Размещено на http://www.allbest.ru/

Институт биохимической технологии и нанотехнологии

Направление нанотехнологии и микросистемная техника

РЕФЕРАТ

ПЦР- АНАЛИЗ. ПРИНЦИПЫ, ПРИМЕНЕНИЕ

Работу выполнила студентка Гомзина О.В.

1 курс, группа ЦНТмд-01-22

Научный руководитель: Доктор химических наук

Профессор Василенко И.А.



Оглавление

Введение

1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

1.1 Метод ПЦР

1.2 Краткая история метода ПЦР

1.3 ПЦР в реальном времени

1.4 Капельные системы

1.5 Системы на базе чипов

2. Примеры обнаружение бактериальных инфекций и микоплазм методом ПЦР

2.1 Обнаружение бактериальных инфекций методом ПЦР

2.2 Обнаружение микоплазмы у женщин методом ПЦР

3. Микрофлюидика и концепции цифровой ПЦР

3.1 Цифровая ПЦР на основе чипов (cd ПЦР)

3.2 Платформы активного разделения

3.3 Платформы пассивного разделения

3.4 Платформы самооцифровки

3.5 Цифровая ПЦР на основе капель (ddПЦР)

4. Перспективы метода ПЦР на будущее

Выводы

Список использованной литературы



Введение

полимеразный цепной реакция инфекция

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) -- это метод молекулярной биологии, используемый для умножения определенных фрагментов дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). Это распространенный и незаменимый метод, который применялся во многих областях. Сейчас уже используется третье поколение полимеразной цепной реакции, капельная цифровая полимеразная цепная реакция. Дополнительным преимуществом ПЦР является то, что они обладают реальной чувствительностью 90% -96%, что приводит к снижению доли нелеченных инфекций (ложноотрицательных тестов) по сравнению с методами на основе антигенов [6].

ПЦР стала одним из самых ценных методов, используемых в настоящее время в биологических науках, диагностике и криминалистике. В настоящее время существует две основные области применения ПЦР в биологии науках: системы ПЦР с высокой пропускной способностью и ПЦР-устройства на основе микрофлюидики по месту оказания медицинской помощи (ОМП). Мы также обсудим коммерциализацию этих методов и в заключение рассмотрим их модификации и использование в инновационных областях биомедицины. Например, ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени является золотым стандартом диагностики SARS-CoV-2. Его также можно использовать для приложений ОМП, поскольку он является ключевым компонентом системы «от образца до ответа».

Цель работы - изучить особенности и чувствительность метода ПЦР, принципы действия и основные области применения.



1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

1.1 Метод ПЦР

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - это метод, широко используемый в молекулярной биологии для быстрого создания миллионов или миллиардов копий конкретного образца ДНК, позволяющий ученым взять маленький образец ДНК и увеличить его до достаточно большого количества для подробного изучения. С помощью ПЦР копии очень небольших количеств последовательностей ДНК экспоненциально амплифицируются в серии [1, 2].

Термические циклы подвергают реагенты повторяющимся циклам нагревания и охлаждения, чтобы обеспечить различные температурно-зависимые реакции, в частности, разделение ДНК и ферментативную репликацию ДНК (Рисунок 1).

Рисунок 1 Термоциклер для проведения ПЦР

В ПЦР используются два основных реагента - праймеры (которые представляют собой короткие одноцепочечные фрагменты ДНК, известные как олигонуклеотиды, которые являются комплементарной последовательностью к целевой области ДНК) и ДНК-полимераза.

На первом этапе ПЦР две цепи двойной спирали ДНК физически разделяются при высокой температуре в процессе, называемом денатурация нуклеиновой кислоты. На втором этапе температура понижается, и праймеры связываются с комплементарными последовательностями ДНК. Затем две цепи ДНК становятся матрицами для ДНК-полимеразы для ферментативной сборки новой цепи ДНК из свободных нуклеотидов, строительных блоков ДНК. По мере развития ПЦР полученная ДНК сама используется в качестве матрицы для репликации, приводя в движение цепную реакцию, в которой исходная матрица ДНК экспоненциально амплифицируются.

Почти во всех применениях ПЦР используется термостабильная ДНК-полимераза, такая как Taq-полимераза, фермент, первоначально выделенный из термофильной бактерии Thermus aquaticus. Если бы используемая полимераза была термочувствительна, она денатурировалась бы при высоких температурах.

Анализ на основе ДНК-полимеразы стал незаменимым во многих областях (биология, криминалистика, медицина и пр.) [3, 4]. Установленные методы, такие как обычная ПЦР и количественная ПЦР в реальном времени (КПЦР), а также новые, такие как цифровая ПЦР (ДПЦР) и массивно-параллельное секвенирование (MPS), являются ключевыми инструментами для принятия решений, например, в криминалистическом ДНК анализе, безопасности пищевых продуктов, клинической диагностике и пр. [5]. Одна из основных аналитических задач заключается в том, что интересующие образцы часто содержат небольшое количество нуклеиновых кислот в сочетании со сложной матрицей [6]. Молекулы из матрицы образца, клеток-мишеней или реагентов, добавленные во время приготовления образца, которые влияют на полимеризацию ДНК in vitro или сигнал флуоресценции, вместе называются ингибиторами ПЦР. Чтобы преодолеть аналитические ограничения в присутствии ингибиторов ПЦР, полезно понять основные механизмы молекулярного ингибирования (Рисунок 2).

Рисунок 2 Иллюстрация критических подреакций в ПЦР. Ингибиторы ПЦР могут влиять на любую из этих подреакций, то есть нарушать отжиг праймеров, влиять на активность ДНК-полимеразы или ухудшать детекцию флуоресценции (по данным [7])

Сила ПЦР заключается в том, что она обеспечивает амплификацию и обнаружение специфических нуклеотидных последовательностей из одной или нескольких молекул-мишеней. Эффективная полимеризация ДНК in vitro требует высокой активности ДНК-полимеразы, а также благоприятных взаимодействий между нуклеиновыми кислотами (денатурация-мишень и отжиг праймера), что означает, что в них вовлечены как биохимические, так и биофизические процессы.

