Роль апоптоза при оценке эффективности биологической стимуляции адгезиогенеза при хронической эмпиеме плевры

При оценке физиологического гомеостаза соединительной ткани большое значение имеют процессы клеточной пролиферации и апоптоз. Известно, что пролиферация является разрешающей стадией воспалительного процесса, обеспечивающей устранение очага экссудации. В свою очередь апоптоз является основным механизмом устранения клеток на разных стадиях заживления, а также препятствует чрезмерному фиброзу за счет устранения клеток воспалительного ряда, которые имеют стимулирующее воздействие на фибробласты через продукцию интерлейкинов [1; 2].

Известно, что транскрипционный фактор роста NF-kbp65 является одним из главных факторов регуляции клеточной пролиферации и апоптоза. При активации ядерного транскрипционногофакторапроисходитиндукцияпротивоапоптотическихмеханизмов с сохранением воспалительной реакции. Ингибирование апоптоза может привести к избыточному росту соединительной ткани при спайкообразовании за счет сохранения клеточной популяции в очаге воспаления [3; 4]. Таким образом, оценка экспрессии маркеров апоптоза и пролиферации играет большую роль в оценке эффективности применения биологических субстратов для стимуляции адгезиогенеза и устранения остаточной полости при эмпиеме плевры [5; 6].

Цель исследования: определить эффективность биологической стимуляции адгезиогенеза при хронической эмпиеме плевры при оценке иммуногистохимических маркеров апоптоза и клеточной пролиферации.

Материал и методы исследования

Экспериментальное исследование проведено на 450 нелинейных половозрелых крысах-самцах массой 180-210 г. Животные содержались в стандартных условиях вивария Пятигорского медико-фармацевтического института - филиала ФГБОУ ВО «ВолгГМУ» Минздрава России в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных». Протокол эксперимента составлен в соответствии с «Международными рекомендациями по проведению медикобиологических исследований с использованием животных» (1985), приказами МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 г. «Об утверждении правил лабораторной практики» и МЗ СССР № 755 от 12.08.1977 г., а также на основе принципов биоэтики и правил лабораторной практики (GLP). Использование экспериментальных животных признано необходимым, допускается и регламентируется ст. 25 и 26 «Европейской конвенции о защите позвоночных животных».

На первом этапе эксперимента была смоделирована хроническая эмпиема плевры с формированием остаточной плевральной полости путем введения 1 млрд взвеси E.coli в V межреберье по подмышечной линии в течение 28 дней [7]. На втором этапе животные были разделены на 5 экспериментальных групп по 90 особей в каждой с последующей стимуляцией адгезиогенеза различными биологическими субстратами. В I группе (негативный контроль) в плевральную полость вводили 1,0 мл физиологического раствора. Во II группе (позитивный контроль) для стимуляции адгезиогенеза вводили 1,0 мл 1%-ного раствора доксициклинавнутриплеврально. Животным III опытной группы вводили плазму, обогащенную тромбоцитами (набор для забора крови Plasmolifting™, ООО «Плазмолифтинг», г. Казань, Россия.ТУ 9437-002-27837594-2015, регистрационное удостоверение № РЗН 2016/3980 от 19.04.2016) [8; 9], в IV опытной группе применяли аутологичную жировую взвесь (липофилинг), в V опытной группе использовался метод сочетанного потенцирования адгезиогенеза путем введения плазмы, обогащенной тромбоцитами, и аутологичной жировой ткани [10].

Выведение животных осуществляли на 10, 20 и 30 сут. от начала второго этапа эксперимента по 30 особей каждой группы. Иммуногистохимическое исследование проводили непрямым пероксидазным методом. Реакцию проводили с использованием поликлональных кроличьих антител Anti-NF-kB p65 antibody (Abcam, Англия), Anti Caspase- 3 antibody (Abcam, Англия) и Anti-aktive Caspase-3 antibody (Abcam, Англия). Исследование микропрепаратов осуществляли с использованием микроскопа «LeicaDM100» (Leica Mikrosystems GmbH, Германия) с цифровой фотокамерой. Выраженность экспрессии оценивали с помощью программы LAS Version 4.2.7 с последующим морфометрическим исследованием степени экспрессии иммунопозитивного материала.

