Распределение экзосом, содержащих CD82, MMP9, в паренхиме и межклеточном веществе при раке толстой кишки

Размещено на http://www.allbest.ru/

Распределение экзосом, содержащих CD82, MMP9, в паренхиме и межклеточном веществе при раке толстой кишки

Мозеров С.А.1,2,

Малютина М.Д.2,

Комин Ю.А.2,

Пашкин С.Б.3,

Мозерова Е.С.2,

Ширяева А.И.4

1Медицинский радиологический научный центр им. А.Ф. Цыба - филиал федерального государственного бюджетного учреждения "Национальный медицинский исследовательский радиологический центр" Министерства здравоохранения Российской Федерации, Обнинск;

2НИЯУМИФИ Обнинский институт атомной энергетики (ИАТЭ), Обнинск

3Российский государственный педагогический университет им. А.И. Герцена, Санкт-Петербург;

4 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский испытательный институт военной медицины" Министерства обороны Российской Федерации, Санкт- Петербург

В основе исследования лежит идея распознавания антигенов онкосом на основании иммунного окрашивания с целью прогнозирования развития метастазов и рецидива злокачественных новообразований. Идея основана на знаниях о генетических свойствах эукариотических клеток образовывать микровезикулы для обеспечения межклеточной коммуникации, механизмы которой были раскрыты в 2013 г. Ротманом, Шекманом и Зюдофом, также доказавшим комплементарность антигенов мембран экзосом и клеток-мишеней. Целью исследования было определение метастатического потенциала рака толстой кишки на основании анализа иммуногистохимического окрашивания антигенов онкосом (CD82, MMP9) в парафиновых срезах. Было проведено обследование 10 парафиновых блоков пациентов, больных инвазивным раком толстой кишки T1-3 N0-4 M0-1, из архива базы МРНЦ им. А.Ф. Цыба - филиала ФГБУ "НМИРЦ" Минздрава России: 5 пациентов с инвазивным раком толстой кишки без развития метастазов в течение двух лет после комбинированного лечения, 5 пациентов с инвазивным раком толстой кишки с развитием метастазов в течение двух лет после комбинированного лечения. Для иммунного окрашивания использовались распространенные в практике патологоанатомического отделения антитела CD 82, MMP 9. Было проведено выявление корреляционных взаимосвязей между количеством окрашенных онкосом и клиническими признаками. Выявлено, что по интенсивности и локализации иммунного окрашивания онкосом можно определить метастатический потенциал опухоли и риск возникновения рецидива у пациента.

Ключевые слова: рак толстой кишки, иммуногистохимия, метастазы, рецидив, онкосома, лечение.

Мохєгоу S.A.1,2, Malyutina M.D.2, Komin Yu.A.2, Pashkin S.B.3, Mozerova E.S.2, Shiriaeva A.I.4

`A. Tsyb Medical Radiological Research Centre - branch of the National Medical Research Radiological Centre of the Ministry of Health of the Russian Federation, Obninsk;

2Obninsk Institute for Nuclear Power Engineering, Obninsk

3Herzen State Pedagogical University of Russia, Saint-Petersburg;

4Federal state budgetary institution "State research and testing Institute of military medicine" of the Ministry of defense of the Russian Federation, Saint-Petersburg иммунный антиген злокачественный

The research is based on the idea of recognition of antigens by oncosomes on the basis of immune staining, in order to predict the development of metastases and recurrence of malignant neoplasms. The idea is based on knowledge about the genetic properties of eukaryotic cells to form microvesicles to provide intercellular communication, the mechanisms of which were discovered in 2013 by Rotman, Shekman and Sudof, who also proved the complementarity of antigens of exosome membranes and target cells. The aim of the study was to determine the metastatic potential of colon cancer based on the analysis of immunohistochemical staining of oncosome antigens (CD82, MMP9) in paraffin sections. 10 paraffin blocks of patients with invasive colon cancer T1-3 N0-4 M0-1 were examined from the archive of the mrnc database. A. F. Tsyba-branch of the Federal state budgetary institution "NMIRC" of the Ministry of health of Russia: 5 patients with invasive colon cancer without metastases within two years after combined treatment, 5 patients with invasive colon cancer with metastases within two years after combined treatment. For immune staining, CD 82 and MMP 9 antibodies, which are common in the practice of the pathology Department, were used. The correlation between the number of oncos stained and clinical signs was revealed. It was revealed that the intensity and localization of immune staining with oncosomes can determine the metastatic potential of the tumor and the risk of recurrence in the patient.

