Выявление необычных клеток микоплазм, персистирующих у обезьян

Размещено на http://www.allbest.ru/

Выявление необычных клеток микоплазм, персистирующих у обезьян

Аршба Илона Мурмановна, кандидат биологических наук, и. о. заведующей лабораторией инфекционной патологии, ведущий научный сотрудник, ФГБНУ «Научно-исследовательский институт медицинской приматологии»; Раковская Ирина Валентиновна, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник, заведующая лабораторией, Бархатова Ольга Ивановна, кандидат биологических наук, научный сотрудник; Левина Галина Александровна, кандидат медицинских наук, научный сотрудник; Горина Луиза Георгиевна, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник; Гамова Наталья Александровна, кандидат биологических наук, научный сотрудник; Гончарова Светлана Александровна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории микоплазм и L-форм бактерий, ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи»

Многолетнее сотрудничество ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России и ФГБНУ «Научно-исследовательский институт медицинской приматологии» по исследованию спонтанной микоплазменной инфекции у разных видов обезьян Адлерского питомника показало широкую распространенность носительства микоплазм и уреаплазм. Выделенные из организма обезьян микоплазмы, образующие мини-колонии, аналогичны тем, которые выделяли от пациентов с различными хроническими патологическими процессами. Клетки мини-колоний устойчивы к различным неблагоприятным факторам, вызывающим гибель клеток классических колоний. Клетки мини-колоний резистентны к антибиотикам, обладающим принципиально различными механизмами действия.

Ключевые слова: микоплазмы, уреаплазмы, обезьяны, мини-колонии, антибиотики.

The detection of unusual mycoplasma cells persistent in monkeys

Arshba Ilona M., Cand. Sci. (Biol.), Head of Department, Leading Researcher, Laboratory of Infectious Pathology, Research Institute of Medical Primatology; Rakovskaya Irina V., Dr. Sci. (Biol), Leading Researcher, Head of Laboratory; Barkhatova Olga I., Cand. Sci. (Biol.), Researcher; Levina Galina A., Cand. Sci. (Med.), Researcher; Gorina Luiza G., Dr. Sci. (Biol), Leading Researcher; Gamova Nata'lya A., Cand. Sci. (Biol.), Researcher; Goncharova Svetlana A., Cand. Sci. (Biol.), Senior Researcher, Honorary Academician N.F. Gamalei National Research Center for Epidemiology and Microbiology

Long-term cooperation FSBI “Gamaleya Federal Scientific Research Center of Epidemiology and Microbiology”, Russia and Research Institute of Medical Primatology, Russia on the research of spontaneous Mycoplasma infection in different monkey species of the Adler colony showed a wide prevalence of Mycoplasma and Ureaplasma carriers. Mycoplasma isolated from the apes and forming mini-colonies are similar to those isolated from patients with various chronic pathological processes. The cells of mini-colonies are resistant to various unfavourable factors causing the death of cells of classical colonies. The cells of mini-colonies are resistant to antibiotics, which have fundamentally different mechanisms of action.

Key words: mycoplasma, ureaplasma, monkeys, mini-colonies, antibiotics.

Введение

Микоплазмы - представители класса Mollicutes являются мельчайшими бесстеночными, свободноживущими, полиморфными прокариотами. Человек может являться естественным хозяином многих видов микоплазм, они обитают на мукозной поверхности респираторного и урогенитального тракта. Споры о роли микоплазм в инфекционной патологии человека продолжительны, а мнения часто противоречивы, что объясняется широким распространением микоплазм среди здоровых людей и отсутствием характерных клинических симптомов, свойственных только микоплазменным инфекциям. Тем не менее убедительно доказано, что некоторые виды микоплазм являются возбудителями заболеваний человека.

Mycoplasma genitalium (M. genitalium) вызывает воспалительные процессы, связанные с хроническим и острым негонококковым уретритом (НГУ) и сопровождается выраженными клиническими проявлениями. Mycoplasma hominis (M. hominis) причастна к развитию воспалительных заболеваний НГУ. Описаны пороки развития плода при утробном инфицировании этой микоплазмой. M. hominis с высокой частотой обнаруживается во влагалище при бактериальном вагинозе. Наибольшая инфицированность Ureaplasma urealyticum (U. urealyticum) и Ureaplasma parvum (U. parvum) отмечалась при уретральном синдроме у новорожденных детей с низкой массой тела и с патологией респираторного тракта. Микоплазмы способны колонизировать клетки эпителиальных тканей макроорганизма, адсорбироваться на эритроцитах человека и животных, макрофагах, различных клетках крови. Клетки микоплазм имеют сниженные потенции к росту и размножению in vitro, но способны вызывать генерализованную инфекцию с длительной персистенцией в тканях и сыворотке крови [4, 5, 7, 8, 14, 18, 19].