Статистическая обработка проведена общепринятыми для медико-биологического исследования методами с использованием программных пакетов Excel 7.0 (Microsoft, USA). Нормальность распределения полученных результатов проверяли с использованием критерия Колмогорова-Смирнова. После этого проводилась оценка достоверности данных, подчиняющихся нормальному распределению, с помощью параметрического t-критерия Стьюдента. Различия считали достоверными при p<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

В результате проведенных исследований установлено, что на 10-е сутки эксперимента в I группе (НК) и во II группе (ПК) происходит утолщение висцеральной плевры за счет миграции фибробластов и образования незрелой соединительной ткани. При иммуногистохимическом исследовании к каспазе-3 отмечались единичные иммунопозитивные клетки (5,69±0,8% и 5,52±0,4% соответственно, p<0,05). При оценке иммунореактивности тканей плевральной полости кактивной каспазе-3 было установлено, что ОД иммунопозитивных клеток была несколько выше, чем в случае использования каспазы-3 (НК -6,46±1,2%, ПК - 6,98±1,9%, p<0,05). При анализе результатов иммуногистохимического исследования с использованием антител к NF- kB достоверных отличий ОД иммунопозитивных клеток в группах контроля обнаружено не было: НК - 26,86±0,5% (p<0,05), в ПК - 25,15±1,2%.

При стимуляции адгезиогенеза в III опытной группе (PRP) иммунопозитивные клетки к каспазе-3 (6,39±1,9%, p<0,05) и активной каспазе-3 (7,83±0,5%, p<0,05) располагались со стороны висцеральной плевры, где в области прикрепления спайки находились коллагеновые и ретикулярные волокна незрелой соединительной ткани. Кроме этого, на данном сроке эксперимента происходило незначительное уменьшение экспрессии ядерного фактора NF-kB, что составило 28,72±0,8% (p<0,05). Такое изменение объясняется увеличением миграции фибробластов в очаг воспаления и началом формирования сосудов соединительной ткани.

В IV опытной группе процентное соотношение иммунопозитивных клеток к каспазе-3 и активной каспазе-3 было выше, чем в контрольных группах, и составило 6,39±1,9% и 9,49±2,9% соответственно (p<0,05). В то же время наблюдается экспрессия иммунопозитивных клеток к NF-kB- 33,01±1,4% (p<0,05), что объясняется сохранением лимфо-лейкоцитарного инфильтрата и образованием структурных компонентов спайки.

В Vопытной группе экспрессия иммунопозитивных клеток к каспазе-3 и активной каспазе-3 представлена единичными положительно окрашенными клетками на фоне снижения воспалительной реакции и формирования незрелой соединительной ткани, среди которой выявлялись жировые клетки, ОД которых была достоверно выше показателей в группе НК и ПК (9,51±2,7% и 10,47±1,2% соответственно, p<0,05).Единичные иммунопозитивные клетки к NF-kBрасполагались диффузно по всему полю зрения среди волокон соединительной ткани и составили 35,22±0,8% (p<0,05). Процентное содержание иммунопозитивных клеток к маркерам апоптоза и пролиферации при хронической эмпиеме плевры на 10-е сутки представлено на рисунке 1.

Рис. 1. Сравнительная характеристика экспрессии каспазы-3, активной каспазы-3 и NF-kbв экспериментальных группах при хронической эмпиеме плевры на 10-е сут., p<0,05

На 20-е сут. эксперимента в группе без лечения среди рыхло расположенных волокон наблюдалось наличие единичных иммунопозитивных клеток к каспазе-3 (7,01±1,8%) и активной каспазе-3 (8,63±0,5%), что свидетельствовало о нарушении процессов адгезиогенеза с преобладанием явлений экссудативного воспаления: отека, лимфоцитарной и нейтрофильной инфильтрации. Экспрессия NF-kB, напротив, была повышена (27,13±1,3%, p<0,05).

Во II группе на этом сроке процессы адгезиогенеза характеризовались увеличением числа коллагеновых волокон с преобладанием фибробластов в составе спаек, где определялись иммунопозитивные клетки к каспазе-3 (ОД - 11,01±1,1%) и к активной каспазе- 3 (ОД - 13,9±0,5%). Сохранение признаков воспалительной реакции, наряду с образованием волокон соединительной ткани фибробластами, сопровождалось экспрессией NF-kBс распределением иммунопозитивных клеток по всему полю зрения, что составило 23,38±0,3% (p<0,05).

В IIIопытной группе на этом сроке ОД иммунопозитивных клеток к каспазе-3 (10,38±0,9%, p<0,05) и активной каспазе-3 (11,78±0,8%, p<0,05) не имела достоверных отличий от показателей группы НК. На фоне незначительной экспрессии каспаз в соединительной ткани наблюдалось обилие иммунопозитивных клеток к NF-kB, которые располагались во всех структурных элементах спайки, где ОД составила 24,09±1,6% (p<0,05).

