Хромосомні аномалії в клітинах кісткового мозку при хронічній лімфоцитарній лейкемії

Размещено на http://www.allbest.ru/

ДУ «Інститут гематології та трансфузіології НАМН України», Київ

ДУ «НПМЦ дитячої кардіології та кардіохірургії МОЗ України», Київ

Хромосомні аномалії в клітинах кісткового мозку при хронічній лімфоцитарній лейкемії

С.В. Андреева

К.В. Корець

І.М. Скороход

О.Е. Ружинська

Резюме

клональний аномалія хромосома клітина

Представлені результати цитогенетичного та FISH досліджень клітин кісткового мозку 87 пацієнтів на час встановлення діагнозу хронічної лімфоцитарної лейкемії. Препарати метафазних хромосом готували за загальновизнаною методикою після 24 або 72 год. культивування у поживному середовищі без стимуляції. Показано, що клональні аномалії хромосом формують складну картину каріотипів за структурою клонів, плоїдності. Серед структурних перебудов домінували делеції: при цитогенетичних дослідженнях - 54,2%, методом FISH - 87,8%. До структурних перебудов частіше залучалися хромосоми 11 та 17. Не виявлено зв'язку між цитогенетичними групами прогнозу і клінічними стадіями захворювання. При еволюції аномалій хромосом (FISH метод) у 34,5% випадків реєстрували втрату гена АТМ. Наявність одночасно кількісних та структурних аномалій хромосом може свідчити про багаторівневий механізм формування аномального каріотипу.

Ключові слова: хронічна лімфоцитарна лейкемія, клітини кісткового мозку, гетерогенність аномалій хромосом.

Хромосомные аномалии в клетках костного мозга при хроническом лимфоцитарном лейкозе

С.В. Андреева, Е.В. Корец, И.Н. Скороход, Е.Э. Ружинская

ГУ «Институт гематологи и трансфузиологии НАМН Украины», Киев

ГУ «НПМЦ детской кардиологии и кардиохирургии МЗ Украины», Киев

Резюме

Представлены результаты цитогенетического и FISH исследований клеток костного мозга 87 пациентов на момент постановки диагноза хронического лимфоцитарного лейкоза. Препараты метафазных хромосом готовили согласно общепринятой методики после 24 или 72 ч культивирования в питательной среде без стимуляции. Показано, что клональные аномалии хромосом формируют сложную картину кариотипов по структуре клонов, плоидности. Среди структурных перестроек преобладали делеции: при цитогенетических исследованиях - 54,2%, методом FISH - 87,8%. В структурные перестройки чаще вовлекались хромосомы 11 и 17. Не было выявлено связи между группами прогноза и стадиями заболевания. При эволюции аномалий хромосом (FISHметод) в 34,5% случаев регистрировали потерю гена АТМ. Наличие одновременно количественных и структурных аномалий хромосом может свидетельствовать о многоуровневом механизме формирования аномального кариотипа.

Ключевые слова: хронический лимфоцитарный лейкоз, клетки костного мозга, гетерогенность аномалий хромосом.

Chromosomal abnormalities in bone marrow cells in chronic lymphocytic leukemia

S.V. Andreieva, K.V. Korets, LM Skorokhod, O.E. Ruzhinska

SI «Institute of Haematology and Transfusiology of NAMS of Ukraine», Kyiv

UCCCMofH of Ukraine, Kyiv

Summary

Results of cytogenetic and FISH investigations in bone marrow cells of 87 patients at diagnosis were presented. Slides of metaphase chromosomes were prepared according standard procedure after cultivating during 24 or 72 h in the medium without stimulation. Clonal chromosomal abnormalities were formed, complexity structure of karyotypes with clone structures, ploidies were shown. In structural rearrangements deletions were dominated: at cytogenetic procedure - 54,2%, by FISH - 87,8%. Chromosomes 11 and 17 were often involved in structural rearrangements. Connection between prognosis groups and stage of disease is absent. In cases of evolution loss of ATM gene was registered in 34,5% cases with FISH method. Simultaneously presence of quantitative and qualitative abnormalities can be evidence of multilevel mechanism of abnormal karyotype formations.

Keywords: chronic lymphocytic leukemia, bone marrow cells, chromosomal abnormality heterogenity.

