Ліпополісахаридіндукована системна запальна відповідь обтяжує розвиток окисно-нітрозативного стресу в слинних залозах щурів при їх алкогольному ураженні

Размещено на http://www.allbest.ru/

Ліпополісахаридіндукована системна запальна відповідь обтяжує розвиток окисно-нітрозативного стресу в слинних залозах щурів при їх алкогольному ураженні

Р.С. Козаєва¹, М.О. Клименко¹, В.О. Костенко²

¹ Чорноморський національний університет імені Петра Могили, Миколаїв;

² Полтавський державний медичний університет

Досліджували роль ліпополісахарид (ЛПС)-індукованої системної запальної відповіді (СЗВ) у розвитку окисно-нітрозативного стресу в слинних залозах щурів при їх алкогольному ураженні, яке відтворювали внутрішньошлунковим (через зонд) введенням 40%-го етанолу в дозі 24 мг/кг двічі на день протягом 14 діб. СЗВ моделювали внутрішньоочеревинним введенням ЛПС Salmonellatyphi по 0,4 мг/кг протягом 1-го тижня та одноразово щотижнево впродовж наступних 7 тиж. Виявлено, що тривале введення етанолу на тлі СЗВ призводило до зростання вмісту прозапальних чинників (фактора некрозу пухлин а, інтерлейкіну-6), а також маркера запалення - C-реактивного протеїну - у крові, що перевищувало відповідні показники при окремому введенні ЛПС Salmonella typhi або алкоголю. За цих умов у тканинах піднижньощелепних слинних залоз було вищим вироблення супероксидного аніон-радикала дихальним ланцюгом мітохондрій - на 25,9 та 30,5%, мікросомальними монооксигеназами та NO-синтазою - на 19,0 та 27,1%, НАДФН-оксидазою фагоцитів - на 29,5 та 30,0%; була збільшена активність індуцибельноїNO-синтази - на 15,5 та 83,6%, концентрація пероксинітритів лужних та лужно-земельних металів - на 32,5 та 58,3%, S-нітрозотіолів - на 20,2 та 22,7%. Ці зміни супроводжувалися більш істотним зменшенням у гомогенаті піднижньощелепних слинних залоз активності а-амілази та концентрації аквапорину-5, що погіршує процес екскреції слинними залозами білків та води. Зроблено висновок, що введення 40%-го етанолу на тлі ЛПС-індукованої СЗВ викликає у піднижньощелепних слинних залозах більш значний розвиток окисно-нітрозативного стресу та рівень їх дисфункції порівняно з окремим застосуванням ЛПС та алкоголю.

Ключові слова: ліпополісахаридіндукована системна запальна відповідь; алкоголь; окисно-нітроза- тивний стрес; слинні залози.

R.S. Kozaeva¹, M.O. Klymenko¹, МО. Kostenko²

LIPOPOLYSACCHARIDE-INDUCED SYSTEMIC INFLAMMATORY RESPONSE ENHANCES THE DEVELOPMENT OF OXIDATIVE-NITROSATIVE STRESS IN SALIVARY GLANDS OF RATS UNDER ALCOHOL DAMAGE

¹ Petro Mohyla Black Sea National University, Mykolayiv;

² Poltava State Medical University, Ukraine

We addressed the role of lipopolysaccharide (LPS)-induced systemic inflammatory response (SIR) in the development of oxidative-nitrosative stress in the salivary glands of rats under the influence of alcohol. Ethanol (40%) at the dose of 24 mg/kg was administered intraperitoneally (ip) twice per day for 14 days. SIR was induced by ip administration of LPS (Salmonella typhi) at the dose 0.4 mg/kg for 1 week followed by a weekly LPS administration for 7 weeks. We found that long-term administration of ethanol in the background of LPS-induced SIR increased the circulating level of proinflammatory markers (TNFa, IL-6) and C-reactive protein and this increase exceeded the respective values when LPS and alcohol were administered separately. Under these conditions, in submandibular salivary glands, the superoxide anion production by mitochondria respiratory chain was increased by 25.9 and 30.5%, by microsomal monooxygenases and NO synthase by 19.0 and 27,1%, by phagocyte NADPH-oxidase by 29.5 and 30.0%. The activity of inducible NO-synthase increased by 15.5 and 83.6%, the concentration of peroxynitrites of alkali and alkali-earth metals elevated by 32.5 and 58, 3%, and S- nitrosothiols raised by 20.2 and 22.7%. These changes were accompanied by a decrease in a-amylase activity and the aquaporin-5 concentration that impairs water and protein excretion by salivary glands. We conclude that administration of ethanol in the background of LPS-induced SIR results in more pronounced development of oxidative- nitrosative stress in the submandibular salivary glands and more marked dysfunction compared to separate use of LPS and alcohol.

