Адренергічна модуляція високопорогових потенціалкерованих кальцієвих струмів у нейронах ганглія трійчастого нерва

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Адренергічна модуляція високопорогових потенціалкерованих кальцієвих струмів у нейронах ганглія трійчастого нерва

М.В. Телька, В.Ю. Маслов, М.С. Веселовський, С.А. Федулова

Інститут фізіологіїім. О.О. Богомольця НАН України, Київ;

Досліджено вплив норадреналіну на струми через високопорогові потенціалкеровані кальцієві канали нейронів ганглія трійчастого нерва (ГТН). Відмічено, що струм через кальцієві канали пригнічувався під впливом норадреналіну у 91% нейронів ГТН, при цьому у 62% клітин зменшувалася лише амплітуда (перша група), а у 29% також уповільнювалася кінетики (друга група). У першій групі попередня високоамплітудна деполяризація не впливала на дію норадреналіну, а у другій - призводила до відновлення кінетики та (частково) амплітуди струму. Це свідчить про відсутність прямого впливу субодиниціG-білка на кальцієві канали у першій групі нейронів та суттєвому його внеску у загальну модулюючу дію у другій. Одночасна аплікація норадреналіну з йохімбіном та селективними блокаторами різних типів кальцієвих каналів показала, що адренергічна модуляція кальцієвих струмів у нейронах ГТН опосередковується а2-адренорецепторами на 60%, близько половини (52%) загального адренергічного впливу реалізується через канали N-типу, внесок R- та P/Q-каналів становить 35 та 13% відповідно.

Ключові слова: ганглій трійчастого нерва; норадреналін; модуляція; високопорогові кальцієві канали.

М.В. Телька, В.Ю. Маслов, Н.С. Веселовский, С.А. Федулова

АДРЕНЕРГИЧЕСКАЯ МОДУЛЯЦИЯ ВЫСОКОПОРОГОВЫХ ПОТЕНЦИАЛУПРАВЛЯЕМЫХ КАЛЬЦИЕВЫХ ТОКОВ В НЕЙРОНАХ ГАНГЛИЯ ТРОЙНИЧНОГО НЕРВА

Исследовано влияние норадреналина на токи через высокопороговыепотенциалуправляемые кальциевые каналы нейронов ганглия тройничного нерва (ГТН). Отмечено, что токи через кальциевые каналы угнетались под влиянием норадреналина у 91% нейронов ГТН: при этом в 62% клеток уменьшалась только амплитуда тока (первая группа), а в 29% также наблюдалось замедление кинетики (вторая группа). В первой группе предварительная высокоамплитудная деполяризация не влияла на действие норадреналина, а во второй - приводила к возобновлению кинетики и (частично) амплитуды тока. Это свидетельствует про отсутствие прямого влияния субъединицы G-белка на кальциевые каналы в первой группы нейронов и к его существенному вкладу в общее модулирующее влияние во второй. Одновременная аппликация нооадреналина с йохимбином и селективными блокаторами разных типов кальциевых каналов показала, что адренергическая модуляция кальциевых токов в нейронах ГТН опосредуется а₂-адренорецепто- рами на 60%, и приблизительно половина (52%) общего адренергического влияния реализуется через N, вклад R- и P/Q-каналов составляет 35 и 13% соответственно. Ключевые слова: ганглий тройничного нерва; норадреналин; модуляция; високопороговые кальциевые каналы.

