Изучение флавоноидного состава фитоэкстрактов

Размещено на http://www.allbest.ru/

Изучение флавоноидного состава фитоэкстрактов

А.В. Локарев 1,

А.Я. Самуйленко 1,

М.А. Огай 2,

Е.В. Ковтун 2,

Ю.А. Морозов 3,

М.С. Макиева 3,

А.И. Сливкин 4,

А.С. Беленова 4,

В. В., Гаврась 5,

Н.Л. Нам 6

1 Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности

2Пятигорский медико-фармацевтический институт - филиал ФГБОУ ВО ВолгГМУ 3Северо-Осетинский государственный университет им. К.Л. Хетагурова

4ФГБОУ ВО "Воронежский государственный университет" -'Представительство АО "Санофи-Авентис груп"

6Российский Государственный Аграрный Университет - МСХА имени К.А. Тимирязева

Аннотация

Биологически активные вещества растительной клетки не изменяют грубо и резко всю систему химических реакций живой клетки высшего животного и человека. фитоэкстракт фармакологический лекарственный

Хотелось бы отметить, что лекарственные растения и препараты на их основе, не вызывая побочных явлений, могут применяться длительно людьми разных возрастных категорий, в том числе - пожилыми и детьми, а также у животных в ветеринарии. Задачей наших исследований, было создание фитоэкстрактов широкого спектра действия на основе флавоноидосодержащего сырья с определенными фармакологическими свойствами и использовать их как целевые продукты и в качестве "промежуточных", для создания в последующем различных лекарственных форм - мягких (гелей), жидких (капель, спреев).

В результате проведенных исследований нами получено спирто-водное извлечения из 13 объектов лекарственного растительного сырья. Несмотря на многокомпонентность состава, основной упор был сделан на полифенольную группу соединений, представленную флавоноидами.

Второй фитокомплекс получен из листьев гинкго двулопастного методом ультразвуковой экстракции, также 70 % этанолом и содержит флавоновые гликозиды и терпеновые лактоны. По данным литературы, действие обусловлено характером влияния на процессы обмена веществ в клетках, реологические свойства крови и микроциркуляцию, а также на вазомоторные реакции крупных кровеносных сосудов. Препараты гинкго билоба улучшают мозговое кровообращение и снабжают мозг кислородом и глюкозой. Обладают сосудорасширяющим действием, препятствуют агрегации тромбоцитов. Нормализуют метаболические процессы, оказывают антигипоксическое действие на ткани. Препятствуют перекисному окислению липидов и образованию свободных радикалов клеточных мембран. Оказывают выраженное противоотечное действие в периферических тканях. При различных патологических состояниях предотвращают усиление протеолитической активности сыворотки.

Для получения промежуточного продукта - фитоэкстрактов, содержащих флавоноиды, необходимо было установить качественный и количественный состав. Были использованы цветные реакции на фенольные соединения. Количественный состав был подтвержден методом спектрофотометрии.

Ключевые слова: фитоэкстракта, флавоноиды, метаболические процессы, гинкго билоба, гели, капли, спреи.

Study of the flavonoid composition of herbal extracts

A. V. Lokarev1, A. J. Samuilenko1, M.A. Ogai2, E. V. Kovtun2, J. A. Morozov3,

M. S. Makieva3, A. I. Slivkin4, A. S. Belenova4, V. V. Gavras5, N.L. Nam6

1 All-Russian research and technological

Institute of biological industry 2Piatigorsky medico-pharmaceutical Institute - branch of FSBEI Wagga Ministry of health of Russia 3North Ossetian state University. K. L. Khetagurova 4Voronezh state University

Representation of Sanofi-Aventis group JSC

6Russian State Agrarian University - Timiryazev Moscow state agrarian University

Abstract. Biologically active substances of a plant cell do not change roughly and sharply the whole system of chemical reactions of the living cell of the higher animal and man.

I would like to note that medicinal plants and preparations based on them, without causing side effects, can be used for a long time by people of different age groups, including the elderly and children, as well as in animals in veterinary medicine. The objective of our research was the creation of herbal extracts with broad spectrum of action on the basis of fluoroestradiol raw materials with defined pharmacological properties, and use them as target products, and as "intermediate", to create in the subsequent a variety of dosage forms - soft (gels), liquids (drops, sprays).

As a result of our research, we obtained alcohol-water extraction from 13 objects of medicinal plant raw materials. Despite the multicomponent composition, the main emphasis was placed on the polyphenolic group of compounds represented by flavonoids.

The second phytocomplex is obtained from the leaves of Ginkgo biloba by ultrasonic extraction, also 70 % ethanol and contains flavone glycosides and terpene lactones. According to the literature, the effect is due to the nature of the effect on the metabolic processes in cells, rheological properties of blood and microcirculation, as well as vasomotor reactions of large blood vessels. Ginkgo biloba preparations improve cerebral circulation and supply the brain with oxygen and glucose. They have a vasodilating effect, prevent platelet aggregation. Normalize metabolic processes, have an antihypoxic effect on the tissue. Prevent lipid peroxidation and the formation of free radicals of cell membranes. Have a pronounced anti-edema effect in peripheral tissues. In various pathological conditions prevent increased proteolytic activity of the serum.

To obtain an intermediate product - phytoextracts containing flavonoids, it was necessary to establish a qualitative and quantitative composition. Color reactions to phenolic compounds were used. The quantitative composition was confirmed by spectrophotometry.

Keywords: phytoextracts, flavonoids, metabolic processes, Ginkgo biloba, gels, drops, sprays.

