Ендокринні дизраптори - пренатальні чинники розладів репродуктивного здоров'я

Размещено на http://www.allbest.ru/

Ендокринні дизраптори - пренатальні чинники розладів репродуктивного здоров'я Стаття підготовлена за результатами виконання науково-дослідної роботи «Експериментальне дослідження репродуктивних, адаптивних та поведінкових ефектів пренатальної дії ендокринних дизрапторів» ДУ «Інститут ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка НАМН України» (№ державної реєстрації: 0120U100711).

О.Г. Резніков, О.В. Сачинська,

ДУ «Інститут ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка НАМН України»

Резюме

В оглядовій статті висвітлюється проблема потенційної небезпеки ендокринних дизрапторів (ЕД) -- хімічних забруднювачів довкілля, які здатні порушувати гормональний гомеостаз -- для внутріш- ньоутробного плоду. Чимало ЕД, які потрапляють до організму вагітної, долають плацентарний бар'єр і становлять загрозу для розвитку плоду. Систематизовані дані основної літератури, що стосується пренатальних ефектів ЕД щодо розладів програмування нейроендокринної системи репродукції та поведінки, а також їх віддалених наслідків у людини й тварин. Негативні наслідки пренатального впливу ЕД виявляються навіть на тлі відсутності тератогенних ознак у новонароджених особин, що відповідає загальній концепції функціональної тератології. Особливу увагу приділено ефектам низьких доз, бо для багатьох ЕД характерною є відсутність прямої залежності біологічних ефектів від дози експозиції. Порівняння зі станом гіпоталамо-гіпофізарно-адренокортикальної системи (ГГАС) у потомства щурів, яке розвивалось в умовах експозиції вагітної матері до ЕД, показує вибірковість та уразливість саме системи репродукції в аспекті функціональних розладів. Система репродукції самців значно більш уразлива, порівняно з самицями. Перш за все, це виявляється при аналізі гормонального профілю і статевої поведінки. В огляді наведено результати власних досліджень щодо пренатальних ефектів дибутилфталату (ДБФ), ібупрофену та бісфенолу А (БФА). Вперше виявлено послаблення копулятивної поведінки в дорослих самців щурів на тлі нормальних рівнів статевих гормонів і кортикостерону внаслідок експозиції вагітних матерів до терапевтичних доз ібупрофену в критичному періоді статевої диференціації мозку (СДМ). У процесі експериментального дослідження пренатальних ефектів ДБФ вперше отримано дані про формування гіперандрогенного стану і гіперсексуальної поведінки в чоловічого потомства з наступною прискореною віковою інволюцією репродуктивних функцій. Субтератогенні дози БФА спричиняли в чоловічого потомства різко послаблені копулятивну поведінку і лордозні реакції в присутності нормального самця, а в самиць -- гіпоестрогенію та псевдокопулятивну чоловічу поведінку. Таким чином, епігенетичні порушення програми СДМ унаслідок пренатального впливу ЕД у дозах, що не викликають тератогенних ефектів, мають бути враховані при ви- ендокринний дизраптор дибутилфталат бісфенол

Фундаментальні дослідження значенні потенційної небезпеки ЕД для репродуктивного здоров'я.

Ключові слова: Ендокринні дизраптори, дибутилфталат, бісфенол А, ібупрофен, пренатальна дія, репродуктивна система, статева поведінка, щури.

O.G. Reznikov, O.V. Sachynska, O.A. Faliush,

A.A. Lymaryeva, I.G. Perchyk

State Institution «V.P. Komisarenko Institute of Endocrinology and Metabolism of the National Academy of Medical Sciences of Ukraine»

Abstract. The review article highlights the problem of the potential

danger of endocrine disruptors (EDs), chemical environmental pollutants which are capable of disrupting hormonal homeostasis, for the fetus. Many EDs that enter the body of a pregnant woman cross the placental barrier and pose a threat to the development of the fetus. The data of the main literature concerning the prenatal effects of EDs on the programming disorders of the neuroendocrine system of reproduction and behavior and their long-term consequences in humans and animals are systematized. Negative consequences of prenatal exposure to EDs are revealed even against the background of the absence of teratogenic abnormalities in newborns, which corresponds to the general concept of functional teratology. Special attention is paid to the effects of low doses, because EDs is characterized by the absence of a direct dependence of biological effects on the exposure dose. A comparison with the state of the hypothalamic-pituitary-adrenal system in rat offspring, which developed under conditions of exposure of the pregnant mother to EDs, shows the selectivity and vulnerability of the reproductive system in terms of functional disorders. The reproductive system of males is much more vulnerable compared to that of females. First of all, this is revealed when analyzing the hormonal profile and sexual behavior. The review presents the results of our own studies on the prenatal effects of dibutyl phthalate (DBP), ibuprofen and bisphenol A. Weakening of copulatory behavior in adult male rats against the background of normal levels of sex hormones and corticosterone due to the exposure of pregnant mothers to low doses of ibuprofen during the critical period of sexual differentiation of the brain was revealed for the first time. During the experimental study of the prenatal effects of dibutyl phthalate, data on the formation of a hyperandrogenic state and hypersexual behavior in male offspring with the subsequent accelerated age-related involution of reproductive functions were obtained for the first time. Subtera- togenic doses of bisphenol A caused in male offspring sharply weakened copulatory behavior and lordosis reactions in the presence of a normal male, and in females -- hypoestrogenia and pseudocopulatory male behavior. Thus, epigenetic disturbances of the sexual differentiation of the brain program due to prenatal exposure to EDs at doses that do not cause teratogenic effects should be taken into account when determining the potential danger of EDs for reproductive health.

Keywords: еndocrine disruptors, dibutyl phthalate, bisphenol A, ibuprofen, prenatal effect, reproductive system, sexual behavior, rat

ЕД і репродуктивне здоров'я

Поміж безлічі забруднювачів довкілля, які спричиняють негативний вплив на стан здоров'я людини й тварин, помітне місце посідають так звані ЕД, тобто «руйнівники» гормонального гомеостазу. Зазвичай мішенями ЕД є ендокринні залози, гормональні рецептори або ланцюги сигнальної трансдукції рецепторів і геном клітини [1].

Хоча ЕД привернули увагу дослідників ще на початку 90-х років минулого століття, справжній бум почався після появи книги Кол- борна, Думаноскі та Майєра «Наше вкрадене майбутнє...» [2]. Асоціація численних хвороб і патологічних станів із впливом ЕД визнана незаперечним фактом. Експозиція вагітних до ЕД може бути причиною розладів репродуктивного здоров'я потомства [3]. Особливістю патогенного впливу багатьох ЕД є відсутність прямої залежності «доза-ефект», що ускладнює встановлення порогових токсичних доз і передбачуваність реакції організму [4, 5].