М.У. Telka, V.Yu. Maslov, N.S. Veselovsky,

S.A. Fedulova

ADRENERGIC MODULATION OF HIGH VOLTAGE ACTIVATED CALCIUM CHANNELS IN TRIGEMINAL GANGLION NEURONS

Sympathetic postganglionic projections to the trigeminal ganglion (TG) modulate electrophysiological characteristics of neurons, including high voltage activated calcium channels. Here, we studied such a modulation using local noradrenaline application on cultured TG neurons. Noradrenaline inhibited current via calcium channels in 91% of the neurons. In 62% of the cells only amplitude of the current decreased, whereas slowing of the kinetics observed in 29%. In the first group, preliminary high-amplitude depolarization did not affect the noradrenaline action, but in the second group, it led to recover of the kinetics and (partially) the amplitude. This suggests that G-protein mediated way of adrenoreceptor-calcium channel interaction is almost absent in the first group, but contribute significantly to the modulation effects in the second group. Simultaneous application of noradrenaline with yohimbine and selective calcium channels subtypes blockers revealed that in TG neurons 60% of adrenergic modulation is realized via a₂ receptors, and about half (52%) of the total effect is carried out via N-type of calcium channels, R- and P/Q-channels contribute 35 and 13% respectively.

Key words: trigeminal ganglion; noradrenaline; modulation; high voltage-activated calcium channels.

ВСТУП

Ганглій трійчастого нерва (ГТН) складається з псевдоуніполярних нейронів, що проводять сенсорні сигнали від органів голови та шиї у ЦНС. Адренергічний вплив на нейрони ГТН як в нормі, так і за патологічних умов здійснюється симпатичними постгангліонарними волокнами верхнього шийного ганглія [1]. Норадреналін, що вивільняється з них, модулює електричну активність нейронів ГТН [2, 3]. Ці зміни відбуваються внаслідок взаємодії метаботропнихадренорецепторів з потенціалкерованими іонними каналами [4-6], вплив на які здійснюється завдяки каскаду внутрішньоклітинних реакцій, запущених активацією G-білка та відрізняється для каналів різних типів [7-9]. Це достатньо детально досліджено на спінальних гангліях, тоді як дані про норадреналінвикликану модуляцію кальцієвих каналів на нейронах ГТН практично відсутні.

Метою нашої роботи було в нейронах ГТН дослідити норадреналініндуковані зміни у характеристиках потенціалзалежних струмів через кальцієві канали та визначити типи каналів, які задіяні у адренергічній модуляції.

МЕТОДИКА

Електрофізіологічні дослідження проводили на нейронах первинної культури дисо- ційованих клітин ГТН [10]. У роботі використовували реактиви виробництва «Sigma»(США). Для приготування первинної культури нейронів виділяли ганглії однодобових щурів лінії Вістар обох статей та поміщали в розчин, що містив буфер HEPES, мінімальне середовище Ігла та антибіотики. Для ферментативної обробки використовували 0,2%-й розчин пронази. Після цього етапу приготування проводили механічну дезагрегацію

пастерівськими піпетками різного діаметра. Клітини інкубували при 37°С у повітряно- газовому середовищі, збагаченому CO₂ до 5%. Розчин для культивування містив мінімальне середовище Ігла з додаванням 10% кінської сироватки («Gibco», США), 6 мкг/мл інсуліну та антибіотики. Проліферацію гліальних клітин зупиняли додаванням на 2-гу добу культивування цитозин-А-D- арабино-фуранозиду(ARA-C; 7 мкмоль/л), розчин замінювали на наступну добу.

Експерименти виконували при кімнатній температурі на 11--15-ту добу культивування, оскільки саме за цей період експресуються більшість типів потенціалкерованих кальцієвих каналів. Для реєстрації струмів через кальцієві канали використовували зовнішньоклітинний розчин, який містив (ммоль/л): холін хлорид - 140, MgCl₂- 4, BaCl₂- 2, TEA-Cl - 20, 4-амінопіридин - 3, глюкоза - 10, HEPES - 20; рН 7,4 (доведено CsOH). У зовнішньоклітинному розчині іони кальцію еквімолярно замінено на барій для уникнення ефектів, пов'язаних з кальційзалежною інактивацією кальцієвих каналів. Електроди-піпетки заповнювали внутрішньоклітинним розчином такого складу (ммоль/л): цезій ацетат - 90, CsCl- 20, TEA-Cl - 20, MgCl₂-2, №₂АТФ - 3, ШАДФ - 0,5, ШГТФ - 0,5, EG TA - 10, HEPES - 20; рН7,3 (доводили CsOH). Електричний опір електродів (внутрішній діаметр кінчика 1-1,5 мкм) становив 4-5 МОм. Ємність електрода компенсували після отримання гігаомного контакту безпосередньо перед проривом мембрани. Розмір соми нейронів визначали як середнє арифметичне значення великого і малого діаметрів. Електрофізіологічні дослідження виконували на клітинах розміром менших ніж 25 мкм із застосуванням методу фіксації потенціалу у конфігурації «ціла клітина». Для відведення використовували підсилювач Axopatch-1D («Axon Instruments», США). Сигнали оцифровували з частотою 10 кГц та записували на диск комп'ютера для подальшогоаналізу за допомогоюаналоговоцифровогоперетворювача DigiData1322А і програмного пакета pClamp9.0 («Axon Instrumets», США). Під час кожної реєстрації контролювали якість контакту «мембрана - електрод» за значенням сталої часу ємнісного струму у відповідь на прикладання коротких (10 мс) гіперполяризуючих прямокутних поштовхів напруги з амплітудою -5 мВ.

