Определение размеров частиц в биомедицине лазерными методами

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Министерство образования и науки Российской Федерации

НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ

ТОМСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ (НИ ТГУ)

Физический Факультет

Кафедра оптики и спектроскопии (ОиС)

Реферат

по дисциплине «Биомедицинские лазерные технологии»

Тема: Определение размеров частиц в биомедицине лазерными методами

Проверил:

Томск, 2020

Оглавление

• лазерный дифракция лекарственный анализатор
• Введение
• 1. Метод лазерной дифракции
• 2. Теории дифракции Ми и Фраунгофера
• 3. Дифракция Фраунгофера
• 4. Теория Ми
• 5. Типичная схема лазерного дифракционного анализатора и основные функции каждого элемента
• 6. Области применения в медицине
• 7. Контроль качества лекарственных препаратов
• 8. Определение размеров эритроцитов
• 9. Оценка диспергирования пищевого комка в зависимости от микрорельефа окклюзионной поверхности зубов
• Заключение
• Список литературы


Введение

Тема данной работы - применение лазерных методов определения размеров частиц в биомедицине.

Анализ литературы показал, что в настоящее время для определения размеров частиц в медицине наиболее широко используется метод лазерной дифракции.

Метод в целом получает все наибольшее распространение, так как является универсальным и эффективным, с возможностью применения к широкому кругу объектов из самых различных областей исследования.

Исходя их этого, в данной работе будет описан метод лазерной дифракции, его основы и применение на практике в разных областях медицины.

1. Метод лазерной дифракции

Метод лазерной дифракции позволяет на основании применимой модели светорассеяния получить информацию о распределении частиц по размеру путем измерения интенсивности светорассеяния и определения ее зависимости от угла рассеяния, длины волны и поляризации света. Это абсолютный метод, не требующий калибровки. Лазерная дифракция обладает рядом преимуществ, включая простоту и быстроту измерений, высокую воспроизводимость и широкий динамический диапазон размеров, охватывающий почти пять порядков величины: от нанометров до миллиметров.

За последние два десятилетия лазерная дифракция заменила традиционные методы определения размера частиц: гель-фильтрацию и седиментацию в случае, если размер частиц меньше нескольких миллиметров, оптическую и электронную микроскопию в случае, если размер частиц больше 50 мкм.

Первоначально оценка размеров частиц методом лазерной дифракции имела ограничения из-за применения теории дифракции Фраунгофера. Современные лазерные дифракционные анализаторы выходят за рамки простых дифракционных эффектов. Основные принципы метода в настоящее время базируются на теории Ми и измерении интенсивности светорассеяния в широком угловом диапазоне. Кроме того, в случае частиц субмикронных размеров для получения дополнительной информации помимо лазеров зачастую используют нелазерные источники света.

2. Теории дифракции Ми и Фраунгофера

Рассматривая только видимую часть электромагнитного спектра, взаимодействие света и материи порождает четыре неразрывно связанных явления рассеяния. Мы различаем эти явления по словам «дифракция», «преломление», «отражение» и «поглощение». Используя определение в одном предложении для каждого из вышеперечисленных явлений, мы можем определить дифракцию как изгиб света краями объекта; преломление изменений, которые происходят, когда свет пересекает границу между объектом и окружающей его средой; отражение - как возврат света с поверхности объекта; и поглощение света затуханием объектом. На рисунке 1 изображены три явления рассеяния света, обычно используемые при анализе размера частиц (отражение опущено - почти для всех мелкодисперсных материалов любой эффект отражения пренебрежимо мал).

