Корреляционный анализ показателей локального иммунитета и эпителиально-мезенхимального перехода больных колоректальным раком в зависимости от уровня циркулирующих опухолевых клеток

Метастатический процесс в злокачественных опухолях является многосторонним, и, несмотря на его роль в исходе заболевания и эффективности лечения онкологических больных, остается много вопросов, связанных как со свойствами самой опухоли, так и с состоянием регуляторных систем иммунитета больного [1]. Количество циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) в качестве одного из таких механизмов рассматривается и исследуется во всем мире в течение двух последних десятилетий [2]. Результаты корреляции ЦОК и состояния иммунной системы нередко являются противоречивыми и в большинстве своем выполнены на экспериментальных моделях. В связи с этим представляется важной оценка состояния иммунной системы у онкологических больных в зависимости от наличия ЦОК, с учетом того, что она может играть как противоопухолевую, так и проонкогенную роль. Колоректальный рак (КРР) в силу локализации тесно связан не только с системным, но и с локальным иммунитетом [3]. Известно, что у больных с онкологической патологией происходит нарушение различных звеньев иммунитета [4, 5]. Изучение системного иммунного статуса больных КРР после различных оперативных вмешательств показало большую сохранность Т-, В- и НК-клеточного звеньев иммунитета после лапароскопического удаления опухоли толстой кишки, в отличие от открытой операции [6].

Иммунные инфильтраты различаются между типами опухолей и между отдельными пациентами. В одной опухоли могут существовать различные типы иммунных клеток, в том числе врожденные и адаптивные иммунные клетки [7].

Изучение взаимодействия таких системных показателей, как ЦОК, с локальными особенностями иммунологического микроокружения и эпителиально-мезенхимального перехода необходимо для понимания биологии опухоли. Подобные исследования в перспективе могут быть использованы для прогнозирования течения заболевания и разработки новых подходов к лечению.

Цель исследования: проведение корреляционного анализа показателей локального противоопухолевого иммунитета и маркеров эпителиально-мезенхимального перехода и количества циркулирующих опухолевых клеток у первичных больных с II-IV стадией колоректального рака.

Материал и методы исследования. В исследовании принимали участие 60 первичных больных с II-IV стадией КРР (по 20 человек с каждой стадией). Все больные были проинформированы об исследовании и подписывали согласие на участие в нем.

Детекцию ЦОК у больных выполняли до операции. Для этого проводили забор 8 мл периферической крови из локтевой вены в пробирки OellSavePreservativeTube (JanssenDiagnostics LLC, США), содержащие антикоагулянт К2ЭДТА в смеси с реагентом для сохранения жизнеспособности опухолевых клеток. Подготовленные образцы крови помещали в систему анализа CellSearchSystem™ (JanssenDiagnostics LLC, США), которая состоит из двух аппаратов: а) CellTracks® AutoPrep® System, обогащающего суспензию клетками с экспрессией маркера адгезии эпителиальных клеток EpCAM, основного лимфоцитарного маркера CD45 и цитокератинов 8, 18, 19; б) анализатора CellTracks® Analyzer II®. ЦОК<3 считали негативными (ЦОК^-), ЦОК>3 - позитивными (ЦОК+). Оценку статистической достоверности различий между уровнем ЦОК в группах исследования определяли по t-критерию Стьюдента. Данные выражали средними значениями и их ошибкой.

После оперативного вмешательства проводили иммуногистохимическое (ИГХ) исследование уровня опухолевой инфильтрации клетками иммунной системы с применением моноклональных антител к человеческому CD3, CD4, CD8, CD20 и CD56 (Abcam, Великобритания) и экспрессии белков эпителиально-мезенхимального перехода: E-cadherin, N-cadherin (DAKO, Германия). Данные ИГХ анализа выражали как средние значения выборки в каждой группе. Сравнение совокупностей по количественным признакам проводили по U-критерию Манна-Уитни. U-критерий Манна-Уитни является непараметрическим критерием, поэтому не требует наличия нормального распределения сравниваемых совокупностей и подходит для сравнения малых выборок.