Вступ

Хронічна лімфоцитарна лейкемія (ХЛЛ) - найбільш розповсюджена і вивчена форма лейкемії, яка складає приблизно 30,0% від усіх лейкемій дорослих. Згідно із сучасною класифікацією Всесвітньої організації охорони здоров'я (ВООЗ), ХЛЛ об'єднана з лімфомою з малих лімфоцитів (ЛМЛ) в одну нозологічну групу. Діагноз ХЛЛ встановлюють за інфільтрацією кісткового мозку (КМ), периферійної крові (ПК), лімфатичних вузлів та селезінки клональною популяцією В-клітин (CD5+,CD10-, CD19+, CD20+ та CD23+) і лімфоцитозом з абсолютною кількістю лімфоцитів у ПК більше (5,0-10,0)х109/л [12]. Окрім стандартних критеріїв діагностики пропонуються додаткові, які можуть вказувати на прогресію або «тліючий» перебіг захворювання [6].

На сьогодні розглядають дві класифікації стадій В-ХЛЛ - Бінет [2] та Рей [4], які дозволяють прогнозувати перебіг захворювання. Стадії' ХЛЛ - проста клінічна система, яка дозволяє згрупувати клінічні дані за певними показниками, однак, на час встановлення діагнозу вони не відображають у повній мірі прогноз перебігу захворювання, оскільки не базуються на біологічних особливостях і неадекватно відображають масу пухлини. З іншого боку, деякі нові критерії, наприклад, мутаційний статус генів імуноглобулінів, втрачають своє прогностичне значення на Ш-TV стадіях захворювання [5].

Найважливішим фактором прогнозу перебігу В-ХЛЛ є генетичні аномалії, які виявляються за допомогою класичного цитогенетичного дослідження диференційно забарвлених на G-диски метафазних хромосом та інтерфазних ядер після флуоресцентної гібридизації на склі (і-FISH). Використання останнього методу обумовлено низьким відсотком клітин з хромосомними аномаліями, які можна виявити за допомогою класичного каріотипування [8]. При ХЛЛ нормальний каріотип реєструють лише у 18% випадків. За допомогою стандартного цитогенетичного дослідження делеції довгого плеча хромосоми 11 виявляються у 5,0-10,0%, довгого плеча хромосоми 13 - у 10,0-15,0%, короткого плеча хромосоми 17 - у 5,0%, а за допомогою FISH аналізу - у 20,0-25,5%, 70,0% та 7,0-20,0% відповідно [7].

До хромосомних аномалій, які несприятливо впливають на прогноз перебігу захворювання, відносяться наступні делеції: del(11q) із втратою гена АТМ та del(17р) із втратою гена супресора пухлин ТР53. Пухлинні клітини, що несуть ці аномалії, характеризуються резистентністю до основних цитостатичних препаратів - аналогів пуринів та алкілуючих препаратів. Окрім того, до цієї групи відносять del(6)(q21-23). Цитогенетично нормальний каріотип та del(13q) відносяться до групи сприятливого прогнозу, трисомія хромосоми 12, а також аномалії, які не відносяться до двох попередніх груп, складають групу проміжного прогнозу [9, 11]. У той же час недостатньо вивчені складні аномалії каріотипу та їх вплив на морфо-функціональні особливості злоякісних клітин.

Мета дослідження - вивчити особливості клональних аномалій хромосом у клітинах кісткового мозку при встановленні діагнозу В-ХЛЛ.

Матеріали і методи

До аналізу включено 87 пацієнтів на час встановлення діагнозу ХЛЛ, які зареєстровані впродовж 2011-2015 рр. Серед пацієнтів було 56 чоловіків та 31 жінка віком від 32 до 79 років (середній вік - 55,1 р.). Аналіз каріотипів на момент встановлення діагнозу проводили в клітинах кісткового мозку 52 пацієнтів, i-FISH аналіз - для 44 пацієнтів, з яких для 6 було виконано і цитогенетичне дослідження. У гематологічній характеристиці обстежених пацієнтів вміст лейкоцитів визначався у межах (від 1,8 до 224,3)х109/л, гемоглобіна - від 56 до 170 г/л, тромбоцитів - (від 21 до 295)х109/л, відсоток лімфоцитів в ПК коливався від 26 до 98%. Діагноз В-ХЛЛ підтвердили у відділі імуноцитохімії і онкогематології Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України та лабораторії імуноцитології та генетики пухлин крові ДУ «Інститут патології крові та трансфузійної медицини НАМИ України».