Keywords: colon cancer, immunohistochemistry, metastases, relapse, oncosome, treatment.

Рак дистальных отделов кишечника занимает одну из основных позиций в структуре заболеваемости, инвалидности и смертности населения от злокачественных новообразований в мире и в России. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) рак толстой кишки составляет 9% случаев онкологических заболеваний, а опухоли этой локализации занимают в мире 3-е место по заболеваемости и 4-e место по смертности среди злокачественных опухолей [1].

В последние годы дoстигнуты внушительные успехи в изучении молекулярной биoлoгии рака толстой кишки. Описаны основные механизмы и этапы развития опухоли, изучены стaдии кaнцeрoгенеза, продемонстрирована роль воспалительных изменений, различных молекулярных механизмов, а также отдельных молекул в возникновении рака. Имеющиеся данные служат источником для создания молекулярно-генетической классификации колоректального рака, выявления биомаркеров роста опухоли и поиска новых подходов к лечению [2].

За последнее время доказаны 4 основных механизма развития колоректального рака, среди которых выделяют: хрoмосoмную нeстaбильнoсть, микрoсaтeллитную нeстaбильность, "мєтиляторный" фeнoтип (CpG island methylator phenotype) и зубчaтый (англ. - serrated) путь развития. Каждый механизм имеет специфические алгоритмы прогресса злокачественной опухоли и линейку индивидуальных генетических и эпигенетических трансформаций [3].

Распространенным (до 90%) путем роста колоректального рака является хромoсомнaя нeстaбильнoсть: описываемый тип генетических изменений встречается в 80-90% случаев. Хромосомная нестабильность провоцирует развитие анеуплоидии и стабильных аберраций хромосом, что в результате приводит к неблагоприятным прогнозам. Доказано, что этот путь связан с мутациями гeнa-супрeссoрa oпухoлeвoгo рocтa APC (ген aдeнoмaтознoго пoлипoза толстой кишки). Кроме этого, хромосомная нестабильность связaнa с мутaциями других гeнoв - SMAD2 и SMAD4, принимающих участие в транспортировке импульса внутри клетки, трансформирующего ростового фактора-бета, и гена KRAS, бeлкoвый прoдукт кoторoго принимает участие в регулировании многих основных клеточных процессов: роста, гибели, ангиогенеза и метастазирования [3].

Следующим, не менее частым, путем развития злокачественного процесса является микрoсaтeллитнaя нeстaбильнoсть, определяемая в 20% случаев у больных раком толстой кишки в области печеночного изгиба и в 5% - в области селезеночного изгиба и прямой кишки. Возникновение микрoсaтeллитнoй нeстaбильнoсти связaнo c нарушением восстановления ДНК во время репликации за счет изменений в генах белка системы восстановления ошибок репликации (Mismatch repair system, MRS). В спорадичeских cлучaях колоректального рака дефицит систємы рeпарации ДНК вoзникaeт зa счёт снижения экспрессии генов системы MRS из-за гиперметилирования их промоторов [4]. Еще одним путем развития колоректального рака является так называемый метиляторный фенотип - тип эпигенетической нестабильности, возникающий за счет наличия гиперметилированных промотерных сайтов (CpG island). И тогда происходит снижение активности генов-супрессоров роста опухоли. В этой ситуации у больных нередко определяются мутации в генах KRAS, BRAF и ТР 53 [5].

