Київським міським Центром крові. Після розморожування і центрифугування їх об'єднували в пули (суміш плазми крові від 3-4 донорів у рівних об'ємах) для подальшого експериментального дослідження.

В якості фотосенсибілізатора в роботі був застосований метиленовий синій (МС) виробництва фірми «Merck» (Німеччина) з молекулярною масою 374 а.о.м.

Опромінення ультрафіолетовим (УФО, довжина хвилі 1=254 нм) і видимим (ВС, довжина хвилі 1=640 нм) світлом дослідних зразків пулів плазми крові проводили за допомогою експериментальної моделі «Пристрою для знезаражування рідини» (декл. патент України № 7835) [2] при фіксованому об'ємі плазми (20 мл). Дози опромінення складали 75, 90 і 120 Дж.

Показники фракційного складу білків та активність факторів системи гемостазу дослідних зразків плазми визначали до і після проведення фотодинамічної вірусінактивації. Досліджували наступні показники складу білків: загальний білок і його фракції (альбуміни (А) і глобуліни (аі-, а2-, в-, у-Г)), співвідношення альбумінів і глобулінів (А/Г) та співвідношення альбумінової фракції до суми аіі а2глобулінів (А/аі - а2). Загальний білок визначали за загальноприйнятою методикою [3] з використанням тест-набору виробництва ТОВ НВП «Філісіт-Діагностика» (Україна). Склад білкових фракцій досліджували за допомогою турбідиметричного методу, описаного у [4].

Дослідження факторів зсідання крові V, VII, VIII, IX і XI проводили за загальноприйнятими методами [5] з використанням реактивів фірм «ЛКМ» (Україна), «Simko» (Україна) та «Cormay» (Польща).

Статистичну обробку отриманих даних проводили за допомогою прикладних комп'ютерних програм STATISTICA 5.5. Результати аналізу вважали достовірними при р < 0,05.

Результати та їх обговорення

Було проведено чотири серії дослідів із визначення впливу різних режимів фотодинамічної вірусінактивації на показники фракційного складу білків і лабільні білки системи гемостазу (фактори зсідання крові).

Попередню обробку зразків СЗП фотосенсибілізатором МС проводили наступним чином: в асептичних умовах при кімнатній температурі без доступу видимого світла в пул інфікованої плазми додавали розчин МС, доводили до кінцевої концентрації 10 мкмоль/л (дослідна проба 2) і витримували протягом однієї години. Після чого плазму розділяли на частини і піддавали різним режимам обробки:

1. Фотосенсибілізація зразків пулів донорської плазми МС (кінцева концентрація в плазмі складала 10 мкмоль/л) протягом однієї години без доступу видимого світла (проба 3).

2. УФО зразків пулів фотосенсибілізованої плазми в дозах від 75 до 120 Дж (проби 4-6).

3. Опромінення пулів фотосенсибілізованої плазми ВС у дозах від 75 до 120 Дж (проби 7-9).

4. Комбіноване застосування УФО і ВС у дозах 90 і 120 Дж для знезараження зразків пулів фотосенсибілізованої донорської плазми (проби 10 та 11).

Зразком порівняння слугувала СЗП після розморожування і центрифугування (вихідна плазма, проба 1).

Результати дослідження впливу різних режимів фотодинамічної вірусінактивації донорської плазми на рівень загального білка та його фракційний склад наведені в таблиці.

Як видно з отриманих даних, показники загального білка, альбумінової і глобулінової фракцій усіх дослідних груп у порівнянні з вихідною плазмою суттєво не змінювалися при різних режимах фотодинамічного знезараження вірусів. Але спостерігалася тенденція зменшення вмісту загального білка з (75,28 ± 4,55) г/л (вихідна плазма) до (72,81 ± 4,51) г/л (проба 11, що відповідає максимальному дозовому навантаженню 120 Дж при комбінованому опроміненні УФ і ВС). Також не було виявлено статистично достовірних змін у жодній із глобулінових фракцій (аі, а2, в і у) усіх дослідних проб донорської плазми (табл.), і, тим самим, майже не змінювалися співвідношення А/Г та А/аі - а2 (див. табл.).

Таблиця

Вплив різних режимів вірусінактивації плазми крові донорів на фракційний склад білків (M ± m)

Це свідчить про відсутність суттєвого впливу різних режимів застосування агентів фотодинамічного знезараження (МС та дозованого опромінення УФ і ВС) на якісні показники білків плазми крові донорів.

При дослідженні факторів зсідання крові V, VII, VIII, IX та XI найбільший вплив фотодинамічної вірусінактивації спостерігався на фактори VIII та ІХ (рис. 1). Причому, при однаковому дозованому навантаженні дія ВС була впливовішою (рис. 1, проби 7-9), ніж УФО (рис. 1, проби 4-6). Максимальне зниження активності факторів VIII та ІХ (відповідно на 9,5% і 8,7% від показника у вихідній плазмі) було при сумісній дії УФО і ВС у дозі 120 Дж (рис. 1, проба 11). Тоді як активність факторів V, VII і ХІ майже не змінювалася при різних режимах обробки інфікованої плазми (рис. 1).