Измерение флуоресценции является основным средством обнаружения и количественного определения нуклеиновых кислот в анализе на основе ДНК-полимеразы благодаря простоте использования и превосходным пределам обнаружения [7]. Интенсивность флуоресценции также используется для мониторинга генерации ампликона. Часто игнорируемым недостатком флуоресцентного анализа является то, что любое вещество, которое нарушает функцию флуорофора, например, гашением флуоресценции, ухудшит анализ [7]. Серотипы уреаплазмы и их антимикробная восприимчивость у пациентов с бесплодием и инфекциями половых путей.

Метод ПЦР является основным методом получения генов, который базируется на способности ДНК-полимеразы образовывать вторую цепочку ДНК. За последние 100 лет было очень мало изобретений, которые могли бы конкурировать с ПЦР, поскольку она произвела революцию в биологических и генетических исследованиях. Mullis и соавт. заметили, что метод секвенирования по дает слабые сигналы при секвенировании одного гена из-за недостаточной концентрации ДНК [8]. Добавление шага денатурации для разделения каждой молекулы двухцепочечной ДНК на две одноцепочечных ДНК и обратного праймера для определения общей длины ампликона привело к амплификации копий ДНК на две. К сожалению, полимераза разрушалась на каждом этапе денатурации, и ее приходилось добавлять для каждого цикла ПЦР, что делало реализацию метода утомительной; в дальнейшем было найдено решение с помощью автоматизированной системы под названием «Baby Blue» (Рисунок 3, А) [9].

Рисунок 3 Развитие системы ПЦР и ее приложений: (A) Прототип термоциклера для ПЦР, разработанный в 1986 году; (B) ПЦР в космической области. (C) ПЦР во временной области; (D) Использование закрепленных аллель-специфических зондов и меченых праймеров для колориметрического обнаружения мутаций в гене бета талассемии (HBB); (E) Одно из первых применений мультиплексной ПЦР, обнаружение делеций в гене DMD у пациентов, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна; (F) Последняя версия мультиплексной ПЦР с флуоресцентно-мечеными праймерами и разделением ампликонов с помощью капиллярного электрофореза в настоящее время используется в рутинной судебно-медицинской экспертизе; (G) Использование ПЦР для амплификации аллелей мульти аллельного мини сателлитного локуса, окрашивание ампликонов серебром в полиакриламидном геле и сравнение их длин с аллельным маркером [9]



1.2 Краткая история метода ПЦР

Первоначально ПЦР была разработана для выявления мутаций в гене бета - Талассемии -- группы наследственных заболеваний кроветворной системы, которые характеризуются нарушением синтеза гемоглобина (HBB), вызывающих серповидно клеточную анемию. Гибридизация радиоактивно меченых олигонуклеотидов и последующий рестрикционный анализ использовались в этом проекте для поиска таких унаследованных мутаций. Поэтому последовательности гена в-глобина были выбраны в качестве первых для ферментативной амплификации [9].

Знания, полученные в ходе этой работы над геном HBB, были использованы при анализе аллелей HLA-DQ2 у пациентов с недиагностированным поражением слизистой оболочки тонкой кишки или положительной серологией целиакии и привели к разработке метода генотипирования этого мульти аллельного локуса с использованием гибридизации ампликонов с аллель-специфичными олиго нуклеотидами [9]. Методика применялась в трансплантологии и криминалистике. Последовали многочисленные клинические применения ПЦР, особенно в области клинической генетики и в микробиологии для выявления вирусных и бактериальных инфекций [10, 11]. Полезность ПЦР как инструмента диагностики инфекционных заболеваний была впервые продемонстрирована при их обнаружении в 1987 г. и получила дальнейшее развитие в последующие годы [9].

Обнаружение того, что ампликоны разной длины, определяемые разными парами праймеров, могут продуцироваться одновременно в одной пробирке для ПЦР, стало важной вехой в развитии методов ПЦР-диагностики. Это так называемая мультиплексная ПЦР, которая использовалась на ранних этапах разработки ПЦР для обнаружения делеций в DMD -- одном из крупнейших генов человека (Рисунок 3, E) [7]. Этот ген локализован на Х-хромосоме, и его мутации ответственны за мышечную дистрофию Дюшенна-Беккера у мужчин. До недавнего времени на этом принципе основывались многочисленные диагностические подходы. В последнее время подготовка библиотек больших генных панелей для секвенирования нового поколения (NGS) также была основана на высоко мультиплексной ПЦР [12].

После публикации пионерского исследования, в котором была продемонстрирована амплификация ДНК из одиночных сперматозоидов [9], началась новая область применения ПЦР. Эта новаторская разработка привела к недавнему широкому использованию ПЦР в криминалистике и вспомогательной репродукции, где требуется анализ генетического материала из одной или нескольких клеток.

ПЦР вошла в область криминалистики, когда исследователи успешно продемонстрировали мультиплексирование шести высоко полиморфных мини сателлитных локусов в одной пробирке для ПЦР. Этот успех был достигнут благодаря высокой воспроизводимости результатов, полученных при использовании нанограммов человеческой ДНК. Дальнейшая разработка этих принципов привела к внедрению мультиплексного микро сателлитного анализа, окрашиванию ампликонов серебром в полиакриламидном геле и сравнению их длин с аллельным маркером - лестницей (Рисунок 3, G) [9]. Затем проводили разделение ампликонов с флуоресцентной меткой методом капиллярного электрофореза. Эта разработка позволила ученым работать с более короткими длинами ампликонов и анализировать сильно разложившийся материал [9]. Эта методология в настоящее время представляет собой основной рабочий процесс в лабораториях судебной экспертизы (Рисунок 3, F) [9].

С 1993 года, после разработки метода мониторинга кинетики ПЦР в реальном времени [13], методы ПЦР стали полностью количественными (кПЦР). Включение обратной транскрипции (ОТ) в качестве первого шага перед термоциклированием позволило использовать технологии ПЦР (ОТ-ПЦР или кОТ-ПЦР) в исследованиях РНК [9]. Эти модификации основного метода ПЦР быстро стали золотым стандартом для количественного анализа нуклеиновых кислот.