Нейроендокринна система репродукції особливо уразлива до пренатальної дії ЕД. Статева приналежність особини має суттєве значення у характері патологічних наслідків раннього впливу ЕД, зокрема, як причини розладів центральної нервової системи [6].

ЕД реалізують свою шкідливу дію різними шляхами, причетними до гормональної регуляції [3, 7]. Важливу патогенетичну роль відіграють модифікація генів і порушення фундаментальних біохімічних процесів, які забезпечують базові функції клітини-мішені.

Найчастіше геномні та негеномні ефекти ЕД здійснюються через рецептори естрогенів і андрогенів, до яких чимало з ЕД мають певну спорідненість [8]. Зокрема, БФА є прямим агоністом рецепторів естрогенів. Не- геномні ефекти реалізуються через мембранні рецептори гормонів: ЕД інтерферують з кіназними сигнальними каскадами клітини. Геномні ефекти зумовлені зв'язуванням ЕД з гормон-реагуючими елементами ядерної ДНК або епігенетичною модифікацією будови генів.

Одним із найбільш універсальних шляхів шкідливої дії ЕД є оксидативний стрес. Він характеризується надмірним утворенням вільних радикалів, активних форм кисню, що призводить до ушкодження функції та структури клітинних мембран і органел [9]. Зокрема, такі екологічні чинники порушують кількісний і якісний склад сперми завдяки розладам метаболізму в тканинах сім'яників [10]. Оксида- тивний стрес є важливим елементом патогенезу розладів гаметогенезу і безпліддя [11].

Особливу увагу привертають ЕД як потенційні патогенні чинники, які за умови контакту з ними вагітної жінки можуть долати плацентарний бар'єр і негативно впливати на формування нервової та ендокринної систем плоду. Незрілі системи детоксикації плода не здатні метаболізувати ЕД і тому не захищають його від негативного впливу. Тестикулярний проте- ом є однією з головних мішеней ЕД, порушення якого призводить до тяжких репродуктивних наслідків -- недостатньої продукції тестостерону, дезорганізації сперматогенезу, неплідності тощо [12]. Доведено асоціацію підвищеної частоти народження хлопчиків із мікропенісом, гіпоспадією, крипторхізмом із присутністю в організмі вагітної жінки та плоду пестицидів на Північному Сході Бразилії, де їх використовують дуже інтенсивно [13]. Схожі дані стосовно впливу ЕД на розвиток репродуктивної системи отримали в Єгипті [14].

ЕД здатні порушувати залежне від гормонів програмування нейроендокринної системи репродукції внутрішньоутробного плоду. Попри відсутність у багатьох випадках тератогенних ефектів, тобто анатомічних вад розвитку, віддаленими наслідками пренатального впливу ЕД можуть бути розлади гормонального балансу і статевої поведінки. Останнє зумовлено порушеннями СДМ, яка відбувається в людини в другому триместрі вагітності, а в гризунів наприкінці вагітності та протягом короткого періоду життя після народження [15, 16]. Сучасна наука розглядає подібні форми патології як епігенетичні модифікації програми індивідуального розвитку через механізми зміненої транскрипції завдяки метилуванню цитозин- гуанінових послідовностей у молекулах ДНК та таких посттрансляційних модифікацій гіс- тонів як метилування, фосфорилювання, аце- тилювання та убіквитинування [17-19].

Методичні аспекти дослідження пренатальних ефектів ЕД

Дослідження потенційної небезпеки ЕД для ендокринної системи, як і до інших фізіологічних систем, стикається з певними методичними труднощами. Вони зумовлені, по-перше, тим, що в реальному житті організми вагітної та плоду можуть зазнавати впливу не одного, а суміші ЕД, як то пестициди, хімічні пластифікатори, важкі метали тощо. Друга складність полягає у вже згаданої відсутності залежності біологічних ефектів ЕД від дози, через що низькі дози експозиції можуть спричинити тяжчі наслідки, ніж великі. Тому для досліджень ЕД використовують різні експериментальні моделі [20]. Ще один важливий фактор у вивченні ЕД полягає в тому, що навіть за відсутності очевидних тератогенних ефектів у новонароджених наслідки пренатальної експозиції до ЕД можуть виявлятися у віддалені періоди життя у вигляді функціональних розладів. Дослідження цих аспектів дії будь-яких пренатальних патогенних агентів отримали назву «функціональна тератологія» [16, 21]. Концепція функціональної тератології лягла в основу наших багаторічних експериментальних досліджень.

Дослідження проводились за прийнятою в нашому відділі стандартною схемою, яка полягає у введенні в шлунок щурів Вістар гіпотетичного патогенного агента в останній тиждень вагітності, тобто з 15 по 21 день, що відповідає найбільш чутливому (критичному) періоду формування нейроендокринної регуляції репродукції гризунів, і подальшому вивченні в самців і самиць термінів статевого дозрівання і стану репродуктивної та ГГАС у дорослих тварин. У тварин вимірювали ано- генітальну відстань (АГВ), яка відображає баланс андрогенів та естрогенів під час внутріш- ньоутробного розвитку. Терміни статевого дозрівання визначали в самців за опущенням гонад у мошонку, у самиць -- за датою відкриття вагінального отвору. Ендокринний профіль оцінювали в статевозрілих щурів за рівнем статевих і адренокортикальних гормонів у плазмі крові. Реакцію ГГАС на стрес вивчали вимірюванням концентрації кортикостерону в плазмі крові після одногодинної іммобілізації щурів порівняно з базальним рівнем в інтактних тварин. Після знеживлення тварин проводили морфологічне дослідження органів репродуктивної системи, а в деяких випадках -- нейроендокринних структур гіпоталамуса. У вентральній простаті (ВП) і сім'яниках вимірювали кількість продуктів перекисного окислювання ліпідів, а в змивах епідидимісів -- концентрацію сперматозоїдів.

Показники статевої поведінки за чоловічим типом у самців і самиць реєстрували в присутності рецептивної самиці, в якої за тиждень до цього видаляли яєчники, а потім викликали еструс послідовним введенням естрадіолу діацетату і прогестерону [22, 23]. Тестування проводили двічі з тижневим інтервалом, зважаючи на набуття тваринами сексуального досвіду. Поведінку самців за жіночим типом досліджували в присутності сексуально досвідченого самця, причому в них заздалегідь видаляли сім'яники, а перед тестуванням послідовно вводили естрадіолу діацетат і прогестерон. Такий експериментальний підхід давав змогу відповісти на питання про те, чи здатна нейроендокринна система самця активуватись, як у нормальних самиць, під впливом жіночих статевих гормонів, що є характерним для фемінізації мозку.