Таким образом, в настоящее время без иммуногистохимических и молекулярногенетических исследований с целью диагностики, прогнозирования опухолей разных локализаций не обходится ни одна современная патоморфологическая лаборатория. Современная литература содержит огромный объем информации, посвященной диагностической иммуногистохимии. В нашей статье мы хотели бы обратить внимание морфологов на исследование ИГХ-позитивных мелких частиц (от 50 до 100 нм), которые не принимаются во внимание диагностами и расцениваются как фоновое окрашивание. В клинической практике онкосомы (экзосомы) выделяют различными путями: ультрацентрифугированием, методом эксклюзионной хроматографии, иммунноафинностью и осаждением с помощью химического реагента [6].

С целью выявления экзосом исследовались паренхиматозные элементы опухоли, просвет опухолевых желез, стромальные элементы вблизи и в периопухолевой ткани, а также свободнолежащие экзосомы в межклеточной среде.

Материалы и методы исследования

В исследование включен 21 пациент (10 мужчин и 11 женщин) с гистологически верифицированным диагнозом рака толстой кишки. Половозрастные характеристики: средний возраст пациентов составил 61 год.

Подготовка материала для иммуногистохимического исследования проводилась по стандартным протоколам.

Полученный материал подвергали фиксации 10%-ным нейтральным забуференным раствором формалина, впоследствии заливали в парафин. Для гистологического исследования готовили срезы толщиной 3-4 мкм, которые окрашивали гематоксилином и эозином. Иммуногистохимическое исследование проводилось из парафиновых срезов толщиной 3-4 микрона с антителами фирмы Novocastra (KAI-1/CD82, MMP-9) в соответствующем разведении для каждого антитела. Парафиновые срезы монтировались на стеклах, покрытых поли-Ь-лизином. Их подвергались депарафинизации в ксилоле (4 раза по 5 минут) и регидратации в спиртах нисходящей концентрации (100%, 96%, 70%) по 5 минут в каждом.

Для иммуногистохимического исследования блокирование эндогенной пероксидазы проводилось охлажденной 3%-ной перекисью водорода в течение 10 минут. С целью восстановления антигенной структуры клеток фиксированного в формалине и заключенного в парафин материала использовалось прогревание гистологических срезов в водяной бане в течение 20 минут в 0,01 М цитратном буферном растворе (рН 6.0). Инкубация с первичными антителами проводилась при комнатной температуре в течение 60 минут. Для визуализации продуктов иммунной реакции использована полимерная система EnVision (Dako), в качестве хромогенного субстрата применяется раствор диаминобензидина, ядра докрашены гематоксилином.

Результаты исследования и их обсуждение

MMP 9

Как известно, одним из ведущих факторов, определяющих инвазивные свойства опухоли, а также способность к метастазированию, являются матриксные металлопротеиназы, в том числе и MMP-9.

Матриксные металлопротеиназы (MMPs) - группа ферментов, основополагающей функцией которых является перестройка межклеточного вещества (ECM) [7]. MMP-9, известный и как желатиназа B, - один из сложнейших ферментов по своей структурной составляющей и регулированию своей выполняемой функциональной активности. Активность MMP-9 контролируется многоуровневыми процессами: 1) клеточные взаимодействия и регуляция транскрипции гена цитокинами; 2) регулирование активации профермента другими ферментами (сериновыми протеазами и другими MMP); 3) специфическая и неспецифическая ингибиторная регуляция. В регуляции также принимают участие хемотаксические факторы. Гликозилирование опосредованно влияет на функциональную активность желатиназы B.

Основной функцией MMP является деградация компонентов внеклеточного матрикса. MMP ассоциированы с патологическими состояниями, такими как ревматоидный артрит, болезнь коронарных сосудов и рак. MMP-9 способствует росту опухолевых клеток при метастазировании. Он играет важную роль в опухолевой инвазии и метастазировании, в ангиогенезе [8, 9, 10]. Показан повышенный уровень MMP-9 при колоректальном раке, остром лейкозе, злокачественных новообразованиях молочной железы, мочевого пузыря и меланоме. MMP-9 ассоциирован с метастазами в легких и инвазией глиомы [11].