Рис. 1 Вплив фотодинамічної вірусінактивації на активність факторів системи гемостазу

Результати проведених експериментальних досліджень показників фракційного складу білків плазми крові донорів та активності факторів системи гемостазу співпадають із даними закордонних дослідників. Так, Т. Zeiler і співавт. виявили, що рівні загального білка, альбуміну, трансферину, гаптоглобіну, аі-антитрипсину, імуноглобулінів і факторів комплементу не відрізнялись від їх значень в інтактних зразках розмороженої СЗП, тоді як активність факторів V i VIII зменшувалася майже до нижньої межі норми, але ці зміни були пов'язані не тільки з дією фотодинамічних факторів, але й із процесом зберігання і розморожування плазми крові [6]. Дослідження Р. Муг і співавт. [7] показали, що на активність факторів зсідання крові впливає лише етап опромінення плазми. При цьому найлабільнішим є ф. VIII, тоді як фібриноген і ф. Х менше підпадають під вплив агентів фотодинамічної обробки. Проте зміни показників активності факторів не виходять за межі фізіологічної норми. За даними X.P. Zhou і співавт. [8], значення ПЧ, АЧТЧ і ф. VIII знижувалися недостовірно, тоді як інші дослідні показники (фактори V, XI, кількість фібриногену) системи гемостазу залишалися незмінними. Дослідження біохімічних і гемостазіологічних показників донорської плазми після фотохімічної інактивації патогенних біологічних агентів за допомогою пристрою Macotronic V4 («MacoPharma S.A., Франція), в якому використовується опромінення фотосенсибілізованої МС плазми видимим світлом, що були проведені C. Politis і співавт. [9], а також А.В. Чечоткіним і співавт. [10], показали, що основні гематологічні показники плазми не змінювалися, але відмічалося незначне збільшення вільного гемоглобіну, а також зниження вмісту фібриногену і активності ф. VIII, що не впливало на біологічну повноцінність плазми як компонента крові.

Отже, проведені експериментальні дослідження по вивченню впливу фотодинамічної вірусінактивації плазми крові донорів із застосуванням фотосенсибілізатора метиленового синього та дозованого опромінення ультрафіолетовим і видимим світлом не виявили достовірних змін показників фракційного складу білків та активності факторів системи гемостазу.

Література

1. Зубкова Н.В. Обеспечение вирусной безопасности препаратов из плазмы крови человека / Н.В. Зубкова // Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины: матер. Всеросс. науч.практ. конференции (г. Киров, 6-7 октября 2010 г.). Киров: Б.и., 2010. С. 120-121.

2. Декл. патент на корисну модель 7835 UA, МПК C 02 F 1/32. Пристрій для знезаражування рідини / А.С. Тимченко, В.В. Бондар, С.Ю. Сергутіна; заявник та патентовласник Інститут гематології та трансфузіології АМН України. № 20041109664; заявл. 24.11.2004; опубл. 15.07.2005, Бюл. № 7.

3. Контроль якості свіжозамороженої плазми: метод. рекомендації / П.М. Перехрестенко, А.М. Чугрієв, Т.О. Терещук, І.А. Матвєєва. К.: Б.и., 2009. 27 с.

4. Медицинские лабораторные технологии: справочник в 2 т. т. Т. 2. / Под ред. А.И. Карпищенко. СПб.: Интермедицина, 1999. 656 с. (С. 50-71).

5. Баркаган З.С. Диагностика и контролируемая терапия нарушений гемостаза: изд-е 2-е доп. / З.С. Баркаган, А.П. Момот - М.: «Ньюдиамед», 2001. 296 с.

6. The effect of methylene blue phototreatment on plasma proteins and in vitro coagulation capability of single-donor fresh-frozen plasma / T. Zeiler, H. Riess, G. Wittmann [et al.] // Transfusion. 1994. Vol. 34. № 8. Р. 685-689.

7. Муг Р. Сохранение качества плазмы после обработки метиленовым синим / Муг Р., Рейхенберг Ш., Мюллер Н.. // Трансфузиология. 2007. Т. 8, № 1-2. С. 64-65.

8. The effect of methylene blue/ photochemical method for virus inactivation on plasma components / X.P. Zhou, J.B. Xu, P. Sun [et al.] // Zhonghua Shi Yan Xue Za Zhi. 2003. № 11 (3). Р. 305-307.

9. Quality and safety of fresh-frozen plasma inactivated and leucoreduced with the Theraflex methylene blue system including the Blueflex filter: 5 years' experience / C. Politis, L. Kavallierou, S. Hantziara [et al] // Vox Sang. 2007. Vol. 92. № 4. Р. 319-326.

10. Влияние фотохимической инактивации биологических агентов на качество донорской плазмы / А.В. Чечеткин, В.Н. Вильянинов, И.В. Плугарева [и др.] / Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии: матер. Всеросс. науч.-практ. конференции (г. Санкт-Петербург, 5-6 июля 2011 г.) // Трансфузиология. 2011. Т. 12. № 2. С. 131.

Размещено на Allbest.ru