Рисунок 1: Рассеяние сферической частицы

Случаи таких (казалось бы, явных) явлений рассеяния не редкость в повседневной жизни. Например, изображение в зеркале создается отражением света. Поглощение - это то, что заставляет чувствовать себя теплее в одежде темного цвета при солнечном свете, чем в одежде белого или пастельного цвета. Очевидный изгиб карандаша, наполовину погруженного в стакан воды, иллюстрирует один эффект преломления. Наше понимание преломления также помогает нам в создании корректирующих линз. Примеры дифракции встречаются реже, но знакомую демонстрацию во многих классах физики можно легко воссоздать с помощью лазера и листа бумаги, в котором было вырезано небольшое отверстие. В этом эксперименте свет «сгибается» (дифракционируется) по краям проема, создавая регулярный, чередующийся рисунок света и тени на стене или экране на некотором расстоянии друг от друга. На рисунке 2 изображена картина рассеяния, производимого сферой.

Рисунок 2. Схема рассеяния сферической частицы

3. Дифракция Фраунгофера

Математическое описание дифракции было разработано в начале 1800-х годов Йозефом фон Фраунгофером. На заданной длине волны теория Фраунгофера предсказывает угловое расположение максимумов и минимумов рассеяния как функцию от размера объекта.

Хотя теория Фраунгофера объясняет, как создаются эти закономерности света и тени, дифракция света - это явление, возникающее в результате взаимодействия света и объекта, который по существу является двумерным, например, диска или отверстия в листе ткани. Взаимодействие света и трехмерного объекта, например, частицы, приводит к рассеянию, которое является не просто продуктом дифракции, но возникает также в результате преломления и поглощения света. В этом смысле теория Фраунгофера является лишь приближением к полному решению проблемы рассеяния света любым «реальным» объектом, и поэтому ее применение при определении размеров частиц по своей природе ограничено теми случаями, когда: а) размер частицы велик по отношению к длине волны, б) угол наблюдения мал, в) частицы непрозрачны.

Для частиц, больших по отношению к длине волны, приближения Фраунгофера к полной теории Ми функционально эквивалентны. Однако, по мере приближения диаметра частицы к длине волны эффекты преломления и поглощения все больше влияют на картину рассеяния. Уравнение Фраунгофера о дифракции света круговым объектом описывает относительную интенсивность рассеянного света исключительно с точки зрения длины волны, угла и диаметра частицы (этот диаметр является расстоянием между краями объекта). Описание взаимодействия света и трехмерного объекта должно учитывать свойства материала объекта, например, его показатель преломления.

4. Теория Ми

Лишь после того, как Джеймс Клерк Максвелл установил уравнения, устанавливающие фундаментальную связь между электричеством и магнетизмом, стала возможной полная и строгая теория рассеяния света. Сегодня эта теория широко известна как Теория Ми, названная по трактату 1908 года физиком Густавом Ми. Теория предсказывает относительную интенсивность рассеянного света как функцию размера частицы, угла наблюдения, длины волны и поляризации падающего луча. Это при условии, что частица является гладкой, сферической, внутренне (оптически) однородной и имеет известный показатель преломления. Теория Ми обязательно включает теорию Фраунгофера, поскольку она описывает не только эффекты дифракции, но и способна моделировать рассеяние, возникающее в результате преломления, отражения и поглощения света (явления, которые возникают только в результате взаимодействия света и трехмерного объекта). Возвращаясь к рисунку 1, следует отметить, что рассеяние света маленькой частицей создается не только дифракцией, но и преломлением и поглощением.

Однако, несмотря на то, что теория Ми была получена почти сто лет назад, ее применение в разрешении сферического гранулометрического распределения частиц посредством измерения угловой картины лазерного рассеяния было непрактичным из-за ее математической сложности. Например, для расчета матрицы рассеяния размером 100x100, т.е. ста детекторов с сотней размерных бункеров, в начале 1990-х годов потребовался почти час с помощью компьютера IBM совместимого с 386. В те времена, когда вычислительная мощность была недостаточной, можно было использовать только приближение Фраунгофера. В настоящее время при мощности компьютера Pentium одна и та же матрица 100x100 может быть вычислена за доли секунды, и в реальном времени возможно вычислить распределение частиц по размерам из измеренной интенсивности рассеяния. Поэтому, за исключением случаев, когда показатель преломления пробы неизвестен, в технологии лазерной дифракции нет необходимости использовать аппроксимацию Фраунгофера. Особенно для частиц размером менее ~25 мкм, использование аппроксимации Фраунгофера приведет к большой и неожиданной ошибке в найденном размере частиц. Однако, по вышеуказанной исторической причине и по причине, не путающей эту технологию с другой технологией статического рассеяния света, которая применяется главным образом для измерения молекулярной массы макромолекул, эта технология до сих пор называется лазерной дифракцией во всей промышленности.