1.3 ПЦР в реальном времени

ПЦР в реальном времени основана на ПЦР и измеряет количество продукта ПЦР после каждого раунда амплификации с использованием флуоресцентного считывания [14]. Типичный график амплификации ПЦР в реальном времени представляет собой кривую сигмоидальной формы (в линейном масштабе) и включает базовую фазу, за которой следует экспоненциальная фаза, которая достигает плато через линейную фазу (Рисунок 4). Экспоненциальная фаза представляет собой наиболее эффективную фазу амплификации, и количество продуктов ПЦР удваивается с каждым циклом, если эффективность амплификации составляет 100%.

Рисунок 4 Анализ количественной ПЦР в реальном времени с использованием стандартной кривой; (а) Кривые амплификации для серии 6-точечных 10-кратных разведений матрицы с известными концентрациями (стандарт) более пяти порядков (например, геномная ДНК, ПЦР- ампликон, линеаризованная плазмида); (б) Стандартная кривая создается путем нанесения значений Cq, полученных из кривых амплификации серии разведений, в зависимости от логарифма стандартного количества. Стандартная кривая используется для интерполяции целевого количества. Наклон стандартной кривой измеряет эффективность амплификации количественной ПЦР. Наклон -3,32 (для стандартной кривой, полученной из серии серий 10-кратных разведений) указывает на 100% эффективность амплификации, т. е. количество продукта ПЦР удваивается во время каждого цикла [15]

ПЦР в реальном времени позволяет проводить количественную оценку мишени относительно калибратора. Метод является количественным (кПЦР) при калибровке стандартной кривой с использованием данных экспоненциальной фазы. «Абсолютное» количество последовательности-мишени в реакции количественной ПЦР измеряется относительно стандартной кривой, полученной из образца с известным количеством или числом копий (Рисунок 4). Этот метод подразумевает, что эффективность амплификации образца и стандартов эквивалентна.

Внедрение микро жидкостных систем привело к разработке совершенно нового семейства устройств, таких как проточная миниатюрная и быстрая ПЦР. Исследователи, занимающиеся микрообработкой кремния, быстро взялись за эту задачу, разработав миниатюрные [9] и портативные устройства для ПЦР, а затем и количественной ПЦР.

1.4 Капельные системы

Существует несколько методов разделения образцов с образованием капель [9]. Капли, включая клетки, загружаются в микрожидкостный канал и переносятся в разные положения внутри чипа, а затем подвергаются ряду процедур, таких как лизис клеток, выделение и очистка ДНК, ПЦР и обнаружение флуоресценции. Капли с выделенной ДНК в небольшом объеме разделяются несмешивающейся жидкостью, такой как минеральное масло, образуя эмульсию. Затем проводят термоциклирование путем нагревания этой эмульсии, и камеры фиксируют последующую флуоресценцию. Эта платформа обычно используется в исследованиях одиночных клеток, часто называемых «ПЦР одиночных клеток».

1.5 Системы на базе чипов

Различные структуры микросхем изготавливаются путем микрообработки с различными лунками или микрожидкостными каналами в таких материалах, как кремний, стекло или полимеры (обычно полидиметилсилоксан или полиметилметакрилат). Образцы загружают либо в лунки, либо в каналы для последующей амплификации ДНК с помощью ПЦР [9]. Миниатюрные системы ПЦР обеспечивают мобильность и экономию времени. Общее время реакции зависит от ряда параметров, таких как размер чипа, объем мастер-микса для ПЦР, теплопроводность субстрата и скорость циклического изменения температуры. Исследователи успешно сократили время реакции и продемонстрировали чрезвычайно быструю ПЦР с 0,4 с/цикл, в результате чего общее время реакции составило менее 15 с [9].



2. Примеры обнаружение бактериальных инфекций и микоплазм методом ПЦР

2.1 Обнаружение бактериальных инфекций методом ПЦР

Анализ ампликонов на основе ПЦР, такой как секвенирование 16S рРНК, является основным инструментом для количественной оценки и изучения микробного состава, динамики и взаимодействий. Однако, учитывая сложность микробных сообществ, становится необходимым значительное количество образцов для анализов, анализирующих факторы, определяющие микробный состав. Общим узким местом в проведении такого рода экспериментов является выделение геномной ДНК (гДНК), которое требует много времени, дорого и часто предвзято в зависимости от типов присутствующих видов. Метод прямой ПЦР является потенциально более простой и точной альтернативой методам выделения гДНК, не требующим промежуточного этапа очистки. В исследовании [16] авторы оценили три варианта прямых методов ПЦР с использованием различных гетерогенных бактериальных культур, включая как грамположительные, так и грамотрицательные виды, стандарты микробного сообщества ZymoBIOMICS и грунтовые воды. Сравнивая методы прямой ПЦР с наборами DNeasy Blood and Tissue Kits для микробных изолятов и наборами DNeasy PowerSoil для микробных сообществ, авторы обнаружили, что конкретный вариант метода прямой ПЦР демонстрирует общую эффективность, сравнимую с эффективностью обычного протокола DNeasy PowerSoil. Авторы также обнаружили, что этот метод показал более высокую эффективность выделения гДНК из грамотрицательных штаммов по сравнению с протоколом DNeasy Blood and Tissue. Прямой метод ПЦР в 1600 раз дешевле ($0. 34 для 96 образцов) и в 10 раз проще (15 минут практического времени для 96 образцов), чем протокол DNeasy PowerSoil. Метод прямой ПЦР также может быть полностью автоматизирован и совместим с образцами небольшого объема, что позволяет масштабировать образцы и повторы, необходимые для поддержки высокопроизводительного крупномасштабного анализа бактериального сообщества [16].

2.2 Обнаружение микоплазмы у женщин методом ПЦР

В работе Amirmozafari N. и соавт. [17] были отобраны 210 пациентов женского пола, которые обратились к врачам для лечения инфекций женских половых путей, у каждого пациента были взяты образцы эндоцервикальных мазков.