Поведінку самиць за жіночим типом характеризували кількістю лордозних реакцій на присутність чи наближення нормального самця, причому в них викликали еструс введенням жіночих статевих гормонів після ова- ріоектомії [24]. Для оцінки можливої маскулінізації мозку самиць як наслідку порушення його СДМ вивчали поведінку в присутності рецептивної самиці.

ДБФ

Ефіри фталевої кислоти (відомі як «фта- лати») використовуються як пластифікатори та добавки для виробів з полівінілхлориду, нітроцелюлози та бетону і містяться в багатьох споживчих товарах. Усі складні ефіри _VERTE^.

ортофталевої кислоти, в яких аліфатичні бічні ланцюги мають довжину від трьох до восьми атомів вуглецю, або з циклічними бічними ланцюгами можуть знижувати рівень тестостерону і впливати на розвиток особини [25].

Основними фталатними забруднювачами навколишнього середовища є ді(2-етил- гексил)фталат і ДБФ [26, 27]. Як ЕД фталати здійснюють помітний антиандрогенний [28, 29] та слабкий естрогенний ефекти [30, 31]. Антиандрогенна дія фталатів реалізується шляхом втручання в метаболізм чоловічих статевих гормонів [25].

Беручи до уваги гіпотезу про програмування ризиків для здоров'я протягом розвитку, основи якої були закладені ще в 90-х роках дослідженнями Barker et al. [32], особливу увагу заслуговують перинатальні ефекти фталатів. Пренатальні ефекти фталатів щодо редукції синтезу тестостерону добре схарактеризовані в плодів щурів. Гестаційний вплив фталатів, описаний у щурів, може призвести до так званого фталатного синдрому, який характеризується вадами розвитку чоловічих репродуктивних органів (придатка яєчка, сім'явивідної протоки, сім'яних пухирців, передміхурової залози та зовнішніх статевих органів), гіпоспадією та крипторхізмом, а також впливами на розвиток, такими як «розсмоктування» сосків (nipple-retention), зменшення АГВ. Серйозні вади розвитку репродуктивного тракту нащадків чоловічої статі спостерігаються при експозиції матерів до високих доз фталатів (>500 мг/кг маси тіла для ДБФ), тоді як зміни АГВ та «розсмоктування» сосків також відмічені й при нижчих дозах [33, 34]. Механізми розвитку фталатного синдрому, що спостерігаються в щурів після гестаційного впливу фталату, зумовлені зниженням у плода продукції тестикулярних андрогенів, зниженням передачі сигналу білка INSL3, який виробляється клітинами Лейдіга і залучений до процесу опущення яєчок у мошонку, та впливом на розвиток зародкових клітин гермінативного епітелію [35]. Визначення критичних періодів експозиції для розвитку фталатного синдрому показало, що гестаційний період є найбільш чутливим, особливо під час так званого «вікна маскулінізації» [35, 36]. Гестаційна експозиція до нижчих доз фталатів (< 250 мг/кг маси тіла для ДБФ) зазвичай не спричиняє у нащадків анатомічних вад розвитку, однак викликає інтерес із точки зору функціональної тератології, адже деякі розлади репродуктивної системи й поведінки можуть проявитись лише після настання статевої зрілості. У літературі зустрічаються дані про порушення статевої поведінки в щурів, експонованих до фталатів протягом внутрішньоутробного розвитку та під час лактації, які не корелювали з морфологічними аномаліями; вони свідчать про порушення СДМ [37].

Пренатальні ефекти фталатів на розвиток репродуктивної системи нащадків жіночої статі досліджені значно менше. Ray B. et al. показали, що інтраперитоніальне введення діізобутилфталату на 10-й, 12-й та 14-й дні вагітності в дозах 375, 750 та 1250 мкг/кг порушує морфологію яєчників у дорослих нащадків [38]. Натомість в іншій роботі не виявлено впливу експозиції щурів до ДБФ у дозах 10, 100 або 600 мг/кг під час гестації та лактації на статевий розвиток, масу яєчників і матки та естральну циклічність, проте показано підвищення рівнів естрадіолу та прогестерону в нащадків, матері яких отримували ДБФ у найнижчій дозі, що може вплинути на фертильність щурів потомства першої генерації [39]. Hunter D. et al. показали, що в гіпоталамусах статевозрілого потомства жіночої статі самиць щурів, яким через день вводили ДБФ у дозі 500 мг/кг з 14-го дня гестації до 6 постнатального дня, на 24-й постнатальний день змінювалась експресія генів, пов'язаних зі статевою поведінкою та регуляцією осі гі- поталамус-гіпофіз-гонади [40]. Водночас автори не спостерігали змін статевої поведінки самиць та експресії, пов'язаних із нею генів Cyp19a1, Avp, Oxt, Esr2, що кодують аромата- зу, вазопресин, окситоцин і естрогенні рецептори в відповідно. З іншого боку, зміни експресії генів ГАМК-системи в секс-диморфних ділянках гіпоталамуса щурів внаслідок пери- натальної дії суміші дизрапторів, що містила ДБФ [41], дозволяє припустити порушення статевої поведінки в самиць.

У ссавців СДМ відбувається під контролем фетальних тестикулярних андрогенів. У щурів критичний період цього процесу відповідає останньому тижню вагітності (15-21-й день гестації) і триває до 5-го постнатального дня. Беручи до уваги антиандрогенну активність фталатів, один із ризиків може бути пов'язаний із відхиленнями в статевій поведінці нащадків, експонованих до фталатів у критичний період СДМ. Ми припустили, що такого роду поведінкові аномалії можуть виникнути навіть після впливу низької дози фталату, яка не викликає істотних уражень репродуктивного тракту.

Враховуючи результати експериментів на щурах, проведених Національною токсикологічною програмою США (no observed adverse effect level, NOAEL) доза для ДБФ при пероральному застосуванні протягом 12-20 днів вагітності становила 66 мг/кг/добу [42]. Щоб виявити віддалені функціональні зміни нейроендокринної системи в нащадків, за відсутності суттєвих тератогенних ефектів, ми обрали дозу ДБФ 100 мг/кг. Детально результати дослідження віддалених ефектів пренатального застосування ДБФ у самців покоління F1 викладено в наших публікаціях [43-47].

У нащадків чоловічої статі на 2-й постна- тальний день спостерігали вірогідне транзи- торне зменшення АГВ. Статеве дозрівання нащадків обох статей у дослідних групах прискорювалось у середньому на 5,2 дня.