5. Типичная схема лазерного дифракционного анализатора и основные функции каждого элемента

Процесс анализа начинается с того, что источник света испускает луч монохроматического света. Пройдя через несколько оптических компонентов, исходный луч превращается в толстый коллимированный пучок. Этот световой пучок направляется на частицы и рассеивается ими в так называемом рассеивающем объеме. Генерируемые при этом уникальные паттерны углового светорассеяния регистрирует многоэлементная фотодетекторная матрица. Возникающие в матрице фототоки оцифровываются и анализируются с построением диаграммы интенсивностей и оценкой распределения частиц по размерам.

Некоторые промышленные частицы не сферичны, но эффекты рассеяния на их углах и краях сглаживаются из-за вращения, происходящего благодаря циркуляции пробы во время измерения. Это позволяет применять как теорию Ми, так и теорию Фраунгофера к системам с одним параметром - диаметром. Важно понимать, что такой подход позволяет только примерно оценить размеры частиц и что результаты, получаемые большинством методов (включая лазерную дифракцию) могут сильно отличаться от реальных характеристик. Пока что в современных коммерческих инструментах для определения размеров частиц в широком спектре образцов используется только сферическая модель независимо от настоящей формы частиц.

Рисунок 3. Типичная схема лазерного дифракционного анализатора

6. Области применения в медицине

лазерный дифракция лекарственный анализатор

Метод имеет достаточно широкую сферу применения в медицине:

Фармацевтическая область, где метод применяется для анализа суспензий, эмульсий и порошкообразных материалов. Применение здесь в первую очередь связано с технологическим контролем производства и позволяет в значительной степени автоматизировать его;

Медико-биологическая область применения, где данный метод используется в различных лабораторных исследованиях, например, для глубокого анализа крови.

К тому же, в ходе анализа литературы обнаружено, что метод использовался в стоматологии с целью определения диспергирования пищевого комка в зависимости от микрорельефа зубной поверхности.

Применение метода лазерной дифракции в этих сферах будет рассмотрено далее по порядку.

7. Контроль качества лекарственных препаратов

Метод лазерной дифракции прекрасно зарекомендовал себя для определения размеров частиц и уже сейчас имеются ГОСТы для его применения в фармакологии [2]. Далее, рассмотрим метод, опираясь на официальный ГОСТ, который наиболее детально отражает специфику работы в данном направлении.

Традиционно метод позволяет измерять частицы в диапазоне от 0,1 мкм до 3,0 мм. Современные достижения в приборостроении позволили расширить этот диапазон (от 0,1 мкм до 8,0 мм).

Метод предназначен для контроля качества лекарственных препаратов (порошки, суспензии, эмульсии, пасты, настойки и др.) по показателю «Размер частиц и их распределение». Метод позволяет также определять, а затем и нормировать размер частиц и их распределение в субстанциях.

Оборудование

Взаимодействие луча падающего света и частиц дисперсной фазы приводит к образованию профиля рассеяния света с разными значениями интенсивности света при различных углах. Общее распределение угловой интенсивности, состоящее из прямого и рассеянного света, фокусируется линзой на многоэлементном детекторе. Линза создает профиль рассеяния света, который не зависит от расположения частиц в световом луче.