Олигонуклеотидные праймеры были выбраны из опубликованных нуклеотидных последовательностей консервативной межгенной спейсерной области в 16S-23S рРНК микоплазм и модифицированы для того, чтобы иметь возможность детектировать все три генитальные микоплазмы одновременно (Таблица 1).

Для проведения ПЦР использовали готовый раствор Master Mix (Ampliqon Co., Дания). Реакционная смесь для ПЦР (общий объем 50 мкл) включала: 15 мл раствора мастер-смеси 1X. ПЦР проводили в системе ПЦР GenAmp (Corbeit, Германия) в соответствии со следующей программой: предварительная денатурация в течение 5 минут при 95 °C с последующими 30 циклами, каждый из которых содержал денатурацию при 94 °C в течение 30 секунд, отжиг при 56 ° C в течение 30 секунд.

Таблица 1

Последовательности олигонуклеотидных праймеров, специфичных для гена 16S-23S рРНК микоплазм

Анализ продукта ПЦР: продукты ПЦР подвергали электрофорезу в 3% агарозном геле, их визуализировали с последующим окрашиванием зеленым SYBER (Рисунок 5). Для окончательного подтверждения амплифицированные полосы подвергали секвенированию ДНК, а также расщеплению рестрикционной эндонуклеазы M. genitalium и U. urealyticum ферментами.

Рисунок 5 Электрофорез в агарозном геле продуктов амплификации ПЦР, полученных из образцов ДНК пациентов. Дорожки 1 являются отрицательным контролем и не показывают микоплазменную инфекцию. На дорожке 2 показан продукт амплификации в количестве 559 п.н. Urealyticum и 630 п.н. M. hominis. Дорожка 3 показывает 465 п.н. M. genitalium и U. urealyticum. Дорожка 4 показывает M. genitalium и M. hominis. Дорожка 5 показывает M. genitalium, U. urealyticum и M. hominis. Дорожка 6 - маркер размера ДНК (лестница ДНК 100 п.н.) [17]

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

210 обследованных пациентов имели средний возраст 31,9 года (SD = 9,7). 76,7% никогда не имели беременности, и только 2,9% из них имели роды. У пациенток были влагалищные выделения, крапивница и раздражение вульвы, а вагинит и цервицит были частыми осложнениями (Таблица 2).

Таблица 2

Клинические симптомы и осложнения у женщин с генитальной микоплазменной инфекцией [17]

Результаты ПЦР показали, что 57,1% (120 случаев) пациентов были инфицированы микоплазмой. Уровень изоляции для M. hominis составил 20% (42 случая), M. genitalium - 5,2% (11 случаев) и U. urealyticum - 44,3% (93 случая). Кроме того, 25 образцов были ПЦР-положительными для всех трех организмов, в которых только 21 образец был обнаружен при помощи ПЦР-позитивных признаков, указывающих на коинфекции бактерий M. hominis и U. urealyticum.

Для подтверждения результатов ПЦР амплифицированные продукты ДНК (Рисунок 5) подвергали секвенированию ДНК, а также расщеплению рестрикционной эндонуклеазой (номер доступа для U. urealyticum: GQ375145 и номер доступа для M. genitalium GQ367563). Усиленные полосы, относящиеся к M. genitalium и U. urealyticum, разрезали CaC8I (фрагменты 73 и 393 п.н.) и TaqI (фрагменты 227 и 332 п.н.) соответственно (Рисунок 6, Рисунок 7). Результаты секвенирования ДНК сравнивали с известными последовательностями ДНК гена 16S-23S рРНК каждой микоплазмы, соблюдаемыми в Genbank. Когда последовательности анализировали с помощью программного обеспечения Blast, это четко указывало, что каждый из амплифицированных продуктов действительно принадлежал к соответствующей микоплазме.

Рисунок 6 Паттерны полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (RFLP) продуктов ПЦР из Mycoplasma genitalium после расщепления; Дорожка 1: 465 п.н. продуктов ПЦР Mycoplasma genitalium соответственно; Дорожка 2: продукты ПЦР Mycoplasma genitalium после расщепления CaCI соответственно; Дорожка 3: продукты ПЦР Mycoplasma genitalium после расщепления TaqI (не расщепляется); Дорожка 4 - маркер размера ДНК (лестница ДНК 100 п.н.) [17]



Рисунок 7 Паттерны полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (RFLP) продуктов ПЦР из Ureaplasma urealyticum после расщепления рестриктазами TaqI; Дорожка 1: продукты ПЦР Ureaplasma urealyticum после расщепления TaqI соответственно; Дорожка 2: продукты ПЦР длиной 559 п.н. Ureaplasma urealyticum соответственно; Дорожка 3: продукты ПЦР Ureaplasma urealyticum после расщепления CaCl (не расщепляется); Дорожка 4 - маркер размера ДНК (лестница ДНК 100 п.н., SM # 333) [17]

Обнаружение Mycoplasma spp. является клинически значимым в свете возросшей способности бактерий прилипать и колонизировать эндоцервикальные выстилки и тем самым вызывать клинические симптомы у женщин, у плода, а также у новорожденных. Поэтому быстрое выделение этих бактерий является клинически важным. Мультиплекс-ПЦР часто проводят с использованием пар праймеров для обнаружения множества различных организмов, обычно по одной паре праймеров для каждого агента. Часто необходимо оптимизировать условия реакции для каждого набора праймеров. Поскольку каждый набор праймеров имеет свою собственную температуру плавления и время отжига, часто очень трудно достичь согласованной температуры и времени отжига, чтобы все пары праймеров могли присоединиться к своим целевым последовательностям.

В этом исследовании частота выделения микоплазмы методом ПЦР составила 57,1%. Кроме того, случаи смешанных инфекций, которые были обнаружены с помощью ПЦР, были значительными (11,9%). Исследование показывает, что высокий процент пациентов действительно был инфицирован U. urealyticum (44,3%) и в меньшей степени M. genitalium (5,2%). Уровень заражения M. hominis составил 20% [17].



