Новий метод отримання комплексу факторів VIII/Фон Віллебранда

Размещено на http://allbest.ru

ДУ «Інститут патології крові та трансфузійної медицини

НАМИ України»

Новий метод отримання комплексу факторів VIII/фон Віллебранда

Н.О. Шурко

Львів

Резюме

Хвороба Віллебранда разом із гемофілією є найпоширенішими захворюваннями системи гемостазу. Для лікування цих захворювань використовують препарати FVIII.

Мета роботи - дослідити співвідношення факторів VIII/фон Віллебранда на різних етапах технології отримання антигемофільного препарату.

Методи дослідження: фракціонування, іонообмінна та барвник-лігандна афінна хроматографії.

Результати. У статті наведено результати досліджень очищення комплексу факторів VIII/фон Віллебранда, що є комбінацією попереднього фракціонування з наступними етапами іонообмінної та барвник-лігандної хроматографії. Охарактеризовано основні переваги цього методу.

Висновки. Встановлено, що метод афінної хроматографії на кремнеземних сорбентах забезпечує збереження вихідного (фізіологічного) рівня співвідношення фактора VIII до фактора фон Віллебранда та збереження виходу продукту від вихідного до 96,32%.

Ключові слова: фактор FVIII зсідання крові, фактор фон Віллебранда, хроматографія, фракціонування, кремнеземні сорбенти, тріазинові барвники.

Resume

The new method for obtaining a complex of factors VIII /von willebrand

N.O. Shurko

SI «Institute of Blood Pathology and Transfusion Medicine NAMS of Ukraine», Lviv

Willebrand's disease togethe with hemophilia is the most common disease of the hemostas is system. The concentrate of blood coagulation actor VIII isused for the treatment of these diseases.

Purpose of the work: investigate the proportion of factors VIII/von Willebrand at various stages of the technology of obtaining an antihemophilic concentrate.

Methods of research: fractionation, ionexchange and dye-ligand affinity chromatography.

Results.The paper presents the results of studies of purification complex of factors VIII/von Willebrandwhich is a combination of the method of fractionation with the next steps of ion exchange and dye-ligand affinity chromatography. The main advantages of these methods are described.

Conclusions. Instaled, that the method of affinity chromatography on silica sorbents provides preservation of the initial (physiological) level of the ratio factor VIII to von Willebrand's factor.

Key words: blood coagulation factor VIII, von Willebrand's factor, chromatography, fractionation, silica sorbents, triazine dyes.

Вступ

Відомо, що фактор VIII (FVIII) циркулює в плазмі крові разом з іншим глікопротеїном - фактором фон Віллебранда (vWF), утворюючи нековалентний комплекс [1]. Хвороба Віллебрнада разом із гемофілією є найпоширенішими захворюваннями системи гемостазу [5], а причиною виникнення є дефіцит або аномальна мультимерна будова молекули vWF. Доволі часто у таких хворих спостерігається й зниження активності FVIII, як непрямий наслідок кількісних і якісних змін vWF. Для лікування обох цих захворювань використовують препарати FVIII. Крім цього, слід зазначити, що у лікуванні хвороби Віллебранда використовують і препарат десмопресин, що сприяє вивільненню ендогенного vWF з ендо- теліальних клітин. У роботі [77] відмічено, що для лікування хвороби фон Віллебранда 3-го типу та хворих, що не дають відповіді на застосування десмопресину, використовують комплексні препарати FVIII-vWF. Вміст vWF у цих препаратах, а, відповідно, і співвідношення FVIII/vWF змінюється в дуже широких межах залежно від методів отримання. Проте, слід підкреслити, що найрозповсюдженіший спосіб отримання очищеного препарату FVIII методом іонообмінної хроматографії не дозволяє стандартизувати вміст в ньому vWF [5].

Більшість зареєстрованих препаратів FVIII розроблені для лікування гемофілії А та, відповідно, мають низький вміст vWF. Використання таких препаратів у лікуванні хвороби Віллебранда, перш за все, пов'язане з підвищеним ризиком виникнення тромбозів [1] та може стати причиною основного ускладнення такої терапії - появою інгібіторних антитіл [5, 7].

Дослідження in vitro продемонстрували, що використання препаратів FVIII з високим вмістом vWF, знижує ризик виникнення інгібіторів [8]. Клінічні дослідження підтвердили, що використання рекомбінантних препаратів без vWF в 2,5-3 рази збільшує ризик виникнення інгібіторних форм гемофілії [7]. Так, у роботах Mannucci P.M. і Tagariello G. [7, 8] для лікування інгібіторних форм гемофілії А рекомендовано використовувати концентрати FVIII-vWF з високим вмістом vWF. Відносно лікування хвороби Віллебранда немає чіткої відповіді щодо співвідношення цих двох факторів, проте, у роботі Federici A.B. відмічено, що це співвідношення має бути не менше 0,77 [5]. Деякі із дослідників пропонують використовувати фактор фон Віллебранда як стабілізатор FVIII у готових препаратах на противагу альбуміну чи амінокислотам гліцину та лізину, оскільки він є природнім стабілізатором його активності [4], що не вимагає додавання стабілізаторів.