Тканевой MMP-9 может служить независимым прогностическим маркером при колоректальном раке; количественное определение экспрессии MMP-9 может быть полезным в поиске пациентов, которые находятся в группе высокого риска развития рецидива заболевания. Иммуногистохимическая экспрессия MMP-9 достоверно положительно коррелирует с глубиной инвазии колоректального рака, метастазированием лимфатических узлов и отдаленным метастазированием. У пациентов с положительным окрашиванием MMP-9 значительно худшая выживаемость, чем у пациентов с отрицательным MMP-9 раком [Ошибка! Источник ссылки не найден.].

Собственное исследование показало, что распределение экзосом, содержащих MMP-9, выражено не только в паренхиматозных элементах опухоли, но и в просвете опухолевых желез, а также в большом количестве они обнаруживались в межклеточной среде (рис. 1). Однако не все опухоли имели положительную реакцию на ММР-9, что, возможно, говорит о более слабых инвазивных свойствах опухолевых клеток.

Рис. 1. Высокодифференцированная аденокарцинома, ММР-9, х 100.

Синие стрелки - цитоплазматическое окрашивание в клетках опухоли, красные стрелки - в просвете желез, черные - в строме CD 82

Фактор супрессии метастазов KAI-1/CD82 подавляет прогрессирование и метастазирование широкого спектра солидных злокачественных опухолей. Вездесуще экспрессированный CD82 сдерживает миграцию клеток и клеточную инвазию, модулируя как клеточную матрицу, так и адгезивность клеток и ограничивая внешнюю сигнализацию про-моторики. Это ограничение по крайней мере способствует, если не определяет, метастаз- супрессивную активность, а также, вероятно, физиологические функции CD82. Как модулятор гетерогенности клеточной мембраны CD82 изменяет микродомены, трафик и топографию мембраны, перестраивая молекулярный ландшафт мембраны. Функциональная активность мембранных молекул и цитоскелетное взаимодействие клеточной мембраны впоследствии изменяются, далее следуют изменения клеточных функций. Учитывая его патологическое и физиологическое значение, CD82 является перспективным кандидатом для клинического прогнозирования и блокирования прогрессии опухоли и метастазирования, а также новым модельным белком для механистического понимания организации и гетерогенности клеточных мембран [Ошибка! Источник ссылки не найден.].

Он взаимодействует с белками клеточной поверхности, включая интегрины, кадгерины, CD4, CD8, IGSF8. Модулирует сигнал EGFR. Может подавлять инвазию, ингибируя интегрин-зависимые перекрестные помехи с рецептором c-Met и Src-киназами. Его регулирование с-мет сигнализации, видимо, влияет на раковые клетки миграции.

Собственные данные говорят о том, что распределение экзосом, содержащих CD-82, в большей степени отмечается в цитоплазме паренхимазных элементов опухоли и в просвете опухолевых желез. Также положительную реакцию давали стромальные компоненты опухоли (рис. 2). Интересным фактом явилось неравномерное распределение окраски цитоплазмы опухолевых клеток - в одном случае положительная реакция наблюдалась по всей цитоплазме паренхиматозных элементов (рис. 2, красная фигурная скобка), в другом случае положительная реация отмечалась только вблизи люминальной поверхности цитоплазмы (рис. 3, черная фигурная скобка).

Рис. 2. Высокодифференцированная аденокарцинома, CD-82, х 400.

Синие стрелки - цитоплазматическое окрашивание в клетках опухоли,

Рис. 3. Высокодифференцированная аденокарцинома, CD-82, х 400.

Синие стрелки - цитоплазматическое окрашивание в клетках опухоли, красные стрелки - в просвете желез черные - в строме

Особенности распределения положительно реагирующих гранул в цитоплазме опухолевых клеток скорее всего говорят о злокачественном потенциале рака, т.е. определяют метастаз-супрессивную активность злокачественного новообразования.

Заключение