Дослідження віддалених ефектів ДБФ на самцях-нащадках показало, що в 6-місячно- му віці маса органів статевої системи та морфологічна будова ВП і сперматогенного шару сім'яників не відрізнялись від таких у контрольних тварин. Натомість морфологічні ознаки клітин Лейдіга в сім'яниках цих тварин свідчили про їх функціональне напруження. Такі морфологічні відмінності корелювали з концентрацією тестостерону в плазмі крові, яка удвічі перевищувала показник контролю. Відсутність кореляції між масою додаткових статевих залоз та рівнем тестостерону в плазмі крові пояснюється тим, що, на відміну від препубертатного віку, після набуття статевої зрілості андрогени залишаються необхідними для підтримання їх структури та секреторної функції, але не посилюють проліферацію клітин в органах. З високим рівнем тестостерону в 6-місячних тварин у нашому дослідженні корелював підвищений на 20% вміст сперматозоїдів в епіди- димісах. Виявлено посилення оксидативного стресу в сім'яниках піддослідних тварин, про що свідчило значне підвищення концентрації продуктів перекисного окислювання ліпідів -- малонового діальдегіду у 2,2 раза та дієнових кон'югатів в 1,4 раза.

У пренатально експонованих до ДБФ самців спостерігали гіперактивну чоловічу статеву поведінку в присутності сприйнятливої самки -- скорочувалась тривалість латентних періодів першої садки та інтромісії, а також постеякуляційного рефрактерного періоду; збільшувалась кількість садок з інтромісією та еякуляцій. Таким чином, відкрито феномен гі- перандрогенізму та гіперсексуальності в самців як результат пренатального впливу низьких доз ДБФ у критичний період СДМ.

Натомість у 18-місячних нащадків дослідної групи порівняно з контролем відповідного віку спостерігали значне погіршення показників стану репродуктивної системи -- вірогідно зменшувалась маса додаткових статевих залоз в 1,7-2,0 рази, епідидимісів -- на 20%; кількість сперматозоїдів знижувалась на 40%. У ВП цих тварин збільшувалась кількість де- сквамованих та апоптотичних епітеліальних клітин, тканинних базофілів та лейкоцитів; у сім'яниках кількість мікролейдігом в інтер- стиціальному просторі зростала в середньому до 4-7 в органі проти 1-4 у контрольних тварин. На противагу молодим, у постарілих дослідних самців вміст тестостерону в плазмі крові знижувався більш ніж удвічі порівняно з контролем свого віку. Концентрація малонового діальдегіду та дієнових кон'югатів зростала не лише в сім'яниках, а й у ВП. У цій групі тварин значно послаблювались мотиваційний і копулятивний та був відсутній еякуляційний компоненти чоловічої статевої поведінки.

Виявлена в нашій роботі гіперактивна сексуальна поведінка молодих самців-нащад- ків, які пренатально піддавалися низькій дозі ДБФ, була несподіваною, враховуючи протилежні результати інших авторів, які використовували вищі дози фталатів [48, 49]. Логічно пов'язувати ці зміни з підвищеним рівнем тестостерону в плазмі крові. Що стосується даних літератури з цього питання, то вони досить суперечливі. Результати вимірювання рівня тестостерону у дорослих самців, матерям яких вводили ДБФ у дозі 100 мг/кг маси тіла протягом останнього тижня вагітності та на початку післяпологового періоду, вказували як на відсутність змін [49], так і на зниження або навіть підвищення рівня тестостерону [50, 51]. Дворазове підвищення рівня тестостерону в плазмі в нашому дослідженні узгоджується з аналогічними спостереженнями останнього автора та вказує на значну гіперандрогенізацію тварин. Імовірно, це є рушійною силою індукованої ДБФ гіперсексуальності та, можливо, передчасного статевого дозрівання, оскільки тестостерон є гормональним активатором гі- поталамічних нейроендокринних центрів. У результаті відбувається стимуляція статевого потягу до самки, що виявлено в молодих піддослідних самців. Загалом, дані про поведінку та андрогенний статус молодих тварин вказують на надмірну маскулінізацію нейроендокринної системи, яка гіпотетично може бути пов'язана з індукованою ДБФ гіперсекрецією тестостерону яєчками внутрішньоутробно- го плода протягом критичного періоду СДМ. Аргументом на користь цього припущення є інформація про пряму стимулюючу дію низьких концентрацій ДБФ та його метаболіту монобутилфталату на синтез тестостерону в культурі клітин Лейдіга MLTC-1 мишей [52, 53]. Проте у високих концентраціях обидві сполуки інгібували стероїдогенез. Натомість у роботі Clewell RA et al. [54] є підтвердження припущення про транзиторну гіперсекре- цію тестостерону яєчками плода щура за умов застосування ДБФ. Введення ДБФ самицям щурів у дозі 100 мг/кг маси тіла з 12 по 19 добу вагітності спричиняло пригнічення секреції тестостерону яєчками плода з подальшим швидким (протягом 24 год) відновленням рівня гормону в плазмі крові, а надалі -- його зростанням вище вихідного рівня внаслідок ефекту відскоку. Ймовірно, що такий сплеск тестостерону в критичний СДМ чоловічого мозку може бути причиною його гіпермаску- лінізації.

Аналогічні нашим дані про прискорене репродуктивне старіння самців, пренатально експонованих до ДБФ отримані при застосуванні діетилгексилфталату [55]. За даними літератури, і експозиція до фталатів, і старіння посилюють у клітинах Лейдіга оксидативний стрес, що може негативно вплинути на стероїдогенез [7, 56, 57]. Ймовірно, у постарілих тварин групи ДБФ існує адитивний ефект, викликаний ДБФ та віковим посиленням окисного стресу, що проявляється в прискореному старінні репродуктивної системи. Певним доказом на підтримку цієї гіпотези може бути робота, в якій продемонстровано захисні ефекти вітаміну Е, відомого своїми антиоксидантними властивостями, щодо ушкоджень репродуктивної системи самців, пренатально експонованих до різних доз ДБФ [58].

Згідно з результатами наших досліджень, не виявлено зміни маси органів репродуктивної системи, гістологічної будови яєчників, тривалості та регулярності естральних циклів у дорослих самиць, пренатально експонованих до ДБФ. Однак у яєчниках цих тварин спостерігали тенденцію до зменшення в півтора раза загальної кількості фолікулів. Також у дорослих самиць групи ДБФ концентрація естрадіолу виявилась вірогідно вищою (0,10±0,01 нмоль/л) порівняно з контрольними тваринами (0,07±0,0 нмоль/л). Таке збільшення вмісту естрадіолу в плазмі крові тварин дослідної групи при наявній тенденції до зменшення кількості антральних фолікулів, ймовірно, пояснюється екстраоваріальною конверсією андрогенів в естрогени. Це певною мірою узгоджується з вірогідно більшою масою тіла цих тварин, порівняно з контролем, а жирова тканина, як відомо, містить аромата- зу -- фермент, що здійснює перетворення тестостерону на естрадіол.