Key words: lipopolysaccharide-induced systemic inflammatory response; alcohol; oxidative-nitrosative stress; salivary glands.

ВСТУП

За підрахунками Всесвітньої організації охорони здоров'я (ВООЗ), надмірне вживання алкоголю є третім за значенням фактором ризику для життя у розвинутих країнах світу [1]. Споживання спиртних напоїв неминуче впливає на органи порожнини рота, змінює транспортування різних сполук через слизову оболонку, викликає пародонтопатії та ксеростомію [2]. Тривале вживання алкоголю призводить до дистрофічних змін у слинних залозах (СЗ) [3], що збільшує ризик розвитку карієсу та захворювань ясен [4]. Показано, що вплив етанолу на СЗ проявляється змінами морфометричних показників їх кінцевих відділів та вивідних протоків, які відповідають часу формування хронічної алкогольної залежності [5].

Нещодавно велике популяційне дослідження показало, що надмірне споживання алкоголю сприяє підвищенню концентрації ліпідів і інсуліну в крові та окружності талії

[6] . Крім того, вживання алкоголю пов'язане з розвитком інсулінорезистентності [7]. Відомо, що ці чинники є компонентами метаболічного синдрому та асоціюються з одночасним розвитком низькоінтенсивного хронічного дифузного запалення [8]. Характерною рисою цього процесу є його тривалий перебіг, що супроводжується загальними ознаками у вигляді системної запальної відповіді (СЗВ), діагностичними маркерами якої вважається посилене вироблення про- та протизапальних цитокінів, активних форм кисню та азоту (АФК/АФА відповідно) та білків гострої фази [9]. Для експериментального відтворення СЗВ використовують внутрішньоочеревинне введення ліпополісіхариду (ЛПС) Salmonellatyphi, який викликає опосередковану через Toll-подібні рецептори (TLR) 4 активацію експресії генів прозапальних цитокінів та прооксидантних білків, пов'язану з транс- локацією у ядро транскрипційного ядерного фактора kB [10].

Відомо, що алкоголь неоднозначно впливає на утворенням деяких прозапальних медіаторів, зокрема, АФК/АФА [11]. Крім того залишаються нез'ясованими закономірності розвитку окисного та нітрозативного стресу у великих СЗ при надмірному споживанні алкоголю на тлі СЗВ.

Метою нашої роботи було вивчення ролі ЛПС-індукованої СЗВ у розвитку окисно- нітрозативного стресу в піднижньощелепних СЗ щурів при їх алкогольному ураженні.

МЕТОДИКА

Дослідження були проведені на 28 щурах- самцях лінії Вістар масою 205-220 г, розподілених на 4 групи: 1-ша - контрольна - тваринам внутрішньошлунково через зонд вводили ізотонічний розчин хлориду натрію 2 рази на день (n = 7); 2-га - з відтворенням алкогольного ураження СЗ; у 3-й - моделювали ЛПС-індуковану СЗВ (n = 7); у 4-й - алкогольне ураження СЗ відтворювали протягом 2 останніх тижнів моделювання

ЛПС-індукованої СЗВ (n = 7). Алкогольне ураження СЗ відтворювали внутрішньош- лунковим (через зонд) введенням 40%-го розчину етанолу в дозі 24 мг/кг 2 рази на день протягом 14 діб [12]. СЗВ моделювали внутрішньоочеревинним введенням ЛПС S. typhi по 0,4 мг/кг протягом 1-го тижня та одноразово щотижнево впродовж наступних 7 тиж [13]. Тварин декапітували під інгаляційним ефірним наркозом, дотримуючись положень «Європейської конвенції по захисту хребетних тварин, яких використовують в експериментальних та інших наукових цілях» (Страсбург, 1986).