3. Микрофлюидика и концепции цифровой ПЦР

Концепция цифровой ПЦР - d ПЦР была разработана [15] с использованием микропробирок или 384-луночных микропланшетов. Микрофлюидика, то есть миниатюризация работы с жидкостями, сделала возможным массивно-параллельное разделение образцов и появление платформ dПЦР. Микрофлюидика опирается на методы микропроизводства, адаптированные из микроэлектроники, и ее реализация зависит либо от быстрого прототипирования с помощью мягкой литографии в полидиметилсилоксане (ПДМС), травления стекла или литья под давлением [15]. Многочисленные активные и пассивные микрожидкостные методы использовались для разделения образцов, от физических перегородок до жидких капель. Большинство этих методов допускают простую автоматизацию и ограниченное использование реагентов.

Многие технологии произошли от оригинальной ПЦР; одним из примеров является цифровая ПЦР - dПЦР [15], которая основана на разделении ПЦР-образца на тысячи, а в некоторых случаях и на миллионы подвыборок из исходной молекул ДНК. После ПЦР доля положительных по амплификации фрагментов используется для количественного определения концентрации целевой последовательности со статистически определенной точностью с использованием статистики Пуассона (Рисунок 8). Интересно, что разделение образцов эффективно концентрирует целевые последовательности в изолированных микрореакторах. Этот эффект концентрации снижает конкуренцию матриц и, таким образом, позволяет обнаруживать редкие мутации. Кроме того, этот метод может также обеспечить высокую толерантность к ингибиторам, присутствующим в образце.



Рисунок 8 Принципы цифровой ПЦР. Образец разделен на множество независимых разделов, каждый из которых содержит либо несколько целевых последовательностей, либо не содержит их вовсе. Распределение целевых последовательностей в разделах можно аппроксимировать распределением Пуассона. Каждый раздел действует как отдельный микрореактор ПЦР, и разделы, содержащие амплифицированные последовательности-мишени, обнаруживаются с помощью флуоресценции. Отношение положительных долей (наличия флуоресценции) к общему количеству позволяет определить концентрацию в образце [15]

Чувствительность сильно зависит от количества ложноположительных и ложноотрицательных событий. Хотя dПЦР является цифровым анализом, обнаруженный сигнал изначально является аналоговым, и необходимо применять порог, чтобы отделить истинный сигнал от фонового сигнала. Ложноположительные результаты могут возникать из-за плохого дизайна анализа или из-за обнаружения ложной амплификации при большом количестве циклов ПЦР. Кроме того, они также могут возникать в результате перекрестного загрязнения во время экспериментальной установки [15].

В то время как ложноположительные результаты могут быть сведены к минимуму за счет надлежащего дизайна и оптимизации анализа [15], ложноотрицательные результаты или молекулярное выпадение менее вероятны. Внутренний дизайн анализов dПЦР делает его склонным к молекулярному выпадению по разным причинам: (1) повышенное отношение поверхности к объему из-за разделения небольшого объема увеличивает вероятность ингибирования ПЦР из-за взаимодействия реагентов с поверхности; (2) было замечено, что амплификация одной молекулы часто менее эффективна, чем амплификация с большим числом молекул; (3) эффективность амплификации сильно зависит от источника ДНК (т. е. геномной или плазмидной, фрагментированной или длинной ДНК), и может быть нарушена при нагревании молекул ДНК [15].

3.1 Цифровая ПЦР на основе чипов (cd ПЦР)

Образец загружается в кремниевые чипы с лунками, выполненными методом микрообработки. Затем проводят термоциклирование и визуализируют чип с помощью флуоресцентной микроскопии [9] для определения количества лунок с положительными результатами ПЦР. Мультиплексирование выполняется так же, как и в dd ПЦР [9]. Микроконструкция на основе кремния позволяет комбинировать cd ПЦР, интегрированный с нагревателем/датчиком, с использованием ионно-чувствительного полевого транзистора в каждой лунке для мониторинга ПЦР, устраняя необходимость в отдельной системе флуоресцентной визуализации.

Выполнение dПЦР с физическими перегородками или камерами включает в себя заполнение устройства, разделение образца, термоциклирование и считывание результатов анализа. Следует отличать активные методы разделения, которые включают либо реконфигурацию устройства, либо механическое срабатывание, от пассивных методов разделения, которые основаны на гидродинамических эффектах или свойствах.



3.2 Платформы активного разделения

Одно из первых микрожидкостных устройств dПЦР основывалось на микрофлюидных клапанах, которые были созданы путем наложения жидкостной и управляющей сетей микрофлюидных каналов, изготовленных из эластомерного материала ПДМС [15]. Эти сети разделены тонкой мембраной, которая может быть деформирована в микрофлюидный канал путем приложения давления к противоположному управляющему каналу, чтобы создать «запирающий» клапан (Рисунок 9, а). Рабочий процесс включает: (1) заполнение всех камер реакцией; (2) давление на контрольный слой, который закрывает соединение между камерами, тем самым изолируя камеры друг от друга. Такое устройство позволило создать разделы размером 14 х112 Ч 6,25 нл.

Рисунок 9 Платформы активного секционирования. (а) Схема нажимного клапана в микрожидкостном чипе из ПДМС. Левая панель: каналы управления (красные) отделены от жидкостных каналов (синие) тонкой гибкой мембраной (желтая); (b) Устройство SlipChip основано на двух половинках чипа, которые содержат массивы открытых камер. Скользящее движение создает массивы независимых микрореакторов

3.3 Платформы пассивного разделения

Пассивное разбиение использует флюидные эффекты для создания подобъемов и не полагается на механические методы. Ключевое отличие от его макромасштабного аналога заключается в том, что микролунки обычно загружаются все сразу, чтобы полностью использовать распараллеливание, предлагаемое форматом. Это, в свою очередь, требует метода, который изолирует микролунки друг от друга и позволяет избежать быстрого испарения мизерных объемов. Чтобы поддерживать эффективное заполнение и разделение микролунок, необходимо иметь различные свойства поверхности между внутренней частью микролунки, которая должна быть гидрофильной, и верхней поверхностью массива (между микролунками), которая должна быть гидрофобной [15].