Аналогічні зміни вмісту статевих гормонів спостерігали Li X et al [59]. Натомість інші дослідники не виявили змін вмісту статевих гормонів у дорослих самиць, що зазнали пренатального впливу ДБФ [60, 61]. Можливо, такі розбіжності пов'язані з тим, що проби для аналізу брались під час різних стадій естраль- ного циклу. Дослідження статевої поведінки самиць показало, що введення ДБФ щурам протягом останнього тижня вагітності в нащадків жіночої статі призводить до маскулінізації статевої поведінки, проте не супроводжується її дефемінізацією. Наскільки нам відомо, лише в трьох дослідженнях вивчалась статева поведінка самиць, перинатально експонованих до ДБФ. У двох із них лордозний коефіцієнт дослідних самиць, які перебували в стадії еструсу, не відрізнявся від контрольної групи [40, 62]. Враховуючи велику варіабельність рівнів естрадіолу протягом естральних циклів, що може викликати різницю в рівнях рецеп- тивності між самицями, ми досліджували

статеву поведінку за нормалізованих гормональних рівнів шляхом оваріоектомії та наступного введення естрадіолу і прогестерону і теж не виявили різниці кількості лордозів тварин контрольної та дослідної груп. Натомість Lee et al., які проводили спостереження у тварин у стадії проеструсу, повідомили про нижчий коефіцієнт лордозу в дослідних самиць [60].

Маскулінізація статевої поведінки самиць дослідної групи проявлялась у появі садок на рецептивну самицю. У жодної самиці контрольної групи такої поведінки не спостерігали.

Таким чином, пренатальна експозиція щурів до ДБФ протягом критичного періоду СДМ у дозі, яка не призводить до анатомічних вад розвитку, спричиняє негативний вплив на пренатальне програмування нейроендокринної системи репродукції у тварин обох статей. Проте в самців такі зміни більш виражені.

Ібупрофен

Завдяки протизапальним і аналгетичним властивостям ібупрофен є одним із найбільш уживаних безрецептурних нестероїдних протизапальних засобів. Механізм його дїї полягає в неселективному інгібуванні циклооксигена- зи, ключового ензиму в синтезі простагландинів, які є медіаторами запалення, болю, температурних реакцій. За чинною інструкцією з медичного застосування, у перші два триместри вагітності слід утримуватись від приймання ібупрофену, за винятком крайньої необхідності. Але за наявності головного болю, запалення суглобів або гарячки вагітні жінки приймають ібупрофен, навіть попри термін вагітності. У США ібупрофен приймає майже кожна п'ята вагітна жінка, що відбивається на розвитку і поведінці дитини. У норвезькій популяції його вживають 5,9% вагітних [63], а у Великій Британії цей відсоток сягає 28% [64].

У плодів людини ібупрофен може викликати серцеві, судинні та діафрагмальні дефекти тощо [65, 66]. Майже всі дослідники погоджуються, що приймання ібупрофену не створює великого ризику розвитку крипторхізму [67, 68], хоча в дослідженнях in vitro на клітинних культурах і на ксенографтах ібупрофен гальмував стероїдогенез у тестикулах і порушував сперматогенез [64]. Повідомлялось про зменшення секреції тестостерону та якісних і кількісних параметрів сім'яної рідини в дорослих мишей, народжених від матерів, що отримували ібупрофен під час вагітності [69]. Що стосується віддалених репродуктивних, ендокринних і поведінкових ефектів пренатального впливу ібупрофену, то вони досліджені вкрай недостатньо.

Досі відома лише одна, крім нашої, дослідницька робота стосовно перинатальних ефектів ібупрофену [70]. Введення ібупрофену матерям щурів-самців протягом останнього тижня вагітності не впливало на чоловічу статеву поведінку, натомість самці демонстрували ознаки жіночої поведінки в присутності нормального самця, що може вказувати на порушення СДМ. У тварин зменшувались рівень тестостерону в крові, розміри ядер клітин Лейдіга, відсоток сперматозоїдів із нормальною морфологією.

Вихідною гіпотезою наших досліджень стало припущення, що за певних умов інгібування синтезу простагландинів ібупрофеном у чоловічого потомства можуть виникати розлади чоловічої статевої поведінки. Це припущення базувалось на відомих фактах участі простагландинів в андрогензалежній СДМ у самців під час критичного періоду цього процесу [71,

72]. Натомість питання про потенційну небезпеку пренатального впливу інгібіторів цикло- оксигенази щодо андрогензалежної СДМ у самців залишається відкритим. Dean et al. [73] повідомили про відсутність змін рівня тестостерону й ознак крипторхізму в самців мишей, народжених матерями, які отримували ібу- профен протягом 15,5-18,5 діб вагітності, що відповідає критичному періоду СДМ, але вони не досліджували статеву поведінку. На додачу до стану репродуктивної системи, нами досліджувалась також функція ГГАС, тому що цей аспект пренатального впливу ібупрофену залишався невідомим.

Згідно з отриманими результатами, введення ібупрофену самицям щурів Вістар протягом останнього тижня гестації в дозі 30 мг/кг маси тіла двічі на день (враховуючи швидке виведення з організму) частково порушує нейроендокринне програмування чоловічої копулятивної поведінки в нащадків чоловічої статі без змін у статевій поведінці жіночого типу [74, 75]. Статеве дозрівання самців у дослідній групі наставало дещо раніше порівняно з контрольною групою. Пренатальна _VERTE^.