Концентрацію цитокінів - інтерлей- кінів (ІЛ)-6 і 10, фактора некрозу пухлин а (ФНП-а) - та С-реактивного білка (СРБ) у сироватці крові визначали імунофермент- ним методом з використанням відповідних наборів Rat ELISA Kit («MyBioSource. com», США). Швидкість продукування в гомогенаті СЗ супероксидного аніон-ради- кала (.О - ) оцінювали при проведенні тесту з нітросинім тетразолієм з використанням спектрофотометра Ulab 101 (Китай) з індукторами:нікотинамідаденіндинуклеотидом відновленим (НАДН, “Sigma-AldrichInc.”, США) для оцінки продукції .О ₂дихальним ланцюгом мітохондрій, нікотинамідаденінди- нуклеотидфосфатом відновленим (НАДФН, “Sigma-Aldrich, Inc.”, США) - мікросомаль- ними монооксигеназами та NO-синтазою (NOS), ЛПС S. typhi - НАДФН-оксидазою лейкоцитів [14]. ліпополісахаридіндукована слинна залоза нітрозативний

Для оцінки показників нітрозативного стресу у гомогенаті піднижньощелепних СЗ спектрофотометрично визначали активність загальної NOS (за різницею концентрації нітрит-іонів до та після інкубації гомогенату в середовищі, що містить L-аргінін та НАДФН) [15] та її конститутивних ізо- форм (cNOS, при додаванні 1%-го розчину аміногуанідину гідрохлориду, “Sigma-Ald- rich, Inc.”, США) [16]. Активність індуци- бельної ізоформи NOS (iNOS) визначали за формулою: активність iNOS = активність загальної NOS - активність cNOS. Для оцінки здатності cNOS у неспряженому стані продукувати .О ₂замість NO розраховували індекс спряження (coupling) cNOS як відношення активності cNOS до швидкості вироблення О 2 НАДФН-залежними електронно-траспорт- ними ланцюгами. Досліджували вміст пе- роксинітритів лужних та лужно-земельних металів [15] та низькомолекулярних нітро- зотіолів [17].

Для оцінки функціонального стану під- нижньощелепних СЗ у їх гомогенаті визначали активність а-амілази спектрофотометрично за методикою Каравея за допомогою набору реактивів фірми «Філісіт-Діагности- ка» (Україна, м. Дніпро) та концентрацію аквапорину-5 імуноферментним методом з використанням набору Rat Aquaporin 5 ELISA Kit («MyBioSource.com», США).

Отримані результати статистично обробляли з використанням пакету програм Microsoft Office Excel з розширенням Real Statistics. Для перевірки розподілу на нормальність було застосовано розрахунок критерію Шапіро-Уілка. Оскільки варіаційні ряди відповідали нормальному розподілу, то для їх порівняння використовували критерій t Стьюдента для незалежних вибірок.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Введення алкоголю на вмісті у сироватці крові ФНП-а та ІЛ-6 вірогідно не позначалося, проте концентрація СРБ підвищувалася на

26,3% (Р < 0,05; табл. 1). Вміст ІЛ-10 перевищував значення контрольної групи на 22,7%.

Раніше проведений систематичний огляд експериментальних і клінічних досліджень з прийому алкоголю і змін при цьому продукції цитокінів та гострофазних білків виявив, що зв'язок між прийомом етанолу та вмістом СРБ, ІЛ-6 і ФНП-а є несуттєвим [18]. Повідомляється про можливість як зменшення вмісту СРБ у людей, які помірно споживають алкоголь [19], так і дозозалежного лінійного збільшення цього показника при зловживанні ним [20]. З розвитком у хворих алкогольного гепатиту виявлялись ознаки СЗВ: нейтро- фільний лейкоцитоз, підвищення вмісту СРБ, збільшення швидкості осідання еритроцитів, підвищення рівня фібриногену та феритину. Ці зміни часто супроводжувалися збільшенням великих СЗ [21].

Введення ЛПС призводило до зміни вмісту маркерів СЗВ у сироватці крові щурів: підвищувалися концентрації прозапальних цитокінів - ФНП-а (на 58,8%) і ІЛ-6 (на 79,5%) - та СРБ (на 69,0%), зменшувався вміст протизапального ІЛ-10 (на 50,9%), що свідчить про адекватність моделі СЗВ. Але при застосуванні алкоголю на тлі СЗВ вміст ФНП-а, ІЛ-6 та СРБ був вірогідно вищим - на 19,2, 28,5 та 16,8% відповідно, ніж при окремому введенні ЛПС, та на 60,7, 98,4 та 56,4% відповідно, ніж при окремому введенні алкоголю. Проте концентрація ІЛ-10 істотно не відрізнялася від такої при окремому введенні ЛПС.