Корреляционный анализ между показателями ИГХ анализа и уровнем ЦОК проводили в программе Statistica. Для выборок, подчиняющихся нормальному закону распределения (согласно критерию Шапиро-Уилка, поскольку выборки менее 50 значений), применяли параметрический коэффициент корреляции Пирсона, а для выборок, не подчиняющихся нормальному закону распределения, - непараметрический коэффициент корреляции Спирмена.

Результаты исследования и их обсуждение. Исследование уровня ЦОК у больных II-IV стадией КРР показало у всех больных системное наличие опухолевых клеток в периферической крови (рис. 1). У пациентов со II стадией КРР ЦОК определяли в 65% случаев (у 13 больных из 20) в количестве от 1 до 7 клеток.

Средние значения в данной группе составили 2±0,5 ЦОК. В группе с III стадией КРР циркулирующие опухолевые клетки детектировали в 85% случаев (у 17 больных из 20), при этом максимальное количество ЦОК - у 1 пациента, а, следовательно, и вариационный разброс уровня ЦОК в данной группе был больше, чем у больных со II стадией КРР данного исследования, и составил от 1 до 47 клеток.

Средние значения уровня ЦОК в группе больных с III стадией КРР составили 6,2±3,8. В группе с генерализованным КРР (IV стадия) ЦОК выявляли в 75% случаев (у 15 больных из 20). Для больных с IV стадией КРР был характерен большой разброс количества определяемых ЦОК, которые находились в диапазоне от 1 до 121 клеток.

Средние значения уровня ЦОК у больных с IV стадией КРР составили 8,4±4,4. Высокие значения ЦОК в данной группе встречались лишь в единичных случаях, а именно у 4 больных с количеством ЦОК, равным 17, 20, 31 и 121. Изучение показателей ЦОК в зависимости от стадии опухолевого процесса при КРР не показало связи частоты определения опухолевых клеток в периферической крови со стадией заболевания.

противоопухолевый иммунитет колоректальный рак

Рис. 1. Диаграмма размаха уровня ЦОК у больных со II-IV стадией КРР

Вместе с тем наблюдали увеличение количества ЦОК при росте злокачественности опухоли, что объяснимо для IV стадии, в которой происходит активное метастазирование опухолевых клеток. Однако для II и III стадий развития опухоли подобное нехарактерно, при этом мы наблюдали диссеминацию опухолевых клеток уже при местно-распространенном процессе. В свою очередь это согласуется с ранее проведенными экспериментальными исследованиями. Например, Fidler и иные (1970) обнаружили на мышиных экспериментальных моделях метастазирования, что в преметастатических легких через 24 ч после внутривенной инъекции опухолевых клеток лишь 1% сохраняет жизнеспособность [8]. В работе Luzzi и соавт. (1998) на 13-й день после инъекции опухолевых клеток только 1% микрометастазов в печени прогрессировал с образованием макрометастазов, 36% опухолевых клеток оставались изолированными; 95% из них были в состоянии покоя (2% пролиферативные и 3% апоптотические) [9]. В отечественном исследовании А.А. Ковалева и иных (2012) было показано, что лишь 0,01% ЦОК достигают своей метастатической ниши и реализуются в метастазы [10]. Вероятными причинами подобного могут являться механический стресс в кровеносных сосудах, сложность перемещения из одного участка в другой, наличие конечной микросреды, не подходящей для пролиферации, и вмешательство клеток иммунной системы больного (иммунный надзор) [8, 9, 11]. Исходя из этих предположений, возможно, метастазирование опухоли происходит именно при IV стадии из- за увеличения числа опухолевых клеток, циркулирующих в периферической крови больного, что и было показано в нашей работе, хотя и в единичных случаях.