Для цитогенетичних досліджень препарати метафазних хромосом готували згідно із загальноприйнятою методикою [10] після 24-годинного культивування у поживному середовищі RPMI 1640 з 20,0% вмістом ембріональної телячої сироватки та гентаміцином і забарвлювали GTG-методом. Виявлені хромосомні аномалії описували згідно з міжнародною номенклатурою хромосом людини ISCN 2013 [3]. У дослідженні враховували тільки клональні аномалії хромосом. Нормальним вважали каріотип, коли не менше ніж у 20 проаналізованих і 10 каріотипованих метафазних пластинках не було виявлено хромосомних аномалій.

Каріотипи клітин КМ за структурою клонів були згруповані наступним чином: нормальний (Н), нормальний та білятераплооїдний (Н/4п), аномальний (А), аномальний та нормальний (А/Н), аномальний, білятетраплоїдний та нормальний (А/4п/Н), еволюція клональних аномалій (Е).

Дослідження методом i-FISH проводили на ядрах інтерфазних клітин після короткотривалого (24- або 72-годинного) культивування. Для цього використовували два набори: 1 - Vysis LSI p53 (ген ТР53, який локалізований у диску17р13); LSI ATM, диск 11q22.3; 2 - LSI D13S319, диск 13q14; LSI 13q34; CEP12, прицентромерна ділянка хромосоми 12 (Abbott, США).

Аналіз результатів дослідження проводили за допомогою програми Lucia та «Excel».

Результати та обговорення

Цитогенетичний аналіз клітин КМ на час встановлення діагнозу проведено для 52 пацієнтів, у 6 зафіксована відсутність метафазних пластинок, тобто результативність дослідження склала 88,5%. Отримані результати були згруповані за структурою клонів. Відсотковий розподіл каріотипів представлено на рис. 1. За сукупними показниками каріотипи Н, Н/4п реєстрували майже у половині випадків (45,7%), що більш ніж у три рази перевищує літературні свідчення (18,0%) [7]. Серед каріотипів з аномальними клонами найчастіше виявляли складний каріотип, який складався з А/4п/Н - 23,9%. Еволюція клональних аномалій хромосом була представлена у 13,0% випадків, що свідчить про її невипадковість у нашій вибірці.

Аналіз кількісних та структурних аномалій хромосом, що привели до зміни плоїдності, представлено в табл. 1. Диплоїдний каріотип формувався із нормальних каріотипів та клонів із збалансованими структурними перебудовами у більш, ніж половині випадків (54,3%). Псевдодиплоїдні клони (28,3%) формувалися, в основному, внаслідок делецій. Гіподиплоїдні (45 і менше хромосом) та гіпердиплоїдні (47 і більше хромосом) клони утворилися за рахунок моносомій хромосом 5 (два випадки), 7, 13, 15, статевих хромосом Х і Y (по одному випадку) та трисомій хромосом 12 (три випадки), 8 (два випадки), 10, 11 та маркерних хромосом (по одному випадку). Додатковий білятетраплоїдний клон виявляли майже у половині каріотипів (47,8%). Цей показник при ХЛЛ подібний до такого ж при В- лінійній гострій лімфобластній лейкемії у дітей (26,2%) [1], що може свідчити про схожі механізми формування аномальних каріотипів.

Рис. 1. Відсотковий розподіл каріотипів за структурою клонів в клітинах кісткового мозку при встановленні діагнозу хронічної лімфоцитарної лейкемії

До структурних перебудов залучалися 16 хромосом, а найчастіше - хромосома 17 по дисках р12, р13, q10, q24 і хромосома 11 по дисках q14, q21, q23 (рис. 2).

Таблиця 1. Розподіл хромосомних аномалій відносно рівня плоїдності на час встановлення діагнозу хронічної лімфоцитарної лейкемії

Серед структурних перебудов зустрічалися транслокації, інсерції, перицентрична інверсія, додатковий матеріал невідомого походження, окрім того реєстрували похідні хромосом, які утворилися внаслідок невстановлених перебудов. Частіше серед структурних перебудов виявляли делеції хромосоми 13 по диску q14 (54,2% випадків). Тобто, дослідження показали гетерогенність структурних перебудов, а також спектра залучення хромосом до таких перебудов.