Схема прибора для определения размера частиц методом лазерной дифракции

1 - источник лазерного излучения, 2 - модуль обработки лазерного излучения, 3 - частицы, 4 - рассеянный свет, не собранный линзой (6), 5 - рабочее расстояние линзы (6), 6 - линза Фурье, 7 - прямой луч, 8 - фокусное расстояние линзы (6), 9 - рассеянный луч, 10 - детектор затемнения, 11 - многоэлементный детектор

Рисунок 4. Схема прибора для определения размера частиц методом лазерной дифракции

Пробоподготовка

Методика пробоподготовки должна обеспечивать получение репрезентативного образца требуемого объема для измерения размера частиц.

Спреи, аэрозоли и пузырьки газа в жидкости измеряются непосредственно, поскольку пробоподготовка или разведение могут изменить распределение частиц по размеру.

Сыпучие порошки также можно преобразовать в аэрозоли при помощи диспергаторов, использующих энергию сжатого газа или перепады давления. Полученный аэрозоль проходит через зону измерения, после чего попадает во впускное отверстие вакуумного блока, где частицы аэрозоля собираются.

В качестве дисперсионной среды могут быть использованы вода и различные органические растворители (этиловый спирт, метиловый спирт, изопропиловый спирт, гексан, ацетон, толуол и другие), что должно быть отражено в фармакопейной статье.

Определение диапазона концентраций

Для того чтобы получить приемлемое соотношение «сигнал - шум» в детекторе, концентрация частиц в дисперсии должна превышать минимальный уровень. Также она должна быть меньше максимального уровня для избежания многократного рассеяния.

На диапазон концентраций влияют: ширина лазерного луча, расстояние, проходимое лучом лазера в зоне измерения, оптические свойства частиц и чувствительность элементов детектора. Измерения необходимо проводить при различных концентрациях частиц для определения оптимального диапазона концентраций для каждого характерного образца материала.

Принцип метода

Образец, диспергированный в жидкости или газе с необходимой концентрацией, подвергается воздействию лазерного облучения. Свет, рассеянный от частиц на различных углах, измеряется многоэлементным детектором. Численные значения, представляющие профиль рассеяния света, регистрируются для последующего анализа. В дальнейшем эти значения математически преобразуются с помощью оптической модели в доли от общего объема отдельных размерных классов, формируя, таким образом, объемное распределение частиц по размеру.

Метод не может отличить рассеяние от отдельных частиц и рассеяние от кластеров частиц, т.е. агломератов или агрегатов. В случае если образцы содержат агломераты или агрегаты частиц, и если необходимо определить распределение отдельных частиц по размеру, то перед измерением кластеры диспергируют на отдельные частицы. Для несферических частиц получают соответствующее распределение эквивалентных сфер по размеру, поскольку метод предполагает использование сферических частиц в своей оптической модели. Полученное распределение частиц по размеру может отличаться от распределений, основанных на других физических принципах (например, седиментации или ситовом определении).

Методика

Измерение размеров частиц осуществляют на малоугловых измерителях дисперсности (например, на приборе типа МИД-5) в соответствии с руководством по эксплуатации прибора и инструкцией пользователя.

После соответствующей регулировки оптической части прибора проводят фоновое измерение среды, в которой отсутствуют дисперсные частицы. Уровень сигнала фона должен быть ниже соответствующего порогового значения. После фонового измерения проводят измерение пробы. Обычно при измерении проводится большое число регистраций сигнала на элементах детектора и определяется среднее значение для каждого элемента. Положение и размер элементов детектора, фокусное расстояние линзы определяют диапазон углов рассеяния для каждого элемента.

Большинство приборов также измеряют интенсивность центрального луча. Различие интенсивностей центрального луча в дисперсной системе и фонового измерения является параметром затемнения и свидетельствует об интенсивности рассеянного света и концентрации частиц.

Специфические условия проведения анализа по измерению размера частиц и их распределению в конкретных лекарственных средствах указывают в фармакопейных статьях.