У микоплазм отмечена длительная персистенция в инфицированных органах и тканях макроорганизма, а их антигены обнаруживают в крови и органах на протяжении месяца после клинического выздоровления, то есть для микоплазменных инфекций характерна длительная антигенемия [10, 11, 15].

Микоплазмы при росте на агаре через 24-96 часов после посева образуют колонии, напоминающие яичницу-глазунью с плотным, врастающим в агар центром и нежной поверхностной ажурной периферией. Колонии микоплазм варьировали от 50 до 500 мкм. Они состоят из шаровидных тел различной оптической плотности, зернистой массы и структур, свободно лежащих или заполняющих сферические тела; нитевидных и ветвистых структур, составленных из отдельных гранул и мелких палочковидных элементов [8].

За время многолетнего сотрудничества ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России и ФГБНУ «Научно-исследовательский институт медицинской приматологии» на инфицированность микоплазмами были обследованы обезьяны различных видов, самцы и самки, здоровые и больные, длительно живущие в Адлерском питомнике и недавно привезенные из мест естественного обитания.

Представление об инфицировании обезьян микоплазмами необходимо иметь в связи с тем, что эти бактерии оказывают существенное влияние на результаты вирусологических, бактериологических, биохимических, иммунологических и других исследований, проводимых с использованием приматов [1, 2, 3, 6, 12, 13, 16, 17].

Ранее из проб сыворотки крови пациентов с воспалительными заболеваниями урогенитального тракта, мочекаменной болезнью, хроническим бронхитом и бронхиальной астмой были выделены культуральным методом колонии микоплазм не описанного ранее морфотипа, названные «миниколониями» (МК), в отличие от классических колоний (КК), морфотип которых хорошо известен бактериологам [4, 7, 8, 9].

Аналогичные культуры были выделены также из синовиальной жидкости при ревматоидном артрите у детей и взрослых, из образцов криоконсервированной спермы быков-производителей и из различных клеточных культур. В большинстве случаев выделенные культуры были типированы в полимеразной цепной реакции (ПЦР) с помощью видовой тест-системы как M. hominis, в единичных случаях - как Mycoplasma pneumoniae (M. pneumoniae) и Mycoplasma fermentans (M. fermentans). Некоторые штаммы типировать до вида не удалось, они отнесены к Mycoplasma spp. [10].

Клетки, образующие МК, существенно отличались от клеток КК микоплазм по своим морфологическим и физиологическим свойствам. В настоящем сообщении приведены сведения о выделении из организма обезьян микоплазм, образующих МК, аналогичные тем, которые выделяли от пациентов с различными хроническими патологическими процессами.

Цель настоящего исследования заключалась в выяснении возможности персистенции в организме обезьян клеток микоплазм, формирующих колонии необычного морфотипа, аналогичные тем, которые были выделены ранее из клинического материала от людей при различных патологических процессах.

Материалы и методы исследования

Исследованы 53 обезьяны обоего пола и разных видов: из рода макак обследовано 28 обезьян, что составило: макаки резус (Macaca mulatta) - 13 особей, макаки яванские (Macaca fascicularis) - 15 особей. Зеленых мартышек (Chlorocebus aethiops) обследовано 25 особей.

Определение инфицированности исследуемого клинического материала микоплазмами проводили с помощью ПЦР. Экстракцию ДНК из клинического материала проводили с использованием комплекта реагентов «АмплиПрайм ДНК-сорб-В» (ООО «ИнтерЛабСервис», Россия). Выявление ДНК микоплазм осуществляли с помощью тест-систем (ООО «ИнтерЛаб Сервис», Россия): универсальной для Mycoplasma spp. тест-системы «Мик-Ком», тест-систем «АмплиСенс M. hominis», «АмплиСенс M. genitalium» и «АмплиСенс M. pneumoniae» для обнаружения ДНК конкретных видов микоплазм, а также тест-системы «АмплиСенс Ureaplasma spp.» для ДНК U. urealyticum и U. parvum. Реакцию проводили согласно прилагаемым к тест-системам методическим инструкциям с использованием амплификатора модели «Терцик» («ДНК-Технология», Россия). Методом ПЦР исследованы соскобы из урогенитального тракта у 53 обезьян.