дія ібупрофену викликала неповну маскулінізацію копулятивної поведінки в дорослих нащадків. Про це свідчило різке зниження сексуальної мотивації та здатності самців спаровуватися з самками, що стосувалось усіх досліджуваних показників, які характеризують центральні та периферичні компоненти регуляції статевої поведінки. Тривалість латентних періодів першої садки та першої інтромі- сії в першій сесії тестування збільшувалася в 3-4 рази, у другій, тобто через тиждень, ці зміни були ще більш драматичними. У щурів не спостерігалося еякуляції, а кількість садок з інтромісією зменшувалася в 6,5 раза. Тривалість латентних періодів першої інтромісії збільшилася у 23 рази, латентний період першої інтромісії подовжився в 14 разів, кількість садок з інтромісією зменшилася. Усі ці зміни відбувалися на тлі нормальних базальних рівнів статевих стероїдів -- тестостерону й естра- діолу в плазмі крові. Ібупрофен не вплинув на концентрацію сперматозоїдів у змивах епіди- димісів, але збільшив концентрацію малонового діальдегіду в сім'яниках і ВП, що є ознаками порушення перекисного окислювання ліпідів. Базальні концентрації кортикостерону в плазмі крові статистично не відрізнялись у дослідній та контрольній групах, а реакція ГГАС на іммобілізаційний стрес також не змінювалась: рівень кортикостерону зростав у 3-6 разів.

Слід зауважити, що деякі дослідники спостерігали зменшення рівня тестостерону в дорослих тварин, пренатально експонованих до ібупрофену [69, 70]. Крім того, наші дані суперечать результатам дослідження Balin et al. [70], які повідомили про збереження чоловічої статевої поведінки та її фемінізацію в самців, що зазнали пренатального впливу ібу- профену в ті самі терміни внутрішньоутробно- го життя і в майже такій самій дозі (але раз на день), як і в наших експериментах. Натомість у нашому дослідженні піддослідні самці не демонстрували лордозні реакції в присутності нормального самця. Ймовірно, різні результати зумовлені різними схемами введення ібу- профену і різними добовими дозами.

Виявлена нами неповна маскулінізація статевої поведінки в умовах пренатального інгібування циклооксигенази ібупрофеном може бути пов'язана з гальмуванням синтезу простагландину Е₂, який є ймовірним медіатором у ланцюжку програмувального сигналу тестостерону в мозку плоду. Є підстави вважати, що маскулінізація мозку плодів самців щурів відбувається завдяки кооперативній дії естрадіолу, який утворюється з тестикулярного тестостерону, та простагландину Е₂, синтез якого стимулюється естрадіолом у мікроглії преоптичної області гіпоталамуса плоду. З'ясувалось, що одну з ключових ролей у ранній андрогензалежній маскулінізації мозку і поведінки відіграють тучні клітини: вони стимулюють синтез простагландину Е₂ в мікроглії, результатом чого є зміна нейро- анатомічної архітектоніки мозку самців щурів, зокрема, ріст дендритів [72, 76, 77].

Простагландини синтезуються в мембранах клітин з арахідонової кислоти за участю двох ферментів -- циклооксигеназ 1 і 2, а також специфічної термінальної синтази. Одним з аргументів їхньої участі в програмуванні мозку в напрямку маскулінізації є той факт, що рівень обох ферментів у преоптичній області мозку новонароджених самців щурів є вищим за такий у самиць [78]. Крім того, рівень проста- гландина Е₂ збільшується в сім разів під впливом перинатально застосованого естрадіолу завдяки індукції циклооксигеназ. Це призводить до дворазового збільшення щільності розподілу дендритів у преоптичній ділянці мозку самців щурів та рівня спінофіліну, специфічного білка дендритів [77]. Увагу дослідників привернули а-аміно-3-гідрокси-5-метил-4-ізо- ксазолпропіонова кислота та каїнат (агоністи глутаматних рецепторів каїнатного типу) як можливих посередників маскулінізуючої дії ЕР2 та ЕР4 в процесі СДМ. Вони взаємодіють із білками динамічних іонних каналів у нервовій системі та стимулюють індуковане простагландином Е₂ утворення дендритних паростків. Перинатальне застосування агоністів глюта- матних рецепторів у самиць щурів спричинило маскулінізацію мозку, що виявилось у появі чоловічої статевої поведінки. Отже, протеїнкіназа А є необхідною для стимуляції простагландином Е₂ утворення спінофіліну в преоптичній ділянці незрілого мозку, і, відповідно, програмування чоловічої статевої поведінки. Цей процес відбувається за участю а-аміно-3-гідрокси-5- метил-4-ізоксазолпропіонової кислоти/каїнату і метаботропних глутаматних рецепторів типів I і II [79].

Не менш імовірним поясненням патогенної дії пренатально застосованого ібупрофену є гальмівний вплив даного лікарського засобу на ферменти біосинтезу стероїдів CYP11A1, CYP17A1 і HSD17B3 в тестикулах внутріш- ньоутробного плоду, що було продемонстровано в експериментах із культивуванням і експлантами тестикул плодів людини, починаючи з восьмого тижня вагітності, коли залози починають утворювати тестостерон [64], а також в аналогічних експериментах ex vivo з тестикулами дорослих людей [80]. Також у цій роботі було показано, що за даними клінічних спостережень, ібупрофен може викликати в чоловіків стан компенсованого гіпогонадизму.

Наявність в організмі чоловічих плодів людини й тварин у критичному періоді СДМ тестостерону є імперативною умовою нормального перебігу цього процесу. Отже, «створений» ібупрофеном дефіцит тестостерону дійсно може бути важливим механізмом розладів програмування чоловічої статевої поведінки.

Існують дані про негативний пренатальний вплив ібупрофену на формування статевої поведінки й репродуктивний потенціал самиць щурів. Введення ібупрофену в дозах від 10 до 60 мг/кг маси тіла з 15 дня вагітності та протягом лактаційного періоду негативно вплинуло на плідність дорослого жіночого потомства і гальмувало лордозні реакції, тобто жіночу статеву поведінку [81].

Отримані нами результати вкупі з даними літератури відповідають загальній концепції функціональної тератології та налаштовують на більш обережне застосування ібупрофену в період вагітності, що має зменшити ризики репродуктивної, нейроендокринної й нейро- психологічної патології в потомства.

БФА

Значну увагу серед ЕД приділяють БФА. Крім помітної естрогенної активності, він виявляє певну спорідненість до рецепторів андрогенів, тиреоїдних гормонів, активатора пероксисом. За останні 20 років БФА став одним із найбільш досліджених ЕД, оскільки це одна з найпоширеніших хімічних речовин у світовому виробництві. БФА переважно використовується у виробництві пластмас і смол, які можна знайти в різноманітних споживчих і промислових товарах, таких як епоксидні смоли, полікарбонат, картон, стоматологічні матеріали та медичні пристрої, алюмінієві банки, термоси (внутрішнє покриття).

БФА виявляють у материнській крові, ам- ніотичній рідині та крові плода [82]. Підтверджено, що БФА може проникати через плаценту [83], а також його виявляють у молоці матері [84]. Повідомлялося, що БФА втручається в метаболізм і передачу сигналів ендогенних стероїдних гормонів, зокрема естрогенів, і численні дослідження на багатьох видах тварин показали, що БФА може порушувати СДМ і поведінку навіть у низьких дозах [6, 85-87].