Рис. 2. Спектр тональних структурних перебудов хромосом на час встановлення діагнозу хронічної лімфоцитарної лейкемії

Еволюція клональних аномалій хромосом зустрічається рідко, тому кожна інформація стосовно таких змін може сприяти розумінню причин і механізмів їх формування. Нами було співставлено випадки еволюції клональних аномалій хромосом між собою і схематично їх узагальнено, приділяючи увагу механізмам формування аномального каріотипу (табл. 2).

Таблиця 2. Еволюція клональних аномалій хромосом на час встановлення діагнозу ХЛЛ

Наведені в табл. 2 дані свідчать, що частіше за все спостерігалася втрата генетичного матеріалу як у вигляді моносомій, так і делецій. Відомо, що всі кількісні і незбалансовані структурні аномалії відносяться за часом виникнення до вторинних перебудов і не впливають на фенотип пухлинних клітин. Однак, поява трисомії хромосоми 8 в клітинах КМ при новоутвореннях кровотворної та лімфоїдної тканин сприяє більш високій проліферативній активності таких клітин, а втрата цілих хромосом (моносомії) або їх частини (делеції) спричиняють втрату генів супресорів пухлин.

i-FISH дослідження виконано у 44 випадках, із них у 6 було проведено також класичне цитогенетичне дослідження. За результатами FISH-аналізу виявлені втрату (делецію) генів АТМ, ТР53, D13S319, 13q34,12 та потроєння сигналів, які маркують центромеру хромосоми 12 (СЕР12), було об'єднано в дві групи. До першої групи віднесли поодинокі делеції: D13S319 (13q14) (2 випадки); 13q34 (1); ATM (5); TP53 (9). До другої групи - присутність двох і більше аномалій - ATM, 13q14 (4); ATM, TP53 (5); ATMx3-4, TP53x3-4 (1); ATM, 13q14, 13q34,TP53 (5); TP53, CEP12 (1); 13q14,TP53 (1); 13q14, 13q34,TP53 (2). Умовно ці дані можна представити наступним чином: del(A),del(B); del(A),del(C);del(A)x3-4,del(C)x3-4; del(A),del(B),del(D),del(C); del(C),+E; del(B),del(C); del(A),del(D),del(C). Відсоток випадків з делеціями складав 87,8%, з еволюцією (три і більше) хромосомних аномалій - 21,9%. Такий чисельний розподіл може свідчити на користь припущення, що первинною подією у формуванні еволюції аномального клону на час встановлення діагнозу В-ХЛЛ була втрата генів супресорів пухлин. Причому у 48,8% випадків спостерігалася втрата гена АТМ у диску 11q22.3.

Отже, ускладнення аномалій було зареєстровано у 19 випадках (46,8%). У всіх цих випадках були присутні делеції, що відносяться до групи несприятливого прогнозу, а саме: АТМ, ТР53. Сумарний відсоток випадків з делеціями АТМ та ТР53 склав 67,3%.

Розподіл перебудов хромосом на групи цитогенетичного прогнозу перебігу ХЛЛ за результатами класичного цитогенетичного та молекулярно-цитогенетичного досліджень надано в табл. 3.

За даними каріотипування аномалії хромосом, що відносяться до групи несприятливого прогнозу, становили 11 випадків (23,9%). До групи несприятливого прогнозу за результатами каріотипування та i-FISH віднесено 39 випадків (46,5%). Як видно з отриманих даних, на всіх стадіях ХЛЛ реєструвалися аномалії хромосом, що відносяться до групи несприятливого прогнозу, причому найвищі показники відмічені на стадіях 1 та 4. Аномалії, що віднесені до групи сприятливого прогнозу, не виявлені на стадії 1, проміжного - стадії 3. Частіше за все аномалії хромосом, що відносяться до сприятливого прогнозу, реєстрували на стадіях 2 і 3, проміжного - 1. Тобто, нами не виявлено зв'язку між цитогенетичними групами прогнозу і клінічними стадіями ХЛЛ.

Таблиця 3. Розподіл пацієнтів за групами цитогенетичного прогнозу з урахуванням стадій захворювання на час встановлення діагнозу ХЛЛ

Примітки: * - за класифікацією Rai; N - кількість пацієнтів

Висновки

Поєднання класичного цитогенетичного та молекулярно-цитогенетичного методів дозволяє відстежити генетичні механізми формування аномального каріотипу при встановленні діагнозу ХЛЛ.

Каріотипи клітин КМ при встановленні діагнозу ХЛЛ представлені шістьма групами: нормальний (Н), нормальний/білятетраплоїдний (Н/4п), аномальний (А), аномальний/нормальний (А/Н), аномальний/білятетраплоїдний/нормальний (А/4п/Н), еволюція (Е).