Для культивирования микоплазм использовали коммерческие питательные среды «PPLOBroth» и «PPLOAgar» («Difco», США) с добавлением 20 % сыворотки крови лошади и 1 % L-аргинина (для M. hominis) и мочевины 0,05% (для U. urealyticum и U. parvum), пенициллина (100 ед/мл), индикатора роста фенолового красного (0,005 %).

Эпителиальные соскобы из урогенитального тракта всех 53 особей были исследованы также культуральным методом. Пробы сыворотки крови удалось получить только от 20 животных.

Чувствительность к антибиотикам клеток КК и МК определяли методом бумажных импрегнированных антибиотиками дисков (ООО «НИЦФ», Россия) на чашках с 1.3 агаровой средой по прописи, указанной выше. Учет производили на 4 сутки (КК) и 10-12 сутки (МК).

Результаты исследования и их обсуждение

Данные о частоте инфицирования обезьян микоплазмами в зависимости от вида, пола и длительности проживания в питомнике опубликованы ранее [2, 3]. Укажем только, что из 53 исследованных соскобов в 19 (36 %) была обнаружена ДНК микоплазм. Из 20 проб сыворотки крови ДНК микоплазм была выявлена в 3 образцах.

При исследовании культуральным методом всех ДНК-положительных соскобов и проб сыворотки крови из 15 соскобов и одного образца сыворотки крови были выделены культуры КК, типированные как M. hominis. 4 штамма из соскобов и 2 из сыворотки крови типировать до вида с помощью имеющихся в распоряжении тест-систем не удалось. Они были типированы как представители рода Mycoplasma и обозначены как Mycoplasma spp.

Из эпителиальных соскобов 16 обезьян были выделены культуры уреаплазм, типировать их до вида с тест-системами к микоплазмам человека (U. urealyticum и U. parvum) не удалось. Видимо, это были собственные виды микоплазм обезьян.

В 5 случаях из соскобов были выделены необычные колонии - МК. Один из выделенных штаммов был получен от яванской макаки 8 лет с диагнозом «Бесплодие». По своим культуральным и морфологическим характеристикам МК, выделенные от обезьян, не отличались от МК микоплазм, выделенных ранее от больных людей.

Основные отличия клеток КК и МК заключаются в следующем:

1. Морфология и размер колоний. КК имеют вид яичницы-глазуньи (fried-egg) и состоят из округлых клеток различного размера и единичных палочковидных элементов. МК имеют винтообразное строение с лопастями, расходящимися из плотного центра. Лопасти состоят из плотноупакованных отдельных элементов. Диаметр КК - 100-300 мкм, МК - 7,5-9,5 мкм (рис.).

Рис. КК микоплазм (А) и МК микоплазм (В)

2. Замедленная скорость роста. КК разных видов микоплазм вырастают на поверхности агара через 24-96 часов после посева. МК становятся видимыми при увеличении х 10 на 7-9 сутки, при первичном выделении - на 12-14 сутки. МК из-за их малого размера могли быть приняты за артефакты, наряду с малым размером колоний их позднее появление на агаре является причиной их ускользания от внимания микоплазмологов.

3. Клетки МК, в отличие от КК, не разлагают ни аргинин, ни глюкозу или, возможно, разлагают столь незначительно, что это трудно уловить. По-видимому, они используют другие пути получения энергии.

4. Клетки МК устойчивы к различным неблагоприятным факторам, вызывающим гибель клеток КК.

5. Клетки МК резистентны к антибиотикам, обладающим принципиально различными механизмами действия (табл. 1).

Таблица 1. Чувствительность Mycoplasma hominis (КК и МК) к антибиотикам

Примечание: S - чувствительны, I - слабочувствительны, R - не чувствительны

С помощью ряда методов: прямой иммунофлюоресценции, сиквенса фрагмента ДНК 16S РНК гена, сравнительного анализа LAMPs (липид-ассоциированные мембранные белки) и данных по ПЦР с видовыми тест-системами к микоплазмам человека были получены доказательства принадлежности 5 выделенных штаммов МК к M. hominis.