Результаты измерений

Результаты обычно представляют в виде интегрального объемного распределения частиц по размеру (рис. 5). Величины xm отражают размер частиц, где m - доля частиц с размером x и менее. Для оценки распределения по размеру обычно используют значения x10, x50 и x90.

x - размер частиц, определяемый как диаметр объема эквивалентной сферы; Q3 (x) - объемная доля частиц с размером x и менее; x10, x50, x90 - размер частиц, соответствующий объемной доле 10, 50 и 90% соответственно

Рисунок 5. Интегральное объемное распределение частиц по размеру

8. Определение размеров эритроцитов

В лабораторных анализах крови преобладают исследования свойств эритроцитов.

Основное исследуемое свойство - деформабильность эритроцитов, определяющая эффективность газообмена и способность движения в микрососудах. При ряде патологических состояний деформационная лабильность эритроцитов существенно ухудшается. В современных технологиях с помощью кровотока осуществляется транспортировка наноструктурированных частиц к различным органам. Этот процесс требует оперативного контроля деформабильности эритроцитов

Не менее важной проблемой биофизики и медицины является исследование действия токсинов на наноструктуру мембран клеток крови. Главными показателями качества крови признаны морфология и структура мембран эритроцитов. В этой связи актуальной задачей представляется анализ дефектов мембран при действии токсинов.

Метод лазерной дифракции также прекрасно зарекомендовал себя в решении этих задач. Как было описано выше, он имеет преимуществ перед другими методами, что позволяет его использовать для глубокого анализа крови достаточно экспрессно и с высокой точностью.

Наиболее ярко и наглядно применение метода лезерной дифракции для анализа крови описано в работе [4].

Принцип метода описан в первой главе реферата, а также в предыдущем разделе, поэтому здесь мы рассмотрим тонкости работы с образцами крови и возможности применения метода на практике.

Суть методики

Вблизи стенки сосуда эритроцит движется в потоке с градиентом скорости, он деформируется и, вращаясь, движется как гусеница танка. Эритроциты хаотически распределены в потоке, но все эритроциты своей узкой стороной движутся вдоль сосуда. Просвечивая слой суспензии эритроцитов излучением лазера можно наблюдать стационарные дифракционные картины в виде эллипсов. Анализ изменения дифракционных картин позволяет судить деформационной лабильности эритроцитов.

Подготовка образца крови.

Работают также с суспензией эритроцитов. Пробы крови стабилизирутся 0,3% раствором цитрата натрия. Далее, пробы крови объемом 0,1 мл помещаются в 10 мл 0,9% растворителя хлорида натрия для приготовления лекарственных форм для инъекций. Уже здесь мы можем отметить просто пробоподготовки материала.

Рисунок 6. Подготовленный для анализа образец крови

Рисунок 7. Экспериментальная установка

Рисунок 8. Схема исследования эритроцитов методом лазерной дифракции

В работе было показано, что применение метода лазерной дифракции отличается простотой и удобством использования для исследования клеток крови. Зафиксированный интервал изменения индекса деформируемости эритроцитов от 0,06 до 0,35 и погрешность измерений (2 - 3%) согласуются с опубликованными результатами в литературе.

9. Оценка диспергирования пищевого комка в зависимости от микрорельефа окклюзионной поверхности зубов

В работе [5] показано, что использование метода лазерной дифракции позволяет достоверно установить влияние микрорельефа окклюзионной поверхности зубов на степень диспергирования твердых частиц в пищевом комке.

