Дослідження впливу вірусінактивуючих агентів на активність факторів згортання крові

Размещено на http://allbest.ru

ДУ "Інститут патології крові та трансфузійної медицини

НАМН України"

Дослідження впливу вірусінактивуючих агентів на активність факторів згортання крові

Н.О. Шурко, М.І. Вороник, Т.В. Данині,

Н.А. Дульцева, С.Є. Мадич

Львів

Резюме

Досліджували вплив сольвент-детергентних та тіоціанатних антивірусних агентів на активність факторів згортання крові. Ці сполуки суттєво знижували активність досліджуваних ферментів, але негативний ефект мав зворотній характер: після видалення вірусінактивуючих речовин з розчину методом діафільтрації активність всіх ферментів відновлювалася до початкового рівня.

Ключові слова: фактори згортання крові, три(н-бутил)фосфат, Тритон Х-100, Твін 80, тіоціанат амонію.

Резюме

Исследование влияния вирусинактивирующих агентов на активность факторов свертывания крови

Н.О. Шурко, М.І. Вороник, Т.В. Даниш,

Н.А. Дульцева, С.Є. Мадич

ДУ "Інститут патології крові та трансфузійної медицини НАМН України", Львов

Исследовали влияние сольвент-детергентных и тиоцианатных антивирусных агентов на активность факторов свертывания крови. Эти соединения существенно снижали активность исследуемых ферментов, однако негативний эффект имел обратимый характер: после удаления вирусин- активирующих веществ из раствора методом диафильтрации активность всех ферментов восстанавливалась к изначальному уровню.

Ключевые слова: факторы свертывания крови, три(н-бутил)фосфат, Тритон Х-100, Твин 80, тиоцианат аммония.

Resume

Research of virusinactivating agent quantitative content and activity factors coagulation

N.Shurko, М. Voronyak, Т. Danysh, N. Dultceva, S. Madych

SI «Institute of Blood Pathology and Transfusion Medicine,

NAMS of Ukraine», Lviv

Was investigated the effect of solvent-detergent and thiocyanate anti-viral agents on the activity of blood clotting factors. These compounds significantly reduced the activity of the investigated enzymes but the negative effect was reversible: after excision virusinaktyvating substances from solution by diafiltration method activity of all enzymes was recovered to the original level.

Key words: blood clotting factors, tri(n-butyl)phosphate, Triton X-100, Tween 80, ammonium thiocyanate.

Вступ

Дослідники, які працювали над виділенням та очищенням білків, прагнули розробити та вдосконалити методики для розділення та отримання препаратів із складних біологічних матеріалів, а саме з таких як плазма крові людини і тварин. Перші схеми розділення білків базувалися на використанні хімічних або фізичних засобів преципітації з використанням сульфату амонію, каприлової кислоти, етанолу, поліетиленгліколю, або варіації рН/температури. Наступним етапом була введена хроматографія як селективна і специфічна процедура фракціонування та очищення, спочатку, в основному, ґрунтуючись на використанні іонного обміну, гідрофобної взаємодії та гель-фільтрації [6].

На сьогоднішній день традиційні методи фракціонування плазми за Коном вдало поєднують з сучасними хроматографічними методами одержання білкових препаратів. Завдяки цьому в промислових масштабах одержують ряд достатньо очищених препаратів крові. Але якщо в минулому основна увага приділялась методам одержання та збереження активності препаратів крові, то останніми роками на перше місце вийшла проблема противірусної безпеки, оскільки спиртовий метод фракціонування за Коном практично не впливає на активність вірусів, особливо таких патогенних як віруси гепатитів, ВІЛ, герпесу, цитомегаловірусів, токсоплазмозу та інших [4]. За останні десятиліття були досягнуто значний прогрес щодо вірусної безпеки плазмових препаратів FVIII завдяки збільшенню чисельності методик для знешкодження інфекційних агентів. Вони включають:

* плазмове фракціонування, що забезпечило зниження концентрації вірусних контамінантів шляхом фізичного відокремлення та видалення вірусних частинок від бажаних білків;

• методи фільтрації сконцентрованих плазмових продуктів. Вони включають глибинну фільтрацію, діафільтрацію, ультрафільтрацію, нанофільтрацію;

• методи хроматографії для поділу молекул на основі відмінностей іонного заряду (іонний обмін), розміру (гель-фільтрація) або спорідненості до специфічних антитіл (імуноафінна);

• пастеризація чи теплова обробка, щоб знищити патогенні мікроорганізми;

• сольвент-детергентний метод проти оболонкових вірусів;

• хімічна обробка (висока концентрація солі, використання різних хімічних реагентів, наприклад солей тіоціанату).

Включення різних методів інактивації вірусів у поєднанні з ефективними хроматографічними етапами біоспецифічного виділення та очищення FVIII згортання крові та тромбіну дозволяє отримати препарати високого ступеня чистоти, безпечні у застосуванні стосовно можливої вірусної контамінації [3,5].

На сьогодні для вірусінактивації найбільш ефективно застосовується як сольвент три^-бутацїфосфат, який має найслабший білок-денатуруючий ефект, а як детергент - Тритон Х 100, Твін 80 та інші, в основному поліоксиетиленові нейонні детергенти. Інактивуюча можливість комбінації таких речовин значна, вона здійснюється швидко і незворотньо [3].