Дослідження на тваринах свідчать про те, що перинатальне введення БФА самицям щурів знижує фертильність дорослих нащадків- самців покоління F1, зменшуючи кількість та рухливість сперматозоїдів, посилюючи апоптоз і пошкоджуючи ДНК гамет [88-89]. Продемонстровано зменшення АГВ у новонароджених самців та самиць щурів, які пренатально зазнали дії низьких доз БФА [90]. Ці дані відрізняються від результатів дослідження Ferguson SA et al. [91], у якому пренатальний вплив БФА у вищій дозі не призводив до змін АГВ, що вказує на вже згадувану вище відсутність залежності ефектів дизраптора від дози.

У дорослих мишей перинатальний вплив БФА зумовив зміни АГВ, затримку статевого розвитку, зниження концентрації сироваткового та внутрішньотестикулярного тестостерону, порушення розвитку яєчок і сперматогенезу, зміну біохімічних властивостей сперматозоїдів, зменшення їх кількості та рухливості [92-95]. Також є повідомлення про зв'язок між пренатальним впливом БФА та раннім настанням статевого дозрівання в нащадків жіночої статі [96].

Пренатальний вплив БФА знижував рівень тестостерону в самців мишей і підвищував рівень естрадіолу в самиць, а також спричинив пошкодження сім'яників та яєчників [97].

Безпосередній вплив БФА на розвиток фолікулярного апарату яєчників плода не викликає сумнівів, оскільки зафіксований у численних дослідженнях [89]. Показано, що введення БФА під час вагітності та лактації призводить до зменшення кількості примордіальних фолікулів в яєчниках нащадків і збільшення кількості жовтих тіл. Це супроводжувалось зростанням рівня прогестерону в плазмі крові та

активності 3р-гідроксистероїддегідрогенази в гонадах, дисбалансом рецепторів андрогенів між різними типами фолікулів і збільшенням кількості рецепторів фолікулостимулюючо- го гормону [98]. Також перинатальний вплив БФА зменшив кількість первинних, преан- тральних і загальної кількості фолікулів на 21-й постнатальний день [99]. У дослідженні, проведеному на мишах, пренатальна експозиція до БФА зменшувала кількість при- мордіальних фолікулів на 4-й постнатальний день [100]. Проте інше дослідження показало, що пренатальний вплив БФА збільшив загальну кількість фолікулів у самиць щурів [101]. Будь-які відмінності у впливі БФА на конкретні популяції фолікулів, ймовірно, пов'язані з різними дозами та часом впливу, які використовувалися в різних дослідженнях на гризунах.

Репродуктивна поведінка обох статей є досить чутливою до пренатального впливу БФА. Проявами сексуальної дисфункції в самців щурів після перинатальної дії БФА були пролонгація латентного періоду контакту з самкою, порушення копулятивної поведінки у вигляді зменшення кількості ін- тромісій та еякуляцій [102]. В іншій роботі повідомлялось про пригнічення статевої поведінки в самців щурів та відсутність змін статевої поведінки в жіночого потомства [103]. Деякі дослідження демонструють збільшення кількості лордозів і сексуальної мотивації та підвищення коефіцієнта лордозу в дорослих самиць, які зазнали пренатальної експозиції до БФА [102, 104].

Розлади статевої поведінки, при пренатальному впливі БФА можна розцінювати як порушення СДМ. Нейроендокринним центром СДМ є медіально-преоптичне ядро гіпоталамуса [16]. Як уже згадувалось, критичний період СДМ у гризунів охоплює пізню вагітність і кілька днів після пологів. Повідомлялося, що в самців щурів, матері яких отримували БФА, збільшився розмір статево-диморфних ядер преоптичної ділянки гіпоталамуса, що може свідчити про надмірну маскулінізацію мозку, що розвивається [105]. Навпаки, за іншими даними, перинатальне введення БФА призводило до помітного зменшення розмірів цих ядер у самців [106], що може свідчити про порушення СДМ. В інших дослідженнях не було виявлено жодних змін у розмірах цієї гіпоталамічної структури [107, 108].

Результати наших досліджень показують, що введення БФА самицям щурів Вістар у щоденній дозі 25 мкг/кг, яка у 200 разів менша за NOAEL, протягом 15-21 днів вагітності не спричиняє суттєвих анатомічних (тератоген- них) ефектів розвитку, за винятком збільшення АГВ у самців та самиць нащадків F1 на 10-й постнатальний день порівняно з контролем. Пренатально застосований БФА не впливав на терміни статевого дозрівання в нащадків обох статей.

Дослідження рівня стероїдних гормонів плазми крові самців та самиць у віці 6 місяців не виявило порушень гормонального гомеостазису, за винятком концентрації естрадіолу в самиць, яка була вірогідно нижчою у тварин, що зазнали пренатальної дії БФА. Отримані нами результати відрізняються від даних Moustafa та Ahmed, які спостерігали підвищення вмісту естрадіолу, спричинене пренатальною дією БФА в щурів [109]. Водночас Mahalingam та ін. спостерігали аналогічні нашим зміни рівня статевих гормонів [110]. Дослідження, проведене в рамках Консорціума, що поєднує академічні та нормативні відомості про токсичність BPA (Consortium Linking Academic and Regulatory Insights on BPA Toxicity, CLARITY-BPA), не виявило впливу перинатального введення БФА на рівень естрадіолу в самиць щурів різного віку [99].

У наших дослідженнях пренатальне застосування БФА не впливало на будову спер- матогенного шару порівняно з контрольною групою тварин. Проте в дослідженні інших авторів, проведеному на лінії щурів Long-Evans, пренатальне застосування БФА спричиняло в 35-денних самців руйнування сперматогенного епітелію, що проявлялося дезорганізацією та атрофією статевих клітин у сім'яних каналь- цях [111]. Hass та ін. [112] у своїй роботі показали, що в самців віком 3 міс. значно зменшувалась кількість сперматозоїдів при найнижчій протестованій ними дозі. У цілому їх гістологічне дослідження сім'яників та ВП не виявило суттєвих відмінностей між контрольною та дослідними групами, що збігається з нашими даними. В яєчниках тварин, що зазнали експозиції до БФА, спостерігали дегенерацію фолікулярного епітелію у вторинних фолікулах.

Деякі автори також відзначають дегенеративні зміни фолікулярного епітелію, але внаслідок тривалішої дії та вищих доз БФА, коли порушення були більш виражені [109].