В отличие от этих активных стратегий, разделение в этом формате можно выполнять пассивно, используя слой несмешивающегося масла после загрузки водной фазы в микролунки. Масляная фаза преимущественно смачивает верхнюю часть массива и создает мениск, вытесняющий водную фазу; тройная линия масловодная фаза - сплошная линия закрепляется на переходах между гидрофобными и гидрофильными областями [15]. Граница раздела жидкость-жидкость простирается от закрепленной тройной линии до тех пор, пока не достигнет другого гидрофобного пятна, где будет создана еще одна распространяющаяся тройная линия.

3.4 Платформы самооцифровки

Платформы самооцифровки сочетают в себе как пассивное заполнение, так и разбиение. Пассивное наполнение может быть реализовано за счет использования эффекта закрепления для эффективного вытеснения воздуха жидкостью во время наполнения. Это было достигнуто за счет расположения двух рядов камер поперек основного канала (Рисунок 10) [15].

Рисунок 10 Самозаполняемые и разделяющие платформы; (а) Геометрия в шахматном порядке, где заполнение контролируется пиннингом. Конструкция обеспечивает эффективное заполнение путем быстрого движения раствора через ловушки и, таким образом, предотвращает захват воздуха внутри камер; (б) Схема устройства самооцифровки, содержащего 1020 лунок. Устройство сначала заполняется маслом, затем заполняется реакционной смесью и впрыскивается еще один поток масла, чтобы создать массив капель

Приведение в действие также может сыграть ключевую роль в упрощении экспериментальной установки. Например, спиннинг может распределять жидкость по камерам, расположенным вдоль спиралевидного канала.



3.5 Цифровая ПЦР на основе капель (ddПЦР)

Образец проходит через микрофлюидный чип, образуя сегментированный поток, в котором образец разделяется на десятки тысяч капель, разделенных несмешивающейся жидкостью, такой как минеральное масло, образующее эмульсию. Эмульсию собирают во флакон, проводят ПЦР, а затем образец обрабатывают на проточном цитометре для подсчета количества капель с положительным результатом ПЦР. Проводят термоциклирование, фиксируют и оценивают флуоресцентное изображение капель. По сравнению с qПЦР, ddПЦР имеет преимущества более высокой точности и более низкого коэффициента вариации при абсолютном количественном определении [9]. Мультиплексирование ПЦР обычно проводят с помощью флуоресценции на основе зондов с разными цветами возбуждения для каждой ДНК/РНК. Он также используется для создания библиотек для секвенирования одноклеточной РНК [9].

Первой целью эмульгирования является создание изолированных микрореакторов из капель воды в несмешивающемся масле. Важнейшим компонентом этой технологии является состав поверхностно-активного вещества и масла, который обеспечивает как стабильность этих микрореакторов, так и их совместимость с молекулярными реакциями, такими как ПЦР или изотермическая амплификация [18].

Инкапсуляция не всегда выполняет разделение образца, и ее можно использовать только для создания независимых микрореакторов, таких как BEAMing (бусины, эмульсия, амплификация, магнетизм) [19]. В этом методе разделение достигается с помощью магнитных шариков, которые захватывают целевые последовательности, путем ограничения разбавления таким образом, чтобы одна молекула захватывалась на шарик. Инкапсуляция выполняется для создания капель с одним шариком, используемых в качестве независимых микрореакторов для амплификации целевой последовательности и насыщения поверхности шарика. Эмульсии можно легко и быстро получить механическим сдвигом, при котором образуются полидисперсные капли. После извлечения шариков связанные с шариками последовательности, помеченные флуоресцентной меткой, идентифицируют с помощью проточной цитометрии с очень высокой пропускной способностью. Магнитные шарики обеспечивают простую и эффективную очистку образцов и манипулирование ими. Этот подход применяется для количественной оценки генетического дисбаланса конкретных генетических локусов [15]. Сила этого метода заключается в преобразовании молекулярного сигнала в цитометрические показания с минимальными ограничениями на процесс эмульгирования.

Методы микрожидкостных капель отличаются от BEAMing использованием капель в качестве настоящих разделов. Они становятся возможными благодаря методам микрожидкостного эмульгирования, которые создают монодисперсные капли с очень ограниченным изменением объема ().

Рисунок 11 Платформы на основе микрожидкостных капель; (а) Схема, иллюстрирующая образование капель с помощью сопла или генератора капель; (б) Сигнал флуоресценции от капель может быть обнаружен последовательно; ( с) Сигнал капель также может быть запрошен с помощью широкоугольного детектора, который позволяет одновременно анализировать до 1 миллиона капель; (d) Микрожидкостные капли могут быть созданы с помощью упрощенной экспериментальной установки, основанной на градиенте удержания (тип ступенчатого эмульгирования); (e) Генераторы капель были приведены в действие центрифугой, что позволяет одновременно инкапсулировать несколько образцов [15]

Применение dПЦР на основе микрожидкостных капель стало возможным благодаря амплификации одиночных молекул. Используя микрофлюидику на основе капель, количество разделов можно регулировать в соответствии с требованиями приложения, например, с устройствами, способными генерировать более 1 миллиона капель. Кроме того, изменение объема микрофлюидных капель находится в пределах нескольких процентов. Производительность образования капель может быть увеличена с помощью систем с несколькими соплами или за счет разделения капель.

Есть два аспекта усилий по коммерциализации, которые сделали ПЦР золотым стандартом в молекулярной диагностике. Одним из них является разработка автоматизированного прибора, заменяющего ручные операции, а другим -- набор реагентов, повышающих специфичность ПЦР, устраняющих перекрестное загрязнение и ингибирование, сокращающих время реакции и повышающих способность к мультиплексированию.

Наиболее значительным успехом миниатюризации и использования микрофлюидики является dПЦР, метод, обеспечиваемый микрофлюидикой. Системы на основе капель и чипов были коммерциализированы с количеством подвыборок (лунок) более 1 миллиона.