В таблице представлены результаты испытания чувствительности клеток КК и МК M. hominis.

Несмотря на различие механизмов действия антибиотиков разных классов, клетки МК оказались устойчивыми ко всем испытанным препаратам, что позволяет предположить существование единого механизма их антибиотикорезистенции [20].

В системе in vitro культуры МК M. hominis, M. fermentans, M. pneumoniaе, Mycoplasma gallisepticum, Acholeplasma laidlawii были получены при воздействии неблагоприятных факторов на классическую культуру микоплазм (антител, нетермальной аргоновой плазмы, культивирования на бедной среде или длительной инкубации свыше двух недель при 37 °С) [15].

Какова же природа клеток, образующих МК? Можно было бы предположить, что они образуются из клеток КК при неблагоприятных условиях. Однако отсутствие реверсии этих культур в классическую форму при культивировании в течение длительного срока (свыше 2 лет), одновременное выявление в световом и электронном микроскопе на поверхности агара КК и зачатков МК, выделение в чистой культуре МК из дважды клонированной КК дают основания полагать, что популяция микоплазм исходно гетерогенна и состоит из клеток генетически запрограмированных на создание МК и КК.

Результаты сравнительного полногеномного секвенирования и протеомного анализа клеток классических колоний и мини-колоний позволят выявить гены и белки, определяющие изменение морфотипа, физиологических характеристик и антибиотикорезистентности клеток мини-колоний.

персистенция клетка микоплазма антибиотик

1. Аршба И.М. Значение урогенитальных инфекций для патологии беременности и родов в эксперименте / И.М. Аршба, Э.К. Джикидзе // Инфекция и иммунитет. - 2011. - Т. 1, № 2. - С. 185-188.

2. Аршба И.М. Иммунологические показатели инфицированных урогенитальными микоплазмами обезьян / И.М. Аршба, Э.К. Джикидзе, И.В. Раковская, Л.Г. Горина, С.А. Гончарова // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2007. - № 5. - С. 87-90.

3. Аршба И.М. Инфицированность микоплазмами обезьян, находящихся в условиях неволи и вновь привезенных из Танзании / И.М. Аршба, И.В. Раковская, О.И. Бархатова, Г.А. Левина, Л.Г. Горина, Н.А. Гамова, С.А. Гончарова // Астраханский медицинский журнал. - 2016. - Т. 11, № 2. - С. 64-70.

4. Бархатова О.И. Персистенция микоплазм при мочекаменной болезни / О.И. Бархатова, Г.А. Левина, И.В. Раковская, Н.С. Мулабаев, Н.А. Гамова, Э.Р. Толордава, Ю.М. Романова // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2015. - № 4. - С. 101-106.

5. Борхсениус С.Н. Микоплазмы в биологии и медицине начала XXI века / С.Н. Борхсениус, О.А. Чернова, В.М. Чернов, И.Е. Вишняков. - СПб.: Наука, 2016. - 332 с.

6. Джикидзе, Э.К. Спонтанные микоплазмозы обезьян / Э.К. Джикидзе, Р.И. Крылова // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2001. - Т. 132, № 12. - С. 678-683.

7. Левина Г.А. Необычные формы персистенции Mycoplasma hominis в организме инфицированных людей / Г.А. Левина, О.И. Бархатова, Л.Г. Горина, Н.А. Гамова, С.А. Гончарова, Г.Г. Миллер, Т.М. Раскова, И.Н. Растегаева, Н.А. Селиверстова, И.В. Раковская // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2012. - № 4. - С. 104-109.

8. Прозоровский С.В. Медицинская микоплазмология / С.В. Прозоровский, И.В. Раковская, Ю.В. Вульфович. - М.: Медицина, 1995. - 286 с.