Метою роботи було - дослідити співвідношення FVIII/vWF на різних етапах технології отримання антигемофільного препарату.

Матеріали і методи дослідження

Вихідною сировиною для досліджень був препарат кріопреципітат - фракція кріоглобулінів, отримана з 1 дози свіжозамороженої плазми (СЗП), розведена до об'єму -20-30 мл робочого буферного розчину, що містила FVIII (>70 МО/дозу), vWF(>100 МО/дозу), фібриноген (>140 мг/дозу), FXIII, фібронектин та інші.

Визначення активності FVIII здійснювали уніфікованим одностадійним коагулогічним, а фактора фон Віллебранда - аглютинаційним (рістоміцин-кофакторна активність) методами. Концентрацію білка визначали методом Бредфорда за допомогою Кумасі діамантового голубого G-250. Синтез сорбентів з іммобілізованими тріазиновими барвниками проводили за методикою «з включенням солі» протягом тривалого часу при лужних значеннях рН [3]. гемостаз антигемофільний віллебранд кров

Осадження білків проводили гідроксидом алюмінію (ІІІ) та розчином ПЕГ-4000 до кінцевої концентрації 3% та 32% відповідно.

У технологічний процес отримання включили етап іонообмінної хроматографії на DEAE-Sepharose та барвник-лігандної афінної хроматографії на макропористих кремнеземних сорбентах.

Результати та їх обговорення

Використання хроматографічних методів у фракціонуванні плазми крові дозволило отримати препарати факторів зсідання (зокрема, FVIII) високого рівня чистоти та питомої активності [4].

Нашими дослідженнями з'ясовано, що FVIII не сорбується жодним зі синтезованих сорбентів, однак питома активність у розчині зростає, а, відповідно, відбувається процес очищення [2, 3]. Тобто, у нашому випадку зростання питомої активності FVIII зсідання крові можна пояснити явищем негативної афінної сорбції. Ми відібрали групу, для якої характерне найкраще зв'язування нецільових білків: Діасорб-Активний алий 4ЖТ, Діасорб-Procion blue HB, Діасорб-Procion gelb M4R, Діасорб-Procion blue MXR і Діасорб-Активний яскраво-голубий К [2]. Дані підтверджуються статистично двовибірковим t-тестом з різними дисперсіями при визначенні значущості різниці між групами. При статистичному аналізі встановлено, що існує достовірна відмінність між концентрацією нанесеного білка та сорбованого (р>0,95), але не проявляється достовірна відмінність між активністю фактора до нанесення та у супернатанті після сорбції (р <0,95) (рис. 1.).

Рис. 1. Порівняльна характеристика зміни концентрації білка та активності FVIII при нанесенні на макропористі кремнеземні сорбенти

При розробці та проведенні етапів виділення та очищення FVIII важливо враховувати співвідношення FVIII/vWF, оскільки воно має важливе значення як у процесі виробництва (захищає FVIII від протеолітичної деградації), так і в клінічному використанні отриманих препаратів фактора.

Проведені нами дослідження цього показника продемонстрували наступне: зміни у співвідношенні FVIn/vWF:R_cof були незначними (рис. 2), тобто синтезовані нами сорбенти проявляють негативну афінну сорбцію і по відношенню до vWF.

Рис. 2. Зміни у співвідношенні FVIII/vWF:R_cof у супернатанті під час афінної сорбції з відібраними сорбентами

Розроблена нами схема отримання очищеного FVIII передбачала поєднання методів фракціонування, іонообмінної та афінної хроматографії на кремнеземних сорбентах [9].

Встановлено, що попередні етапи видалення нецільових білків приводять до значно вищого ступеня очищення кінцевого препарату. Це, очевидно, зумовлено тим, що метод іонообмінної хроматографії на DEAE-Sepharose використовується також для отримання інших факторів зсідання крові, зокрема, тромбіну, FVII та FIX [6].

Попереднє видалення цих білків нівелює теоретичну можливість їх конкурентного зв'язування з іонообмінником. Крім цього, без попереднього видалення нецільових білків при елюції FVIII частина їх може кое- лювати разом з досліджуваним білком.

До етапу проведення негативної афінної хроматографії на макропористих кремнеземних сорбентах з тріазиновими барвниками в ролі лігандів співвідношення FVIII/vWF:Rc_of зросло відносно вихідного приблизно вдвічі (табл. 1).