Тіоціанатний метод вірусної інактивації застосовує фармфірма Behringwerke при виділенні факторів згортання VIII та ІХ. Автори даної технології пропонують її застосування також і для санобробки хроматографічних сорбентів. Даний метод покладений в основу одержання препарату фактора ІХ (Mononine - запатентована торгова назва компанії Armour). За даними літератури цей метод є ефективним і по відношенню до безоболонкових вірусів [2].

Мета: дослідити вплив три(н-бутил)фосфату, Тритону Х-100, Твін 80 та NH4SCN на активність факторів згортання крові.

Матеріали і методи досліджень

Активність тромбіну визначали за стандартною процедурою згідно вимог Національного інституту здоров'я (National Institute of Health; NIH) по часу зсідання 1 мл 0,1%-ного розчину фібриногену в 0,15 М NaC1 з 0,01 М тріс-НС1 буфером, при рН 7,3 і додаванні 0,01-0,05 мл розчину тромбіну при температурі 37^оС. Визначення активності фактора VIII проводили уніфікованим одностадійним методом [1].

Результати та їх обговорення. Щоб дослідити вплив хімічних інактиваторів вірусів на активність факторів в досліджувану реакційну суміш додавали їх забуферені розчини різних концентрацій. Як контроль використали зразки без додавання хімічних реактивів.

При збільшенні в дослідженому розчині концентрації тритону Х- 100 в межах від 0,001 до 0,025 г/л спостерігалося помітне зростання активності тромбіну (з 1,1 до 1,7 од. NIH/мл), а далі ( при концентраціях тритону Х-100 від 0,025 до 0,04 г/л) - падіння активності. Зростання активності тромбіну в межах 1,4--1,7 од. NIH/мл прямо пропорційно залежало від збільшення концентрації Твін 80 (0,0016-0,04 г/л). Сольвент три(н-бутил)фосфат в межах концентрацій 0,0016-- 0,04 г/л несуттєво (близько 15%) зменшував активність тромбіну. біологічний плазма кров кон преципітація

Тіоціанат амонію (NH4SCN) при зміні концентрації в реакційній суміші з 0,0032 до 0,04 моль/л помітно знижував активність тромбіну (падіння становило до 80%). Всі досліджувані реактиви, в той же час, негативно впливали на активність фактора VIII. Для визначення зворотності чи незворотності інгібування активності досліджуваних ферментів проводили видалення хімічних реагентів з досліджуваних розчинів поетапно методом ультрадіафільтрації. Діафільт- рацію низькомолекулярних домішок здійснювали через фільтри Amicon Ultra-0,5 10кД фірми Milipore шляхом центрифугування на центрифузі Eppendorf 5702R при 4 тис. об./хв. протягом 20 хв та температурі + 4^оС (Табл. 1 та 2). Одержані результати свідчать про те, що застосування NH₄SCN при виготовленні препарату фактора VIIII та тромбіну з метою антивірусної обробки не може мати негативного впливу на його кінцеву активність.

Таблиця 1

Порівняльна характеристика активності фактора VIII у препараті Immunate на різних етапах ультрацентрифугування

Таблиця 2

Порівняльна характеристика активності тромбіну на різних етапах ультрацентрифугування

Аналогічний (інгібуючий, зворотній) ефект сольвент-детергенту та тіоціанату ми спостерігали і для факторів згортання VII, IX, X та плазміногену. Таким чином, в результаті проведених досліджень показано, що високі концентрації інактиваторів знижували активності тромбіну та фактора VIII зворотньо.

При вилученні їх з реакційної суміші активність факторів відновлювалася. Для прикладу, видалення NH4SCN з розчину фактора VIII приводить до повного відновлення його активності. Ці властивості дозволяють ефективно застосовувати дані вірус-інактивуючі реагенти одночасно в одній технологічній схемі виділення та очищення білків плазми з використанням попереднього фракціонування та біоспецифічної хроматографії на кремнеземних макропористих сорбентах , що дозволить суттєво покращити безпеку препаратів.

Література

1. Козлов А.А. Метод определения активности фактора VIII в плазме крови человека и в антигемофильных препаратах / А.А. Козлов // Весник службы крови. - 2006. - № 3. - С. 35-40.

2. Almeida J.D. The effect of sodium thiocyanate on virus structure [Text] / J.D. Almeida, A.F. Bradburne, T.G. Wreghitt // Journal of Medical Virology. - 1979. - Vol. 4 (4).- P. 269-277.

3. A solvent/detergent-treated and 15-nm filtered factor VIII: a new safety standard for plasma-derived coagulation factor concentrates [Text] / A. Related, S. Links, P. Porte, M. Nogre [et al] // C.J.Vox Sang. - 2007. - Vol. 92(4). - P. 327-337.

4. Clinical use of factor VIII and factor IX concentrates [Text] / M. Morfini, A. Coppola, M. Franchini, G. Di Minno // Blood Transfus. - 2013. - Vol. 11, Suppl. 4 - P. 55-63.

5. Dry-heat treatment process for enhancing viral safety of an antihemophilic factor VIII concentrate prepared from human plasma [Text] / In Seop K., Choi Y. W., Kang Y. [et al.] // J. Microbiol. Biotechnol. - 2008. - Vol. 18 (5). - P. 997-1003.

6. Radosevich, M. Affinity chromatography - fractionated and DNA-engineered plasma proteins [Text] / M. Radosevich, T. Burnouf // Encyclopedia of Industrial Biotechnology: Bioprocess, Bioseparation, and Cell Technology. - 2009. - P. 1-12.

Размещено на Allbest.ru