9. Раковская И.В. Биологическая характеристика клеток микоплазм, образующих колонии не известного ранее морфотипа - Мини-колонии / И.В. Раковская, Г.А. Левина, О.И. Бархатова, Л.Г. Горина, С.А. Ермолаева, Е.В. Сысолятина, Д.А. Бурмистрова, Г.Г. Миллер, А.Я. Мухачев, И.М. Аршба // Молекулярная диагностика: мат-лы IX Всероссийской научно-практической конференции с международным участием (Москва, 18-20 апреля 2017 г.) / под ред. В.И. Покровского. - Тамбов: Юлис, 2017. - Т 1. - С. 513-514.

10. Раковская И.В. Генерализованная микоплазменная инфекция у больных и носителей / И.В. Раковская, Л.Г. Горина, Д.Н. Балабанов, Г.А. Левина, О.И. Бархатова, С.А. Гончарова, Н.А. Гамова // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2013. - № 2. - С. 37-43.

11. Раковская И.В. Нетипичные формы микоплазм, персистирующих в организме зараженных ими людей / И.В. Раковская, О.И. Бархатова, Н.А. Гамова, С.А. Гончарова, Л.Г. Горина, Г.А. Левина, Г.Г. Миллер, Т.М. Раскова, И.Н. Растегаева // Клиническая лабораторная диагностика. - 2011. - № 12. - С. 35-38.

12. Раковская И.В. Персистенция Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum в организме инфицированных животных / И.В. Раковская, Л.Г. Горина, О.И. Бархатова, Д.Н. Балабанов, С.А. Гончарова Н.А. Гамова, Г.А. Левина // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2009. - № 4. - С. 81-85.

13. Чикобава М.Г. Филогенетический анализ микоплазмы, выделенной от макаки яванской В.А. Калашникова, А.А. Агумава // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2008. - № 1. - M. fascicularis) / М.Г. Чикобава, Э.К. Джикидзе, Д.В. Задорожный, Т.И. Кебу, И.М. Аршба, с. 23-26.

14. Bischof D.F. Cytotoxicity of Mycoplasma mycoides subsp. mycoides small colony type to bovine epithelial cells / D.F. Bischof, C. Janis, E.M. Vilei, G. Bertoni, J. Frey // Infect. Immun. - 2008. - Vol. 76, № 1. - Р. 263-269.

15. Ermolaeva S.A. Nonthermal plasma affects viability and morphology of Mycoplasma hominis and Acholeplasma laidlawii / S.A. Ermolaeva, I.V. Rakovskaya, G.G. Miller, E.V. Sysolyatina, A.Y. Mukhachev, M.M. Vasiliev, R.R. Adgamov, G.A. Levina, O.F. Petrov, G.E. Morfill, A.I. Grigoriev, V.E. Fortov, A.L. Gintsburg // J. Appl. Microbiol. - 2014. - Vol. 116, № 5. - P. 1129-1136.

16. Kimberly R.P. In vivo handling of soluble complement fixing Ab/dsDNA. immune complexes in chimpanzees / R.P. Kimberly, J.C. Edberg, L.T. Merriam, S.B. Clarkson, J.C. Unkeless, R.P. Taylor // J. Clin. Invest. - 1989. - Vol. 84, № 3. - P. 962-970.

17. Lo S.C. Fatal systemic infections of nonhuman primates by Mycoplasma fermentans(incognitus strain) / S.C. Lo, D.J. Wear, J.W. Shih, R.Y. Wang, P.B. 3rd Newton, J.F. Rodriguez // Clin. Infect. Dis. - 1993. - Vol. 17, Suppl. 1. - P. S283-288.

18. Proctor R.A. Small colony variants: a pathogenic form of bacteria that facilitates persistent and recurrent infections / R.A. Proctor, C. von Eiff, B.C. Kahl, K. Becker, P. McNamara, M. Herrmann, G. Peters // Nat. Rev. Microbiol. - 2006. - Vol. 4, № 4. - P. 295-305.

19. Razin S. Highlights of Mycoplasma research - an historical perspective / S. Razin, L. Hayflick // Biologicals. - 2010. - Vol. 38, № 2. - P. 183-190.

20. Soloveva S.V. Detection of tetracycline- and erythromycin-resistant urogenital mycoplasma strains using PCR / S.V. Soloveva, E.G. Tsoi, N.A. Zigangirova, N.A. Gamova, I.V. Rakovskaia, A.L. Gintsburg // Journal of microbiology epidemiology and immunobiology. - 1998. - № 6. - P. 3-7.

Размещено на Allbest.ru