Аплікацію норадренліну, йохімбіну та селективних антагоністів кальцієвих каналів здійснювали через систему швидкої локальної суперфузії [11]. Для уникнення артефактів, пов'язаних з подачею розчинів, на клітину в контролі подавали зовнішньоклітинний розчин, а потім з доданою у відповідній концентрації діючою речовиною. Струми через кальцієві канали активували зміною потенціалу від -70 до 0 мВ протягом 200 мс. Період між стимуляціями становив 10 с.

Вибірки перевіряли на нормальність розподілу за критерієм Шапіро-Уілка. Результати представлено як середнє арифметичне ± стандартне відхилення (M ± m). Вірогідність різниці середніх встановлювали з використанням парного t-тесту Стьюдента. Відмінності вважали значущими при Р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

У відповідь на зміну потенціалу від -70 до 0 мВ у нейронах ГТН реєстрували вхідний струм через високопорогові потенціал- керовані кальцієві канали, який дозозалежно пригнічувався при аплікації норадреналіну. Залежність доза-ефект апроксимувалася відповідно до закону Міхаеліса-Ментен з параметрами EC₅₀= 0,14 ± 0,02 мкмоль/л та максимальним пригніченням струму на 20 ± 1%. Насичення ефекту відбувалося при концентрації норадреналіну 10 мкмоль/л. Амплітуда струму зменшувалася через 5-10 с, сягаючи стаціонарного значення через 20-25 с після початку аплікації.

Дія норадреналіну (25 мкмоль/л) викликала пригнічення струму в 91% (n = 96) нейронівГТН, а у 9% (n= 9) клітин зменшення амплітуди струму не спостерігалось або було меншим на 5% від контролю. Така норадреналінрезистентність свідчить про відсутність чи низький рівень експресії адренорецепторів на частині нейронів ГТН. За характером впливу норадреналіну на струм через кальцієві канали нейрони було розділено на дві групи: у першій амплітуда зменшувалася без змін кінетики (62%, n= 65) (рис. 1, а), тоді як у другій - спостерігали також уповільнення фронту наростання (29%, n= 31; див. рис. 1, б). У другій групі зміни кінетики характеризувалися зміщенням максимального значення струму відносно початку стимулу від 12 ± 1,5 мс у контролі до 48 ± 9 мс при дії норадреналіну. При цьому фаза зростання струму в контролі апрокси- муваласямоноекспоненційною залежністю з постійною часу 2,6 ± 0,4 мс (n= 12). При аплікації норадреналіну фаза зростання вхідного струму модифікувалася додатковою компонентною з часовою константою (20,6 ± 3,5 мс; n= 12); при цьому швидка компонента достовірно не відрізнялася від контролю, постійна часу становила 2,9 ± 0,5 мс (n= 12). Наявність цих двох груп свідчить про те, що нейрони ГТН відрізняються за співвідношенням кальцієвих каналів різних типів, а також, можливо, за внутрішньоклітинними механізмами впливу норадреналіну.

