Методы создания ортотопических моделей рака пищевода и их применение в доклинических исследованиях

Размещено на http://www.allbest.ru/

Методы создания ортотопических моделей рака пищевода и их применение в доклинических исследованиях

Кит О.И.1,

Колесников Е.Н.1,

Максимов А.Ю.1,

Протасова Т.П.1,

Гончарова А.С.1,

Лукбанова Е.А.1

'Федеральное государственное бюджетное учреждение "Ростовский научно-исследовательский онкологический институт" Министерства здравоохранения Российской Федерации, Ростов-на-Дону

Keywords: esophageal cancer, adenocarcinoma, squamous cell carcinoma, xenograft, orthotopic tumor models, immunodeficient mice, transplantation sites, preclinical studies ортотопический опухолевый онкология

В целом успехи в лечении рака пищевода признают незначительными, а прогноз - неблагоприятным [4]. В течение последних десятилетий наблюдается стойкая тенденция к ухудшению ситуации за счет снижения дифференцировки опухолей данной локализации и роста вовлеченности в злокачественный процесс регионарных лимфоузлов [5].

Вышесказанное определяет неоспоримую важность разработки новых и усовершенствования существующих методов профилактики и лечения злокачественных опухолей пищевода [6], а также изучения их патогенеза и биологии, в частности факторов, определяющих рост и прогрессию [7].

Для развития онкологии на современном этапе необходимо совершенствовать экспериментальную базу, и в решении этой задачи особая роль отводится доклиническим испытаниям на лабораторных животных [8, 9, 10]. В области исследований новых противоопухолевых препаратов перспективным является создание экспериментальных моделей - ксенографтов, которые представляют собой человеческий опухолевый материал, трансплантированный в организм животного. Такие модели более адекватно отражают особенности злокачественного процесса в донорском организме, что определяет целесообразность их использования в исследованиях на этапе доклинической разработки и тестирования новых фармакологических субстанций.

Целью работы стал обзор данных, связанных с созданием эктопических и ортотопических моделей наиболее часто встречающихся гистологических типов рака пищевода, а также пищевода Барретта - потенциального предшественника аденокарциномы, на лабораторных животных, особенностями моделирования метастазов и использованием получаемых объектов в доклинических исследованиях. Проанализированы отечественные и зарубежные литературные источники. Произведен поиск тематических статей в русскоязычных базах по следующим ключевым словам: рак пищевода, ортотопическая модель рака пищевода, ксеногенная опухолевая модель пищевода, ксенографт. В англоязычных базах проведен по запросам: xenograft, orthotopic tumor models, models of esophageal cancers, animal models of cancer.

Модели опухолей пищевода человека, полученные на животных

Основная цель разработки моделей ксенотрансплантатов опухолей заключается в том, чтобы объединить фундаментальные и клинические исследования и дополнить данные, полученные при использовании систем in vitro [11]. Получаемые на животных модели создают платформу для изучения процесса опухолевого генеза в условиях in vivo, которая позволит лучше понять участие некоторых онкогенов или опухолевых супрессоров в развитии опухоли, раскрыть их сигнальные пути и механизмы онкологических заболеваний

[12] . Также использование таких моделей может предоставить исследовательский инструмент для доклинического тестирования лекарственных средств: определения противоопухолевой эффективности препарата, его фармакокинетики и фармакодинамики

[13] . Кроме того, ксеногенные опухоли, полученные на различных анатомических сайтах лабораторных животных, могут служить экспериментальной базой для проверки эффективности существующих и разработки новых методов обнаружения, а также мониторинга роста и дифференцировки злокачественных новообразований.

Наиболее часто используемыми животными для получения опухолевых моделей являются лабораторные мыши из-за нескольких ключевых преимуществ, таких как: наличие сопоставимого с людьми размера генома, короткий репродуктивный цикл и многочисленное потомство, низкие затраты на содержание, простота их обслуживания и т.д. [12]. В интересующем нас исследовательском направлении используются различные линии иммунодефицитных мышей, к которым относятся атимичные| голые мыши nude (дефектны по Т-клеточному звену иммунитета), мыши SCID (имеют более тяжелую форму иммунодефицита) и мыши NOD/SCID (характеризуются сочетанием дефектов иммунной системы и нарушением обмена веществ) [8, 12, 13]. Среди этих линий мыши NOD/SCID демонстрируют более выраженный иммунодефицит, связанный с отсутствием или дефектом почти во всех типах иммунных клеток (В-, Т-, дендритные клетки, макрофаги и NK-клетки)

На сегодняшний день в современной экспериментальной онкологии наиболее часто исследовательские работы проводят на эктопических ксеногенных опухолях, в то время как ортотопические ксенографты используют достаточно редко. Эктопические модели получают в результате трансплантации человеческого опухолевого материала в сайты, не соответствующие донорскому органу, из которого злокачественные клетки были взяты. Наиболее распространенным вариантом эктопической ксенотрансплантации является введение опухолевого материала под кожу реципиента, что связано с его очевидными преимуществами: технической простотой процедуры и наблюдения за ростом полученной опухоли.