В работе Cohen и иных (2008) было показано, что уровень ЦОК меньше 3 (благоприятный прогноз) или больше 3 (неблагоприятный прогноз) при КРР коррелирует с прогнозом безрецидивной и общей выживаемости [12]. После распределения выборок по уровню ЦОК во всех стадиях преобладали больные с ЦОК<3 (отрицательный уровень ЦОК) (табл.). Наибольшее количество случаев с отрицательным уровнем ЦОК было у больных со II стадией КРР и составило 15 человек (75%). Сравнение количества пациентов с ЦОК>3 во всех стадиях данного исследования показало наибольшее количество больных с позитивным уровнем ЦОК с III стадией КРР - 8 человек (40%).

Уровень ЦОК у больных со II-IV стадией КРР

Проведенное ИГХ исследование показало, что с увеличением стадии КРР от II к IV снижается опухолевая инфильтрация CD3+ клетками (II стадия - 70,9%, IV стадия - 62,05%) за счет уменьшения доли CD8+ клеток (II стадия - 41,2%, IV стадия - 26,8%) и статистически достоверно увеличивается процентное содержание CD20+ клеток (II стадия - 17,05%, IV стадия - 25,0%) (p<0,05) (рис. 2).

Рис. 2. Уровень опухолевой инфильтрации иммунными клетками у больных колоректальным раком II-IV стадии

Также достоверно снижается экспрессия E-кадгерина (II стадия - 90%, IV стадия - 25%) и повышается N-кадгерин (II стадия - 10%, IV стадия - 75%) (p<0,05) (рис. 3).

Рис. 3. Уровень экспрессии кадгеринов в опухолевых клетках у больных колоректальным раком II-IV стадии

Проведенный корреляционный анализ показал ряд статистически достоверных корреляций (например, потерю связи между показателями локального иммунитета у больных с ЦОК+ во II стадии КРР). Вместе с тем возникает отрицательная корреляция между CD4+ и экспрессией Е-кадгерина (p<0,05). Подобные изменения были отмечены и при III стадии, однако у этих больных возникают корреляции между Е- и N-кадгерином (p<0,05), что, вероятно, говорит об усилении эпителиально-мезенхимального перехода. У больных с IV стадией КРР были получены аналогичные данные.

При исследовании показателей ЦОК^--больных в III стадии КРР в сравнении с данными у ЦОК'-больных во II стадии обнаружена потеря связи локальных уровней CD4+ и CD8+, а у ЦОК'-больных с IV стадией - и между CD3+ и CD4+. У тех же больных, начиная с III стадии, отмечается отрицательная корреляция между экспрессией Е- и N-кадгерина (p<0,05), не связанная с исследованными показателями клеточного локального иммунитета.

У ЦОК⁺-больных при всех трех исследованных стадиях КРР происходит потеря многих связей между показателями 3 звеньев клеточного локального иммунитета. Если у ЦОК'-больных выявлены отрицательные корреляции между показателями Т-, В- и НК- клеток, то у ЦОК⁺-больных их количество сократилось до одной. Важной представляется положительная корреляция между локальными уровнями CD3+ и CD8+, выявленная при всех стадиях у ЦОК'-больных и свидетельствующая о преобладании цитотоксических Т- клеток в опухоли. У ЦОК+-больных данная корреляция теряет достоверность независимо от стадии.

При II стадии у больных с ЦОК+ отмечена обратная корреляция между показателями локального иммунитета и экспрессией эпителиальных и мезенхимальных маркеров: между уровнем ЄП4-лимфоцитов и Е-кадгерина в опухолевых клетках, что, возможно, отражает наличие среди этих клеток иммуносупрессивной и ростостимулирующей фракции Т- регуляторных клеток.

Заключение

В ходе проведенного многоэтапного исследования системных показателей, таких как ЦОК, и локальных - уровня иммунологического микроокружения и эпителиально-мезенхимального перехода - у пациентов со II-IV стадией КРР была отмечена потеря взаимосвязи факторов локального иммунитета у ЦОК+-больных по сравнению с ЦОК^- -больными. Помимо этого, в нашей работе наличие ЦОК оказалось более значимым для определения количества и характера соотношения клеточных показателей локального иммунитета, чем стадия заболевания.