Рис. 1. Два типи норадреналінвикликаної модуляції струмів через потенціалкеровані кальцієві канали нейронів ганглія трійчастого нерва: а - без змін (а) та з уповільненням кінетики (б): 1 - контроль, 2 - аплікація норадреналіну та відмив. У вкладках наведено часовий перебіг зміни амплітуди струму відповідного нейрона при дії норадреналіну

Рис.2. Вплив попередньої деполяризації на струм через потенціалкеровані кальцієві канали нейронів ганглія трійчастого нерва за наявності норадреналіну. На а - схема протоколу стимуляції: за наявності НА, реєстрували струм у відповідь на деполяризацію від -80 до 0 мВ (1), після чого застосовували протокол з попереднім імпульсом від -80 до 80 мВ тривалістю 50 мс (2). На б - реєстрації струмів без відновлення (ліворуч) та з відновленням (праворуч) кінетики струму після. На в - статистичне порівняння нормованих на контрольні значень вхідного заряду в контролі, при аплікації НА (1), при аплікації норадреналіну та попередній деполяризації (2) для нейронів без відновлення (ліворуч) та з відновленням (праворуч) кінетики струму

Струми в нейронах з цими двома типами пригнічень по-різному реагували на попередню високоамплітудну деполяризацію, яка впливає на взаємодію Яy-субодиниціG-білка та а1-субодиниці кальцієвого каналу та призводить до збільшення амплітуди кальцієвого струму [12, 13]. Схема такої деполяризації (рис. 2, а) полягає у послідовному прикладанні попереднього кондиціонуючого імпульсу тривалістю 50 мс та амплітудою 160 мВ за 15 мс до тестуючого імпульсу амплітудою 80 мВ. Попередня деполяризація у нейронах першої групи практично не впливала наструм за наявності норадреналіну, а у другій групі призводила до відновлення кінетики та частково амплітуди струму від 80 ± 4 до 90 ± 3% (див. рис. 2, б). Отримані результати свідчать, що взаємодія Яy-субодиниціG-білка з кальцієвим каналом частково залучена у клітинні механізми адренергічного модулюючого впливу в одних нейронах ГТН (друга група) і практично відсутня в інших (перша група).

Відомо, що адренергічна модуляція кальцієвих каналів у багатьох центральних та периферичних нейронах здійснюється за рахунок активації а₂-адренорецепторів [4, 14, 15]. У нейронах ГТН ці рецептори також експресуються, а їх активація призводить до пригнічення електричноїактивності [6]. Однак вплив цього типу адренорецепторів на потенціалкеровані кальцієві канали у нейронах ГТН раніше не досліджувався. Аплікація селективного антагоніста а₂-адренорецепторів йохімбіну разом з норадреналіном призводила до зменшення струму через кальцієві канали в середньому на 13 ± 2% (n= 7), тоді як при прикладанні лише норадреналіну - на 21 ± 2% (n= 7; рис. 3). Отримані результати показують, що при дії норадреналіну пригнічення кальцієвих струмів частково (близько 60%) опосередковується а₂-адренорецепторами, однак також у цей процес залучені адреноре- цептори інших типів (найімовірніше, а_х).

Рис. 3. Роль а₂-адренорецепторів у адренергічній модуляції струмів через потенціалкеровані кальцієві канали нейронів ганглія трійчастого нерва. На а - зміни нормованих (1) струмів при дії норадреналіну разом з йохімбіном (2), при дії лише норадреналіну (3) та при відмиві (4). На б - середні значення нормованих струмів у контролі (1) при сумісній дії норадреналіну з йохімбіном (2) та при дії лише норадреналіну (3)