Несмотря на это, подкожная опухолевая модель имеет существенные недостатки, поскольку далеко не полностью отражает клиническую ситуацию. Например, она не обладает гетерогенностью донорской опухоли, так как в большинстве случаев в качестве исходного материала используются линейные злокачественные клетки. Кроме того, подкожные ксенографты, полученные из опухолевого материала эктопических сайтов, находятся в нетипичном для них микроокружении, что делает их непригодными для изучения опухоле-стромальных взаимодействий, а также практически не способными к инвазии и метастазированию. При таких сильных и слабых сторонах эти модели в основном пригодны для изучения ранних этапов злокачественного процесса, механизмов канцерогенеза и биологии опухоли [15].

К эктопическим вариантам ксенотрансплантации также можно отнести введение клеточной суспензии человеческой плоскоклеточной карциномы пищевода мышам Balb/c Nude внутривенно и в левый желудочек сердца (как вариант внутриартериального введения). В отличие от подкожного и даже ортотопического вариантов трансплантации опухолевого материала, в данном исследовании эти модели дали активное метастазирование в органы-мишени, характерные для этой формы рака [16].

Методы создания ортотопических моделей рака пищевода

Ортотопические ксенотрансплантаты представляют собой альтернативу эктопическим моделям, используемым для исследований рака пищевода. Их получают путем имплантации клеточной суспензии или фрагмента опухоли в пищевод животных-реципиентов.

В результате анализа литературных данных, посвященных методам создания ортотопических моделей основных форм злокачественных опухолей пищевода, были выявлены некоторые трудности и особенности, связанные с достижением поставленных задач.

Процедуры их создания технически сложны, поскольку для этого требуются хирургическое вмешательство и анестезия животных. Отмечают особую трудность выполнения манипуляций по ортотопической ксенотрансплантации опухолей пищевода, которая связана с особенностями расположения и малыми размерами этого органа [17]. Тем не менее достигнуты определенные успехи в создании ортотопических моделей рака пищевода, в том числе путем моделирования пищевода Барретта [7, 18].

В работе Melsens Н. et al. описано пять вариантов хирургического эзофагеального доступа: средняя лапаротомия, средняя лапаротомия с трансжелудочным подходом, подреберная лапаротомия, трансоральный и шейный доступ [17]. Несмотря на относительно большое количество доступов к пищеводу и способов установки ортотопического ксенографта, наиболее часто применяются две основные методики, отличающиеся местом имплантации опухолевого материала: 1) в верхней части пищевода, тансорально [19]; 2) в нижней его части - вблизи гастроэзофагеального перехода, через желудок [16]. Оценка выживаемости мышей с ортотопическими опухолями в верхней и нижней частях пищевода показала, что последние жили дольше [10]. Также Ip J.C.Y. et al. на мышах Balb/cAnN-nu была разработана модель, полученная путем инъекции суспензии клеточной культуры в стенку среднего отдела пищевода, вблизи диафрагмы. Авторы заявляют о ее преимуществе по сравнению с ранее разработанными ортотопическими моделями плоскоклеточного рака пищевода [20].

Инокуляции суспензией опухолевых клеток со средой, по мнению ряда авторов [8, 17], дают лучшие результаты, чем SOI (surgery orthotopic implantation) - хирургическая имплантация фрагментов опухолевого материала в стенку пищевода [16]. Показано также, что улучшает приживаемость трансплантатов применение различного рода подложек и гидрогелей, например Matrigel [17, 21]. Последний представляет собой сложную смесь белков, протеогликанов и факторов роста межклеточного матрикса, которая обеспечивает клетки питанием и стимулирует их рост.

Существенными недостатками ортотопической модели рака пищевода являются медленный рост ксенотрансплантата [8, 17, 21], а также необходимость применения специализированных методов визуализации in vivo для мониторинга роста опухоли [22, 23].

Хотя создание ортотопических моделей требует больше времени, материальных и трудозатрат, они позволяют осуществлять исследование роста опухоли в адекватном гистологическом и молекулярном микроокружении, приближенном к клинической ситуации, и учитывать опухоле-стромальные взаимодействия [15]. Ксенотрансплантаты на основе полученного от пациентов опухолевого материала наиболее полно отражают иммуногистохимические и биохимические аспекты опухолевой болезни организма-донора по сравнению с подкожными ксенографтами, полученными в результате перевивки культуры клеток рака пищевода [21]. Несмотря на существующие трудности, связанные с созданием ортотопических ксенотрансплантатов, имеющиеся преимущества в виде способности к инвазии и метастазированию делают их ценной моделью для исследований поздних стадий опухолевого роста [24].

Основные характеристики и особенности методик по созданию подкожных и ортотопических ксеногенных моделей опухолей пищевода человека с использованием иммунодефицитных животных представлены в таблице.

Основные характеристики методов создания ксеногенных моделей опухоли пищевода человека с использованием иммунодефицитных животных

Примечания: п/к - подкожная имплантация; о/т - ортотопическая имплантация

Использование ортотопических моделей рака пищевода в доклинических исследованиях (ДКИ)