За нашими даними, у сім'яниках самців щурів, які зазнали пренатальної дії БФА, вміст продуктів перекисного окиснення ліпідів -- малонового діальдегіду та дієнових кон'югатів -- вірогідно збільшувався порівняно з контрольною групою. У ВП вміст малонового діальдегіда був вірогідно вищим порівняно з контролем.

Введення БФА самкам щурів протягом останнього тижня вагітності майже повністю гальмує прояви копулятивних компонентів чоловічої статевої поведінки в дорослого чоловічого потомства. Важливо підкреслити, що пренатально застосований БФА зумовлює аномалії статевої поведінки в дорослих тварин на тлі нормального рівня тестостерону в плазмі крові [113]. Результати морфологічного та каріометричного досліджень демонструють зменшення функціональної активності нейро- цитів медіально-преоптичного ядра гіпоталамуса в самців. Ці зміни корелюють із гальмуванням чоловічої статевої поведінки, тому що нейроендокринний центр її регуляції розташований саме в преоптичній ділянці гіпоталамуса гризунів.

На тлі відсутності змін жіночої статевої поведінки в дорослих самок нащадків, що зазнали пренатального впливу БФА, спостерігали прояви чоловічої статевої поведінки у вигляді садок і псевдокопулятивних рухів. Результати морфологічного дослідження медіально-пре- оптичного ядра збігаються з отриманими даними щодо маскулінізації статевої поведінки самиць внаслідок пренатального впливу БФА, з одночасним збереженням типової поведінки за жіночим типом. Оскільки маскулінізація мозку відбувається за безпосередньої участі естрогенних посередників [15], отримані результати стосовно зменшення функціональної активності нейроцитів медіально-преоптич- ного ядра в самців та маскулінізації мозку самиць, які зазнали пренатальної експозиції БФА, можуть пояснюватись його естрогенною активністю. Таким чином, є підстави вважати, що наднизькі дози БФА небезпечні для репродуктивного здоров'я нащадків, які пренатально піддавалися дії цього ЕД.

Висновок

Дані літератури та результати власних досліджень свідчать про епігенетичні порушення програми СДМ унаслідок пренатального впливу ДБФ, ібупрофену, БФА та інших ЕД у дозах, що не викликають тератогенних ефектів і, отже, мають бути враховані при визначенні потенційної небезпеки ЕД для репродуктивного здоров'я.

Список використаної літератури

1. Reznikov AG. Reproductive targets of endocrine disruptors. Reprod Endocrinol. 2014;17:14-21. doi: 10.18370/2309-4117.2014.17.14-21. Russian.

2. Colborn T, Dumanoski D, Myers JP. Our stolen future: are we threatening our fertility, intelligence, and survival?-A scientific detective story. New York: EP Dutton, 1996. 306 p.

3. Marques-Pinto A, Carvalho D. Human infertility: are endocrine disruptors to blame? Endocr Connect. 2013 Sep 17;2(3):R15-29. doi: 10.1530/EC-13-0036.

4. Welshons WV, Nagel SC, Saal FS. Large effects from small exposures.

III. Endocrine mechanisms mediating effects of bisphenol A at levels of human exposure. Endocrinology. 2006 Jun;147(6 Suppl):S56-69. doi: 10.1210/en.2005-1159.

5. Prins GS, Patisaul HB, Belcher SM, Vandenberg LN CLARITY-BPA academic laboratory studies identify consistent low-dose Bisphenol A effects on multiple organ systems. Basic Clin Pharmacol Toxicol. 2019 Aug;125(Suppl 3):14-31. doi: 10.1111/bcpt.13125

6. Rebuli ME, Patisaul HB. Assessment of sex specific endocrine disrupting effects in the prenatal and pre-pubertal rodent brain. J Steroid Biochem Mol Biol. 2016 Jun;160:148-59. doi: 10.1016/j.jsbmb.2015.08.021.

7. Sidorkiewicz I, Zariba K, Wolczynski S, Czerniecki J. Endocrine-

disrupting chemicals-Mechanisms of action on male reproductive system. Toxicol Ind Health. 2017Jul;33(7):601-9. doi:

10.1177/0748233717695160.

8. Lee HR, Jeung EB, Cho MH, Kim TH, Leung PC, Choi KC. Molecular mechanism(s) of endocrine-disrupting chemicals and their potent oestrogenicity in diverse cells and tissues that express oestrogen receptors. J Cell Mol Med. 2013 Jan;17(1):1-11. doi: 10.1111/j.1582- 4934.2012.01649.x.

9. Барабой ВА, Резніков ОГ. Фізіологія, біохімія і психологія стресу.

К.: Інтерсервіс; 2013. 314 с. (Baraboy VA, Reznikov OG. Physiology, biochemistry and psychology of stress. K Interservice, 2013. 314 p. Ukrainian.)

10. Tsebrzhinsky OI, Pochernyaeva VF, Dmitrenko NA. Prooxidant- antioxidant system of testicles and sperm. Poltava, 2008. 101 p. Russian.

11. Aitken RJ, Bromfield EG, Gibb Z. Oxidative stress and reproductive function: The impact of oxidative stress on reproduction: a focus on gametogenesis and fertilization. Reproduction. 2022 Oct 26;164(6):F79-94. doi: 10.1530/REP-22-0126.

12. Wan Ht, Mruk DD, Wong CK, Cheng CY. Targeting testis-specific proteins to inhibit spermatogenesis: lesson from endocrine disrupting chemicals. Expert Opin Ther Targets. 2013 Jul;17(7):839-55. doi: 10.1517/14728222.2013.791679.

13. Gaspari L, Sampaio DR, Paris F, Audran F, Orsini M, Neto BJ, et al. High prevalence of micropenis in 2710 male newborns from an intensive-use pesticide area of Northeastern Brazil. Int J Androl. 2012 Jun;35(3):253-64. doi: 10.1111/j.1365-2605.2011.01241.x.

14. Kholy ME, Hamza RT, Saleh M, Elsedfy H. Penile length and genital anomalies in Egyptian male newborns: epidemiology and influence of endocrine disruptors. J Pediatr Endocrinol Metab. 2013;26(5-6):509- 13. doi: 10.1515/jpem-2012-0350.

15. Reznikov AG. Hormone-neurotransmitter imprinting in the neuroendocrine control of reproduction. New York: Harwood Academic Publishers; 1994. 90 р.

16. Резніков О.Г. Перинатальне програмування розладів ендокринних _VERTE

функцій і поведінки. К.: Наукова думка; 2019. 271 с. (Reznikov AG. Perinatal programming of disorders of endocrine functions and behavior. Kyiv: Naukova dumka, 2019. 271 p. Ukrainian).