У цілому одержані результати вказують, що надмірна алкоголізація організму щурів за умов СЗВ викликає додаткове зростання вмісту в крові прозапальних цитокінів - ФНП-а і ІЛ-6 - та СРБ, які вважаються індукторами окисно-нітрозативного стресу [22].

Введення 40%-го розчину етанолу в добовій дозі 48 мг/кг протягом 14 діб викликає дистрофічні явища у піднижньощелепних СЗ, що характеризуються зменшенням діаметра просвіту кінцевих відділів та розмірів епітеліоцитів, десквамацією протокових епітеліоцитів, зменшенням кількості секреторних гранул у гранулярних протоках, порушеннями мікроциркуляторного русла, збільшенням перипротокової та периаци- нарної кількості плазмоцитів і мастоцитів (у стані дегрануляції) [5, 12].

Для з'ясування ролі окисно-нітрозативного стресу в механізмах ушкодження під- нижньощелепних СЗ нами було досліджено закономірності утворення в них АФК/АФА. Введення алкоголю згідно з умовами експерименту вірогідно збільшувало генерацію у тканинах піднижньощелепних СЗ .О - (табл. 2) дихальним ланцюгом мітохондрій на 41,5%, мікросомальними монооксигеназами та NOS - на 34,0%, НАДФН-оксидазою лейкоцитів - на 34,5%.

Раніше було показано, що пов'язані з впливом алкоголю ушкодження мітохон- дрій, зокрема їх ДНК, посттрансляційні модифікації білків, а також індукція етанолом цитохрому Р450-2Е1 (CYP2E1) не тільки супроводжуються посиленням генерації АФК, але зростають при дії останніх

за принципом «замкнутого» кола [23, 24]. Водночас у виділених з крові хворих на алкогольну залежність лейкоцитах виявлялося порушення «дихального вибуху» внаслідок зниження активності НАДФН-оксидази, що автори пов'язують з прямою дією етанолу

[25] . Підвищення продукції .О - НАДФН- оксидазою фагоцитів може розглядатися як наслідок впливу прозапальних цитокінів (ІЛ-1, ІЛ-6, ІЛ-12, ФНП-а та хемокінів) у разі надмірного утворення АФК мітохондріями та ендоплазматичним ретикулумом, зокрема через активацію редоксчутливих транскрипційних чинників (NF-kB, AP-1 тощо) [16, 26].

При відтворенні СЗВ введенням ЛПС S. typhi генерація .О - у тканинах піднижнь- ощелепних СЗ підвищувалася при індукції дихального ланцюга мітохондрій на 46,6%, мікросомальних монооксигеназ та NOS - на 43,0%, НАДФН-оксидази лейкоцитів - на 34,5%, що є закономірним наслідком опосередкованих через TLR шляхів активації синтезу прозапальних цитокінів.

Таблиця 1. Показники системної запальної відповіді у сироватці крові щурів при окремому та поєднаному введенні алкоголю та ліпополісахариду S. typhi (M ± m)

Примітка: в табл. 1-5 *Р < 0,05 порівняно з контролем; **Р < 0,05 порівняно зі значенням групи з окремим введенням ліпополісахариду; ***Р < 0,05 порівняно зі значенням групи з окремим введенням алкоголю.

При введенні алкоголю на тлі ЛПС-ін- дукованої СЗВ продукція АФК у тканинах піднижньощелепних СЗ істотно вірогідно збільшувалася. При цьому вироблення .О - дихальним ланцюгом мітохондрій перевищувало відповідні результати груп з окремим введенням ЛПС та алкоголю - на 25,9 та 30,5%, мікросомальними монооксигеназами та NOS - на 19,0 та 27,1%, НАДФН-оксида- зою фагоцитів - на 29,5 та 30,0%.

Таблиця 2. Швидкість продукції супероксидного аніон-радикала різними джерелами у тканинах піднижньощелепних слинних залоз при окремому та поєднаному введенні алкоголю та ліпополісахариду S. typhi (M ± m)