Таблиця 1 - Співвідношення FVIII/vWF на різних етапах очищення FVIII

На етапі проведення хроматографічного очищення FVIII з використанням макропористих кремнеземних сорбентів з тріазиновоми барвниками в ролі лігандів воно суттєво не змінилось, що надає нам підставу вважати, що синтезовані матриці не сорбують vWF.

Рис. 3. Іонообмінна хроматографія FVIII/vWF на DEAE-Sepharose Примітки: 1 - нанесення; 2 - проскок; 3 - промив; 4 - елюція

Визначення співвідношення проводили у двох експериментах:

• без попереднього переосадження домішкових білків;

• з етапами попереднього очищення.

Для елюції фактора з DEAE-Sepharose ми використали буфер з 0,3 М NaCl, щоб забезпечити коелюцію комплексу FVIII-vWF.

Однак, частина vWF елюювалася з першими фракціями (до виходу FVIII). Відповідно, в основній фракції, що містила FVIII зменшилась кількість vWF і, як наслідок, зростало співвідношення FVIII/vWF:Rcof.

На етапі проведення негативної афінної хроматографії, оскільки жоден з цих факторів не сорбується із сорбентами, співвідношення між ними залишається сталим. Отже, використання макропористих кремнеземних сорбентів з тріазиновими барвниками забезпечує не лише зростання питомої активності FVIII, але й не змінює співвідношення FVIII/vWF:R_cof, яке суттєво змінюється на етапі проведення іонообмінної хроматографії.

Встановлено, що основні втрати від вихідної активності FVIII (до 24%) відбувалась на етапі іонообмінної хроматографії. Оскільки очищення антигемофільного фактора на кремнеземних сорбентах відбувалось завдяки явищу негативної афінної сорбції втрати від активності на цьому етапі є незначними (3,7%), що є ще одним ваговим аргументом застосування даного методу в технології отримання очищеного препарату.

Висновки

Розроблений нами метод очищення FVIII зсідання крові на макропористих кремнеземних сорбентах з тріазиновими барвниками в ролі лігандів має низку переваг над розповсюдженими методами іонообмінної хроматографії у технології отримання антигемофільного препарату.

Оскільки очищення комплексу FVIII-vWF відбувалось завдяки явищу негативної афінної сорбції, вихід продукту на етапі афінної хроматографії на макропористих кремнеземних сорбентах з іммобілізованими активними барвниками становить 96,32%, а також зберігається початкове співвідношення FVIII/vWF:Rcof.

Література

1. Выделение комплекса FVIII/фактора Виллебранда из плазмы донорський крови / О.Г. Кутюрова, Т.Л. Дереза, И.А. Скрылева, А.Л. Берковский // Гематология и трансфузиология. - 2014. - № 4 (59). - С. 19-24.

2. Пат. 107509 UA, С07К 1/22, С07К 14/755, В0Ш 15/18. Спосіб виділення фактора VIII згортання крові / Шурко Н.О., Даниш Т.В., Новак В.Л. - № U201512302, заявлено 11.12.2015; опубл. 10.06.2016, Бюл. № 11.

3. Шурко Н.О. Створення технології отримання фактора VIII зсідання крові з використанням методу афінної хроматографії на кремнеземних сорбентах / Н.О. Шурко, Т. В. Даниш // Біологія тварин. - 2016. -18 (2). - С. 152-159.

4. Cheng E. Purification of coagulation factor VIII by liquid chromatography / E. Cheng // J Blood Disord Transfus. - 2016.- 7:4 (Suppl). - Р. 82.

5. Federici A. B. Highly purified VWF/FVIII concentrates in the treatment and prophylaxis of the von Willebrand disease: the PRO.WILL Study / А.В. Federici // Haemophilia. - 2007. - 13(5). - Р.15-24.

6. Hashimoto N. A method for systematic purification from bovine plasma of six vitamin K-dependent coagulation factors: Prothrombin, Factor X, Factor IX, Protein S, Protein C and Protein Z / N. Hashimoto, T. Morita, S. Iwanaga // J. Biochem. - 1985. V.97. - P. 1347-1355.

7. Mannucci P. M. Drug Therapy: Treatment of von Willebrand disease / P.M. Mannucci // N. Engl. J. Med. -2004. - 351 (7). - Р. 683-694.

8. In vitro reactivity of factor VIII inhibitors with von Willebrand factor in different commercial factor VIII concentrates / G. Tagariello, D. Zanotto, P. Radossiet [et al.] // Am. J. Haematol. - 2007. - 82 (6). - P. 460-462.

9. Shurko N. Technological scheme for the preparation of purification factor VIII coagulation / N. Shurko, Т. Danysh // International Journal of laboratory Hematology. 2017. - Vol. 39 (Issue S2). - P. 109.

Размещено на Allbest.ru