4. Перспективы метода ПЦР на будущее

Существует несколько методов, таких как NGS, где ПЦР играет незаменимую роль, и эта роль будет усилена в обозримом будущем. ПЦР будет играть важную роль в будущих методах молекулярной диагностики. Мы можем представить себе использование микрофлюидики для параллельного анализа нескольких образцов с использованием портативных систем. Микрожидкостные устройства также смогут проводить ОТ-ПЦР для анализа иммуномагнитной экзосомальной РНК (Рисунок 12, А) [9]. Количественная ПЦР на основе капель для очистки мРНК одиночных клеток и анализа экспрессии генов станет еще одним крупным применением микрофлюидики в ближайшем будущем (Рисунок 12, B) [9], а также количественные анализы миРНК (Рисунок 12, D) [9] и цифровая ОТ-ПЦР на базе чипа для абсолютного количественного определения мРНК в отдельных клетках (Рисунок 12, В) [9]. В настоящее время параллельное секвенирование всех молекул РНК или ДНК, принадлежащих одной клетке, внутри более крупной клеточной популяции возможно благодаря эмульсионной ПЦР, где нуклеиновые кислоты из каждой клетки заключены в одну каплю, штрих-кодированы и затем амплифицированы [9].



Рисунок 12 Применение микрофлюидики в массово-параллельных и портативных системах оказания медицинской помощи; (A) Интегрированная платформа ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени на основе чипа для анализа иммуномагнитной экзосомальной РНК; (B) Количественная ПЦР на основе капель для очистки одной клетки от мРНК и анализа экспрессии генов; (C) Цифровая ОТ-ПЦР на основе чипа для абсолютного количественного определения мРНК в отдельных клетках; (D) dПЦР на основе капель для количественного анализа мРНК; (E) Система LAMP на бумажной основе, изготовленная из полидиметилсилоксана для молекулярной диагностики; (F) Судебно-медицинская экспертиза, профили ДНК на чипе; (G) BioFire, обнаружение бактерий и вирусов на чипе

Также прогнозируется, что бумажные системы для ПЦР или LAMP будут пользоваться большим спросом для молекулярной диагностики (Рисунок 12, E) [9]. Судебно-медицинская экспертиза будет регулярно проводиться на месте преступления, выполняя профилирование ДНК на чипе (Рисунок 12, F) [9]. Системы обнаружения уже коммерчески доступны, например, BioFire для обнаружения бактерий и вирусов на чипе.

Миниатюризация ПЦР будет продолжаться с разработкой новых систем, объединяющих подготовку образцов с количественной ПЦР, переходя к действительно портативным системам «от образца к ответу» для приложений медицины. Пандемия COVID ускорила эту разработку, вызвав бум систем за счет преобразования существующих устройств на основе LAMP, первоначально разработанного для гриппа, в диагностический инструмент SARS-CoV-2 путем замены праймеров [21, 22]. Можно ожидать дальнейшего развития основанных на CRISPR методов для обнаружения и дифференциации продуктов амплификации, поскольку эта методология успешно применяется в различных областях биологии.

Системы диагностики в конечном итоге могут быть связаны вместе, образуя «интернет вещей», как это было продемонстрировано ранее в ПЦР. Новые системы могут быть автономными или базироваться на смартфоне с операционной системой Android [23, 24]. Преимущество заключается в том, что камерой можно управлять как извне, так и изнутри, и она может обмениваться данными с системой управления температурой и освещением через Bluetooth. После захвата изображения система Android может обработать его и отправить в центр управления по беспроводной сети.



Выводы

ПЦР стала одним из самых ценных методов, используемых в настоящее время в биологических науках, диагностике и криминалистике. В данном реферате рассмотрена история развития ПЦР и технологии, которые произошли от исходного метода ПЦР. Анализ на основе ДНК-полимеразы стал незаменимым во многих социальных функциях. Устоявшиеся методы, такие как обычная ПЦР и количественная ПЦР в реальном времени (кПЦР), а также новые, такие как цифровая ПЦР (dПЦР) и массово-параллельное секвенирование (МПС), являются ключевыми инструментами для принятия решений, например, при судебной экспертизе ДНК- анализа, безопасности пищевых продуктов, клинической диагностики и биозаражениям. В работе рассмотрены модификации методов ПЦР и использование в инновационных областях биомедицины. Например, ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени является золотым стандартом диагностики SARS-CoV-2.

Есть два аспекта усилий по коммерциализации, которые сделали ПЦР золотым стандартом в молекулярной диагностике. Одним из них является разработка автоматизированного прибора, заменяющего ручные операции, а другим -- набор реагентов, повышающих специфичность ПЦР, устраняющих перекрестное загрязнение и ингибирование, сокращающих время реакции и повышающих способность к мультиплексированию.

Наиболее значительным успехом миниатюризации и использования микрофлюидики является dПЦР, метод, обеспечиваемый микрофлюидикой. Системы на основе капель и чипов были коммерциализированы с количеством подвыборок (лунок) более 1 миллиона.



Список использованной литературы

1. Полиданов, М. А. Особенности выполнения диагностического ПЦР-анализа / М. А. Полиданов, И. С. Блохин // Стратегия научно-технологического развития России: проблемы и перспективы реализации. Петрозаводск: Международный центр научного партнерства «Новая Наука», 2020. С. 30-47. EDN SXXGMK.

2. Trieu, T. S. Multiplex polymerase chain reaction (M-ПЦР) for bacterial vaginosis detection/ T. S. Trieu, H.M. Nguyen, T. Nguyen [et al.] //Vietnam Journal of Science, Technology and Engineering. 2019. Т. 61. №. 3. С. 52-56.

3. Калашников, А. Е. ПЦР-диагностика возбудителей болезней сортов картофеля (Solanum tuberosum) / А. Е. Калашников, Я. А. Кабицкая // Известия Кабардино-Балкарского государственного аграрного университета им. В.М. Кокова. 2022. № 2(36). С. 5-14. DOI 10.55196/2411-3492-2022-2-36-5-14. EDN RPBWWS.