В IV опытной группе отмечалось увеличение ОД иммунопозитивных клеток к каспазе-3 до 23,22±3,1% (p<0,05) за счет структурной перестройки спайки, а также увеличение экспрессии активной каспазы-3 в 4,1 раза по сравнению с 10 сут. (39,72±2,9%, p<0,05), что объяснялось изменением клеточного каркаса спайки. При этом наблюдалось заметное снижение ОД иммунопозитивных клеток к NF-kB(12,76±1,1%), что подтверждает наличие апоптоза в спайках на этом сроке.

В Vопытной группе на этом сроке наблюдалось два основных компонента ткани, которые давали иммунопозитивное окрашивание: фибробласты и клетки воспалительного ряда. ОД иммунопозитивных клеток к каспазе-3 увеличилась в 5 раз, а к активной каспазе-3 в 5,5 раза по сравнению с группой НК, что составило 35,16±1,3% и 53,83±0,5% соответственно (p<0,05), что подтверждало процесс раннего созревания спайки в группе с сочетанным потенцированием адгезиогенеза. Параллельно с этим происходило снижение экспрессии NF- kBдо 11,37±1,5% (p<0,05) с расположением позитивных клеток среди волокон соединительной ткани.

На рисунке 2 представлена сравнительная характеристика показателей ОД иммунопозитивных клеток к каспазе-3, активной каспазе-3 и NF-kbв группах с хронической эмпиемой плевры на 20-е сут. эксперимента.

На 30-е сут. эксперимента в Iгруппе экспрессия каспазы-3 была незначительной с ОД 15,95±2,9% (p<0,05), в то время как по экспрессии активной каспазы-3 было установлено, что

ОД иммунопозитивных клеток была в 3,7 раза выше аналогичных показателей на 10-е сут. эксперимента и составила 21,43±1,8% (p<0,05). При этом определялась экспрессия NF-kB(16,24±1,6%, p<0,05), что свидетельствовало о недостаточности апоптотических факторов и сохранении воспаления.

Рис. 2. Сравнительная характеристика экспрессии каспазы-3, активной каспазы-3 и NF-kbв экспериментальных группах при хронической эмпиеме плевры на 20-е сут., p<0,05

Во II группе ОД иммунопозитивных клеток к каспазе-3 составила 19,57±2,5% (p<0,05). При этом ОД иммунопозитивных клеток кактивной каспазе-3 была несколько выше и составила 37,74±0,5% (p<0,05), что было в 1,5 раза выше аналогичных показателей группы НК. Параллельно с этим отмечалось снижение экспрессии NF-kB, процентное содержание которого было значительно ниже, чем на 10-е и 20-е сут., и составляло 15,02±1,4% (p<0,05). апоптоз иммуногистохимический клеточная пролиферация

В IIIопытной группе на 30-е сут. эксперимента отмечалось наиболее высокое количество иммунопозитивных клеток к каспазе-3, где ОД была 23,69±1,1% (p<0,05), по сравнению с другими сроками эксперимента этой же экспериментальной модели. Как и ОД иммунопозитивных клеток к активной каспазе-3 (31,30±0,3%, p<0,05), что связано с созреванием спаек и их структурной перестройкой. Также наблюдалось снижение ОД иммунопозитивных клеток к NF-kB(14,37±1,5%, p<0,05), что имеет обратную корреляционную зависимость от экспрессии каспазы-3.

Рис. 3. Сравнительная характеристика экспрессии каспазы-3, активной каспазы-3 и NF-kbв экспериментальных группах при хронической эмпиеме плевры на 30-е сут., p<0,05

В IV и V опытных группах на этом сроке наблюдается снижение иммунопозитивных клеток к маркерам апоптоза (рис. 3). Так, при использовании жировой ткани ОД позитивно окрашенных клеток к каспазе-3 составила 12,27±3,2%, а при сочетанном потенцировании адгезиогенеза - 11,21±0,5% (p<0,05). ОД к активной каспазе-3 составила 18,27±2,1% и 13,91±0,9% соответственно, что достоверно отличалось от показателей I группы и III опытной группы на данном сроке. К тому же наличие незначительного числа иммунопозитивных клеток к NF-kBв этих группах (IV группа - 9,18±0,8%, V группа - 7,02±1,2%) свидетельствует о достаточно высокой степени зрелости соединительной ткани с устранением воспалительных элементов путем апоптоза и достаточным числом фибробластов, синтезирующих внеклеточный матрикс, представленный преимущественно коллагеновыми волокнами.

Выводы