На поверхностях каждого зуба располагается огромное количество бугорков, углублений, формирующих его микроархитектонику, что обеспечивает необходимый процесс помола пищи и создания пищевого комка. Недостаточное измельчение твердых частиц пищевого комка в полости рта приводит к дисфункции пищеварительной системы. Использование метода лазерной дифракции позволяет достоверно установить влияние микрорельефа окклюзионной поверхности зубов на степень диспергирования твердых частиц в пищевом комке. Как указывалось в предыдущем разделе, метод достаточно подробно описан выше, и в данном разделе мы остановимся на методической части выполнения работ. Материал для исследования также переводили в суспензию.\

Подготовка суспензии с образцом для проведения измерений

Для приготовления суспензии в кювету, содержащую 15 см³ дистиллированной воды, добавляли исследуемый образец, затем суспензию диспергировали в течение 5 сек. с использованием ультразвукового диспергатора.

Проведение измерений

Для исключения влияния оптических свойств дисперсионной среды на светорассеяние частиц и соответственно на расчет распределения их по размерам сначала проводилось измерение величины интенсивности фона («холостое измерение») на дистиллированной воде. Затем приготовленную суспензию исследуемого образца жевательной пробы объёмом от 0,1 до 5 мл мерной пипеткой переносили в кювету с жидкостью. Концентрация исследуемой жидкой среды была подобрана оптимально, если световая интенсивность находилась в пределах 35 - 75?% от размера измерительной шкалы прибора. Для предотвращения коагуляции частиц в исследуемой жидкой среде использовался миксер, входящий в комплект прибора.

Для объективного анализа формы и размеров конгломератов частиц ореха до и после герметизации восьми моляров проводилось исследование с использованием сканирующего электронного микроскопа (СЭМ).

Результаты показали хорошую сходимость и подтвердили возможность использования метода лазерной дифрации для исследования диспергирования твердых частиц в пищевом комке.

Заключение

Таким образом, в работе показано, что лазерная дифракция - широко применяемая технология анализа размеров частиц в медицине в настоящее время, подходящая для материалов, размер частиц которых составляет от сотен нанометров до нескольких миллиметров.

Главными причинами ее успеха являются:

· Широкий динамический диапазон: начиная от размера меньше микрона и заканчивая несколькими миллиметрами;

· Быстрые измерения: получение результатов;

· Высокая повторяемость - за счёт анализа большого количества частиц в каждом измерении;

· Непрерывный контроль и управление процессом диспергирования частиц;

· Высокая производительность;

· Отсутствие необходимости калибровки;

· Общепризнанная технология, требования к которой определяет стандарт ISO13320 (2009).

Один из недостатков метода лазерной дифракции заключается в том, что он не учитывает форму частиц анализируемых материалов. Все расчеты основываются на предположении, что частицы имеют сферическую форму. Поэтому распределение частиц по размеру, получаемое в результате анализа, на самом деле является распределением эквивалентных сферических частиц. Но в представленных случаях этого вполне достаточно.

Список литературы

1. https://www.mybeckman.ru/resources/technologies/laser-diffraction

2. МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ Определение распределения частиц по размеру методом лазерной дифракции света ОФС.1.2.1.0008.15 (Лазерная дифракция, малоугловое светорассеяние, расчет по теории Ми ГОСТ Р 8.777-2011 ГСИ. Дисперсный состав аэрозолей и взвесей. Определение размеров частиц по дифракции лазерного излучения ISO 13320-1:1999 Particle size analysis - Laser diffraction methods - Part 1: General principles)

3. Франк Г.М., Лемажихин Б.К. Определение размеров эритроцитов методом дифракции света. // Труды института биологической физики. - 1955, вып. 1, с. 276

4. Вохминцев А.П. и др. Деформируемость эритроцитов и способы ее клинической диагностики. // Современные наукоемкие технологии. -2004, №3. С. 54.

5. Михайловский С.Г., Ломиашвили Л.М., Седельников В.В., Дроздов В.А., Тренихин М.В. Использование метода лазерной дифракции для оценки диспергирования пищевого комка в зависимости от микрорельефа окклюзионной поверхности зубов // Проблемы стоматологии 2017, т. 13, №2, стр. 8-14 2017, Екатеринбург, УГМУ

Размещено на Allbest.ru