Список литературы

1. Lambert A.W., Pattabiraman D.R., Weinberg R.A. EmergingBiologicalPrinciplesofMetastasis. Cell. 2017. vol. 168. P. 670-691. DOI: 10.1016/j.cell.2016.11.037.

2. Leone K., Poggiana C., Zamarchi R. TheInterplaybetweenCirculatingTumorCellsandtheImmuneSystem: FromImmuneEscapetoCancerImmunotherapy. Diagnostics (Basel). 2018. vol. 8. no 3. P. 59. D0I:10.3390/diagnostics8030059.

3. Кит О.И., Шуликов П., Новикова И.А., Гранкина А.О., Колесников В.Е., Геворкян Ю.А., Солдаткина Н.С. Циркулирующие опухолевые клетки при колоректальном раке // Врач. 2017. № 5. С. 42-45.

4. Кит О.И., Шапошников А.В., Златник Е.Ю., Никипелова Е.А., Новикова И.А. Местный клеточных иммунитет при аденокарциноме и полипах толстой кишки // Сибирское медицинское обозрение. 2012. Т. 4. № 76. С. 11-16.

5. Кит О.И., Кириченко Е.Ю., Новикова И.А., Максимов А.Ю., Филиппова С.Ю., Гранкина А.О., Златник Е.Ю. Иммунотерапия колоректального рака: современное состояние и перспективы (обзор) // Современные технологии в медицине. 2017. Т. 9. № 3. С. 138-150.

6. Колесников В.Е., Кит О.И., Златник Е.Ю., Новикова И.А., Гранкина А.О., Геворкян Ю.А., Максимов А.Ю. Анализ иммунного статуса больных колоректальным раком после различных вариантов оперативного вмешательства // Современные проблемы науки и образования. 2016. № 6. URL: http://www.science-education.ru/ru/article/view?id=25733 (дата обращения: 25.08.2020).

7. Fridman WH, Pages F, Sautes-Fridman C, Galon J. Theimmunecontextureinhumantumors: impactonclinicaloutcome. Nat. Rev. Cancer. 2012. vol. 12. no 4. P. 298-306.

8. Fidler I.J. Metastasis: Quantitativeanalysisofdistributionandfateoftumorembolilabeledwith 125 I-5-iodo-2'-deoxyuridine. J. Natl. CancerInst. 1970. vol. 45. P. 773-782.

9. Luzzi K.J., MacDonald I.C., Schmidt E.E., Kerkvliet N., Morris V.L., Chambers A.F., Groom A.C. Multistepnatureofmetastaticinefficiency: Dormancyofsolitarycellsaftersuccessfulextravasationandlimitedsurvivalofearlymicrometastases. Am. J. Pathol. 1998. vol. 153. P. 865873. DOI: 10.1016/S0002-9440(10)65628-3.

10. Ковалев А.А., Грудинская Т.В., Кузнецова Т.П., Ковалев К.А. Гетерогенность циркулирующих опухолевых клеток // Онкология. 2012. Т. 14. № 2. С. 126-129.

11. Strilic B., Offermanns S. IntravascularSurvivalandExtravasationofTumorCells .CancerCell. 2017. vol. 32. P. 282-293. DOI: 10.1016/j.ccell.2017.07.001.

12. Cohen S.J., Punt C.J., Iannotti N., Saidman B.H., Sabbath K.D., Gabrail N.Y., Picus J., Morse M., Mitchell E., Miller M.C., Doyle G.V., Tissing H., Terstappen L.W., Meropol N.J. Relationshipofcirculatingtumorcellstotumorresponse, progression-freesurvival, andoverallsurvivalinpatientswithmetastaticcolorectalcancer. J. Lin. Oncol. 2008. vol. 26. no 19. P. 32133221.

Размещено на Allbest.ru