Диплоїдні клони реєстрували у 54,3% випадків; псевдодиплоїдні (за рахунок делецій) - у 28,3%; гіпердиплоїдні (в основному, за рахунок трисомій хромосом 12 та 8) - у 13% випадків.

До структурних перебудов найчастіше залучалися хромосоми 17 та 11 (за результатами цитогенетичного дослідження) та 11 хромосома (за даними i-FISH аналізу). Серед структурних перебудов домінували делеції: при цитогенетичному дослідженні - 54,2%, i-FISH - 87,8%.

Делеції хромосом, які віднесені до несприятливої групи цитогенетичного прогнозу (17р-, 11q-, 6q-), зареєстровані у 46,5% випадків. Не виявлено зв'язку між групами прогнозу і стадіями захворювання.

Еволюція клональних аномалій хромосом виявлена у 13,0% (методом каріотипування) та 21,9% випадків (методом i-FISH). При аналізі методом i-FISH у 34,5% випадків реєстрували втрату гена АТМ у диску 11 q22.3.

Наявність одночасно кількісних та структурних аномалій хромосом може свідчити про багаторівневий механізм формування аномального каріотипу на час встановлення діагнозу ХЛЛ.

Література

1. Дроздова В.Д. Особливості хромосомних аномалій при В-лінійній гострій лімфобластній лейкемії у дітей / В.Д. Дроздова, С.В. Андреєва, Н.В. Кавардакова // Український журнал гематології та трансфузіології. - 2010. - № 3. - С. 5-11.

2. A clinical stading system for chronic lymphocytic leukemia: prognostic significance / J.L. Binet, M. Lepoprier, G. Dighiero [et al.] // Cancer. - 1977. - Vol. 40, № 2. - P. 855-864.

3. An International System for Human Cytogenetic Nomenclature. Recommendations of the International Standing Committee on Human Cytogenetic Nomenclature. Karger / Eds.: Shaffer L.G., McGowan-Jordan J., Schmid M. - 2013. - 140 p.

4. Clinical staging of chronic lymphocytic leukemia / K.R. Rai, A. Sawitsky, E.P. Cronkite [et. al.] // Blood. - Vol. 46, № 2. - P. 219-234.

5. Hallek M. Chronic lymphocytic leukemia: 2013 update on prognosis, risk stratification and treatment / M. Hallek // Am. J. Hematol. - 2013. - Vol. 88, № 9. - P. 803-816.

6. Hsi E.D. B-Cells leukemias of mature lymphocytes. In: Hemapathology. - Elsevier: Churchill livingstone, 2007. - Chapter 12. - P. 367-395.

7. Meloni-Ehring A. The cytogenetics of hematologic neoplasms / A. Meloni-Ehring Eds.: Gersen S.L., Keagle M.B. // In: The principles of clinical cytogenetics. - [3d edition]. - New York Heilderberg, Dordcht, London: Spinger, 2013.- Chapter 15. - P. 309-370.

8. Molecular basis of chronic lymphocytic leukemia diagnosis and prognosis / M.. Shahiahani, J. Mohammadias, F. Noroozi [et al.] // Cell Oncol. (Dordr.). - 2015. - Vol. 38, № 2. - P. 93-109.

9. Prognostic markers in chronic lymphocytic leukemia / M. Motyckova, P. Zak, V. Vroblova [et al.] // Vnitr. Lek. - 2011. - Vol. 57, № 10. - P. 847-857.

10. Rooney D.E. Human Cytogenetics. A practical Approach. Malignancy and Acquired Abnormalities / D.E. Rooney, B.H. Czepulkovsky- [2nd edition].- Oxford, NewYork, Tokyo : IRL Pressat Oxford University Press, 1995. - 293 p.

11. Trisomy 12 chronic lymphocytic leukemia cells exhibit upregulation of integrin signals that is modulated by NOTCH1 mutations / J.C. Riches, C.J. O'Donovan, S.J. Kington [et al.] // Blood. - 2014. - Vol. 123, № 26. - P. 4101-4110.

12. WHO Classification of Tumor Haematopoietic and Lymphoid Tissues / St.H. Swerdlow, E. Campo, N.L. Harris [et al.]. - Lyon: International Agency for Research Cancer, 2008. - 439 p.

Размещено на Allbest.ru