За своїми електрофізіологічними та фармакологічними властивостями високопорогові потенціалкеровані кальцієві канали поділяються на N, L, P/Qта R-типи[16]. Відносний внесок каналів кожного типу у інтегральний струм оцінювали за пригніченням струму при дії відповідного селективного блокатора у насичуючій концентрації. Аплікація ю-конотоксину (1 мкмоль/л, N-тип), ніфедипіну (10 мкмоль/л, L-тип) та ю-агатоксину (1 мкмоль/л, P/Q) призводила до зменшення струму через потенціалкеровані кальцієві канали на 41 ± 6% (діапазон значень від 15 до 74%), 28 ± 8% (8-47%) та 12 ± 4% (37-2%) відповідно. Сума цих середніх становить 81%, тобто можна було б очікувати, що частка струму через канали R-типу буде 19%. Проте після сумісної аплікації всіх трьох вищезгаданих селективних блокаторів середня відносна амплітуда залишкового струму була майже в 1,5 разабільшою (27 ± 5%; 11-44%). Така невідповідність, хоча і не є статистично достовірною, ймовірно свідчить про наявність певної кореляції у експресії різних типів високопороговихпотенціалкерованих кальцієвих каналів на нейроні ГТН, що потребує окремого дослідження.

Дія норадреналіну за наявності всіх блокаторів пригнічувала залишковий струм, зумовлений активацією каналів R-типу на 7 ± 2% (відносно контрольної амплітуди струму до аплікації блокаторів). В аналогічних дослідах із застосуванням селективних блокаторів L, N та P/Q-типів каналів залишковий струм пригнічувався на 19 ± 5% (n= 7), 7 ± 2% (n= 13) та 12 ± 2% (n= 11) відповідно (рис. 4). Отже, на фоні дії ніфедипіну вплив норадреналіну не відрізнявся від такого в контролі, що свідчить про відсутність помітної адренергічної модуляції каналів L-типу на нейронах ГТН. Норадреналініндуковане пригнічення за наявності ю-конотоксину та ю-агатоксину було достовірно меншим, щодо значень коли їх не додавали. Таким чином, середнєпригнічення струму через кальцієві канали за відсутності блокаторів становить 20%, при дії на R- таP/Q- , на R- та N-канали - 7 і 12% відповідно, а лише на R- 7%. Отримані результати задають систему лінійних рівнянь відносно невідомих внесків каналів N- та P/Q-типу у загальну дію норадреналіну на кальцієвий струм, розв'язок якої можна записати у наступному вигляді: N = 0,52, R= 0,35, P/Q= 0,13. Отже, у середньому близько половини модулюючого ефекту норадреналіну здійснюється за рахунок каналів N-типу.

Рис. 4. Участь різних типів високопорогових кальцієвих каналів у адренергічній модуляції нейронів ганглія трійчастого нерва: норадреналініндуковане пригнічення нормованих струмів через кальцієві канали в контролі (I), при наявності 10 мкмоль/л ніфедипіну (II), 1 мкмоль/л ю-агатоксину (Ш), 1 мкмоль/л ю-конотоксину (IV) та при аплікації усіх блокаторів (V) 1 - контрольні значення струму та при дії відповідного блокатора. 2 - зменшення струму при аплікації норадреналіну

У нашій роботі досліджено норадреналін- індуковані зміни характеристик струмів через високопороговіпотенціалкеровані кальцієві канали нейронів ГТН. Вони лежать в основі процесів симпато-сенсорного впливу на передачу імпульсації у системі трійчастого нерва, зокрема адренергічної модуляції електричної активності.

Встановлено, що у більшості клітин (91%) аплікація норадреналіну призводила до дозозалежногоінгібування кальцієвих струмів з константою половинного пригнічення (ЕС₅₀) 140 мкмоль/л. Аналіз кінетики струмів показав наявність двох електрофізіологічно відмінних типів адренергічної модуляції кальцієвих каналів. У 62% нейронів дія норадреналіну зменшувала амплітуду струму без змін кінетики, а у 29% - додатково спостерігалося уповільнення кінетики активації. За наявності норадреналіну попередня високоамплітудна деполяризація, яка блокує взаємодію Яy-субодиниціG-білка з кальцієвим каналом, не впливала на струм у нейронах першої групи, а у другій призводила до практично повного відновлення кінетики та часткового - амплітуди. Слід відмітити, що прямий шлях дії адренорецепторів на кальцієві канали в різних нейронах ГТН може бути як практично відсутнім, так івідповідальним за суттєву частку загального модулюючого впливу. Решта ефекту норад- реналіну ймовірно забезпечується іншими внутрішньоклітинними процесами, зокрема з залученням протеїнкінази С [17, 18]. У дослідах з використанням одночасної аплікації норадреналіну та селективних блокаторів різних типів потенціалкерованих кальцієвих каналів встановлено, що близько половини (52%) загального адренергічного впливу реалізується через канали N-типу, внесок R- та P/Q- каналів становить 35 та 13% відповідно.