4. Характеристика микробиоты рта по данным ПЦР-диагностики у пациентов с пародонтитом перед дентальной имплантацией / Е. В. Глазкова, И. С. Лашко, А. Н. Калинина, А. Ф. Степанов // Современные проблемы науки, технологий, инновационной деятельности: Сборник научных трудов по материалам Международной научно-практической конференции. В 4-х частях, Белгород, 31 августа 2017 года / Под общей редакцией Е. П. Ткачевой. Том Часть II. Белгород: Общество с ограниченной ответственностью "Агентство перспективных научных исследований", 2017. С. 12-16. EDN ZFNBBJ.

5. Николаева, А. Ф. Разработка и характеристика метода многолокусной метилчувствительной ПЦР в режиме реального времени / А. Ф. Николаева, В. О. Сигин, А. И. Калинкин [и др.] // Медицинская генетика. 2022. Т. 21. № 1. С. 34-43. DOI 10.25557/2073-7998.2022.01.34-43. EDN EFZWWK.

6. Hedman, H. ПЦР detection of microbial pathogens, methods in molecular biology/ J. Hedman, P. Radstrom //Methods in Molecular Biology. 2013. Т. 943. С. 17-48.

7. Sidstedt, M. ПЦР inhibition in qПЦР, dПЦР and MPS--mechanisms and solutions/ M. Sidstedt, P. Radstrom, J. Hedman//Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2020. С. 1-15.

8. Mullis, K. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction/ K. Mullis, F. Faloona, S Scharf [et al.] //Biotechnology Series. 1992. С. 17-17.

9. Zhu, H. ПЦР past, present and future/ H. Zhu, H. Zhang, H., Y. Xu [et al.] //BioTechniques. 2020. Т. 69. №. 4. С. 317-325.

10. Безбородова, Н. А. Полимеразная цепная реакция в диагностике латентных, бессимптомных и хронических форм инфекционных заболеваний крупного рогатого скота / Н. А. Безбородова, В. В. Кожуховская, М. В. Петропавловский, О. Г. Томских // Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии. 2019. № 4. С. 30-33. DOI 10.17238/issn2072-6023.2019.4.30. EDN XVDFQN.

11. Фролова, К. Р. Применение метода ПЦР в диагностике паразитозов / К. Р. Фролова, С. М. Пиняев // Четвериковские чтения: Сборник научных работ студентов. Нижний Новгород: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Приволжский исследовательский медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации, 2021. С. 112-117. EDN FGRCTF.

12. Hickman, M. P. Recovery of whole mitochondrial genome from compromised samples via multiplex ПЦР and massively parallel sequencing/ M. P. Hickman, K. Grisedale, B. Bintz [et al.] //Future science OA. 2018. Т. 4. №. 9. С. FSO336.

13. Патент № 2715333 C1 Российская Федерация, МПК C12Q 1/68. Набор реагентов для выявления и идентификации ДНК возбудителей бруцеллеза методом полимеразной цепной реакции в реальном времени "ОМ-скрин-бруцеллез-РВ»: № 2018139936: заявл. 12.11.2018: опубл. 26.02.2020 / В. Д. Сойбанов, Д. Г. Сочивко, А. В. Кузнецовский [и др.]; заявитель Федеральное государственное бюджетное учреждение "48 Центральный научно-исследовательский институт" Министерства обороны Российской Федерации. EDN GMVGKL.

14. Bustin, S. A. The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time ПЦР Experiments/ S. A. Bustin, V. Benes, J. Garson [et al.] //Clinical Chemistry. 2009. Т. 55. №. 4. С. 611-622.

15. Quan, P. L. dПЦР: a technology review/ P. L. Quan, M. Sauzade, E. Brouzes [et al.] //Sensors. 2018. Т. 18. №. 4. С. 1271.

16. Song, F. A Simple, Cost-Effective, and Automation-Friendly Direct PCR Approach for Bacterial Community Analysis/ F. Song, J. Kuehl, A. Chandran [et al.] //Msystems. 2021. Т. 6. №. 5. С. e00224-21.

17. Amirmozafari, N. Simultaneous detection of genital mycoplasma in women with genital infections by PCR/ N. Amirmozafari, R. Mirnejad, B. Kazemi [et al.] //J Biol Sci. 2009. Т. 9. №. 8. С. 804-9.

18. Holtze, C. Biocompatible surfactants for water-in-fluorocarbon emulsions/ C. Holtze, A.C. Rowat, J. Agresti [et al.] //Lab on a Chip. 2008. Т. 8. №. 10. С. 1632-1639.

19. Diehl, F. BEAMing: single-molecule PCR on microparticles in water-in-oil emulsions/ F. Diehl, M. Li, Y. He [et al.]//Nat Methods. ? 2006. №.3. C. 551-9.

20. Li, D. Primer design for quantitative real-time PCR for the emerging Coronavirus SARS-CoV-2/ D. Li, J. Zhang, J. Li //Theranostics. 2020. Т. 10. №. 16. С. 7150.

21. Kanwar, N. Comparison of the ID Now Influenza A & B 2, Cobas Influenza A/B, and Xpert Xpress Flu point-of-care nucleic acid amplification tests for influenza A/B virus detection in children/ N. Kanwar, J. Michael, K. Doran [et al.] //Journal of Clinical Microbiology. 2020. Т. 58. №. 3. С. e01611-19.

22. Разнообразие праймеров для ПЦР и принципы их подбора / Р. Р. Гарафутдинов, А. Х. Баймиев, Г. В. Малеев [и др.] // Биомика. 2019. Т. 11. № 1. С. 23-70. EDN RTПЦРC.

23. Gou, T. Smartphone-based mobile digital PCR device for DNA quantitative analysis with high accuracy/ T. Gou, J. Hu, W. Wu [et al.] //Biosensors and Bioelectronics. 2018. Т. 120. С. 144-152.

24. Cornelis S. Silicon µPCR chip for forensic STR profiling with hybeacon probe melting curves/ S. Cornelis, O. Tytgat, M. Fauvart //Scientific reports. 2019. Т. 9. №. 1. С. 1-9.

Размещено на Allbest.ru