REFERENCES

1. Matthews B, Robinson PP. The course of post-ganglionic sympatheticfibres distributed with the trigeminal nerve in the cat. J Physiol. 1980;303:391-401.

2. Kummer W, Gibbins IL, Stefan P, Kapoor V Catechola mines and catecholamine-synthesizing enzymes in guinea-pig sensory ganglia. Cell and Tissue Res. 1990;261(3):595-606.

3. ТєШпMV, MaslovVYu, Veselovsky NS, Fedulova SA. Noradrenaline action on electrical activity of cultured trigeminal ganglion neurons.FiziolZh. 2019;65(6): 22-9.

4. Abdulla FA, Smith PA. Ectopic alpha2-adrenoceptors couple to N-type Ca²⁺ channels in axotomized rat sensory neurons. J Neurosci. 1997;17(5):1633-41.

5. Honma Y, Yamakage M, Ninomiya T. Effects of adrenergic stimulus on the activities of Ca²+ and K+ channels of dorsal root ganglion neurons in a neuropathic pain model. Brain Res. 1999;832.(1-2):195-206.

6. Takeda M, Ikeda M, Tanimoto T, Lipski J, Matsumoto

S. Changes of the excitability of rat trigeminal root ganglion neurons evoked by alpha(2)-adrenoreceptors. Neuroscience. 2002;115(3):731-41.

7. Dolphin AC. G protein modulation of voltage-gated calcium channels. Pharmacol Rev. 2003;55(4):607-27.

8. Currie KP. G protein modulation of CaV2 voltage-gated calcium channels. Channels (Austin). 2010;4(6):497-509.

9. StrockJ, Diverse-Pierluissi MA. Ca²+ channels as integrators of G protein-mediated signaling in neurons. MolPharmacol. 2004;66(5):1071-6.

10. Telka MV, Rikhalsky OV, Veselovsky NS. Excitability properties of trigeminal ganglion neurons, FiziolZh. 2016; 62(2):24-34.

11. Veselovsky NS, Engert F, Lux HD. Fast local super fusion technique. Pflьgers Arch. : Eur J Physiol.1996;432(2):351-4.

12. Ikeda SR. Voltage-dependent modulation of N-type calcium channels by G-protein beta gamma subunits. Nature. 1996;380(6571):255-8.

13. TedfordHW, Zamponi GW. Direct G protein modu lation of Cav2 calcium channels. Pharmacol Rev. 2006;58(4):837-62.

14. Bian X, Galligan JJ. Alpha2-adrenoceptors couple to inhibition of R-type calcium currents in myenteric neurons. NeurogastroenterolMotil. 2007;19(10):845-55.

15. Li C, Horn JP. Differential Inhibition of Ca²⁺ channels by alpha2-adrenoceptors in three functional subclasses of rat sympathetic neurons. J Neurophysiol. 2008;100(6):3055-63.

16. Dolphin AC. A short history of voltage-gated calcium channels. BrJ Pharmacol. 2006;147Suppl 1:56-62.

17. Formenti A, Arrigoni E, Mancia M. Two distinct modulatory effects on calcium channels in adult rat sensory neurons. Biophys J. 1993;64(4):1029-37.

18. Luebke JI, Dunlap K. Sensory neuron N-type calcium currents are inhibited by both voltage-dependent and -independent mechanisms. Pflьgers Arch : Eur J Physiol. 1994;428(5-6):499-507.

Размещено на Allbest.ru