Лекарственные средства, содержащие природные компоненты из растительного сырья, являясь "продуктом" природы, обладают многими достоинствами, которых лишены синтетические. Лекарственные вещества образуются в живой клетке, имеющей много общего с клеткой животного. Это общее заключается в сходном строении клеток, единой схеме многих биохимических процессов, происходящих в организме. Биологически активные вещества растительной клетки не изменяют грубо и резко всю систему химических реакций живой клетки высшего животного и человека [1, 2].

Хотелось бы отметить, что лекарственные растения и препараты на их основе, не вызывая побочных явлений, могут применяться долгосрочно пожилыми людьми и детьми, а также в ветеринарии.

Задачей наших исследований, было создание фитоэкстрактов широкого спектра действия на основе флавоноидосодержащего сырья с определенными фармакологическими свойствами и использовать их как целевые продукты и в качестве "промежуточных", для создания в последующем различных лекарственных форм - мягких (гелей), жидких (капель, спреев) [4, 5, 8, 9, 10]. В результате проведенных исследований нами получено спиртоводное извлечения из 13 объектов лекарственного растительного сырья. Несмотря на многокомпонентность состава, основной упор был сделан на полифенольную группу соединений, представленную флавоноидами. Многокомпонентное извлечение сочетает в себе ромашку (цветы) 0.04 части, календулу (цветки) 0.05 частей, тмин (плоды) 0.03 части, сосну (почки) 0.50 частей, тысячелистник (трава) 0.05 частей, мяту (лист) 0.16 частей, шиповник (плоды) 0.06 части, фенхель (плоды) 0.30 части, солодку (корень) 0.25 частей, полынь (трава) 0.40 частей, чабрец (трава) 0.15 частей, зверобой (трава) 0.05 частей, чистотел (трава) 0.02 части. Полученный экстракт получен методом ремацерации с использованием в качестве экстрагента 70 % этанола, с добавлением 10 % метиленхлорида. Полученный фитокомплекс предполагаем рассматривать как основу мягких лекарственных форм противоартритного и противоартрозного действия.

Второй фитокомплекс получен из листьев гинкго двулопастного методом ультразвуковой экстракции, также 70 % этанолом и содержит флавоновые гликозиды и терпеновые лактоны - основа препаратов для улучшения мозгового кровообращения [3, 6, 7].

Препараты гинкго в качестве официально утвержденных лекарственных средств стали применяться только с 1960-х гг. ХХ века. Ассортимент лекарственных препаратов на основе гинкго двулопастного на российском фармацевтическом рынке представлен преимущественно средствами зарубежного производства [3, 6, 7].

Поэтому, создание экстракционных препаратов - основы разноплановых лекарственных форм является вполне актуальным [11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20].

Методика эксперимента

Качественное определение флавоноидов в экстрактах

1. Цианидиновая проба (проба Цинода). К 1 мл экстракта добавляли несколько капель кислоты хлористоводородной концентрированной и 30 мг порошка магния.

2. Реакция комплексообразования с раствором ацетата свинца. При добавлении к 3 мл экстракта 1 мл 2% раствора ацетата свинца основного должно наблюдаться окрашивание раствора в желтый цвет.

3. Взаимодействие с щелочами. 1 мл экстракта смешивали 10% раствора натрия гидроксида. Раствор должен окрашиваться в желто - бурый цвет.

4. Борно-лимонная реакция: К 1 мл экстракта прибавляли метанольные растворы H3BO3. Должно появляться жёлтое окрашивание с жёлто-зелёной флуоресценцией.

5. С раствором аммиака: К 1 мл экстракта прибавляли 1 мл раствора аммиака, должно появляться желтое окрашивание, при нагревании переходящее в оранжевое или красное.

Количественное определение суммы флавоноидов в комплексном экстракте

Для количественного определения суммы флавоноидов в изучаемом экстракте был использован метод дифференциальной спектрофотомерии, основанный на способности изучаемых веществ образовывать комплексное соединение с раствором хлорида алюминия. При этом наблюдается ба- тохромный сдвиг полосы поглощения из области 330-350 нм в область 390-415 нм, что позволяет уменьшить вклад сопутствующих веществ в абсорбционный спектр. Для достижения этой цели в качестве раствора сравнения использовали раствор, не содержащий комплексообразователя.

Около 1 г (точная навеска) экстракта помещали в мерную колбу вместимостью 50 мл, обрабатывали в ультразвуковой бане в течение 20 минут, после чего охлаждали и доводили спиртом этиловым 96% до метки (раствор А).

1 мл раствора А, помещали в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляли 4 мл 2% раствора алюминия хлорида в 96% этиловом спирте и 4 капли раствора уксусной кислоты разведенной. Объем раствора доводили тем же спиртом до метки (раствор Б) и оставляли на 40 мин.

Оптическую плотность полученного раствора измеряли на спектрофотометре ("Экрос ПЭ- 5400УФ", РФ) в максимуме светопоглощения, при длине волны 415 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения использовали раствор, состоящий из 2 мл извлечения, 4 капли раствора разведенной уксусной кислоты и 96% этилового спирта, добавленного до метки в мерной колбе вместимостью 50 мл.

Параллельно измеряли оптическую плотность раствора РСО рутина, приготовленного аналогично испытуемому раствору.

Содержание суммы флавоноидов в процентах (X) в пересчете на рутин вычисляли по формуле:

где А - оптическая плотность испытуемого образца; А 0 - оптическая плотность стандартного образца; а - навеска экстракта, г; а 0 - навеска стандартного образца, г; Р - содержание основного вещества в стандартном образце рутина, %.

Приготовление раствора рутина стандартного образца. Около 0.0250 г (точная навеска) РСО рутина, в пересчете на сухое вещество помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, прибавляли 35 мл 96% этилового спирта и нагревали на водяной бане до полного растворения. Затем охлаждали, доводили объем раствора до метки тем же спиртом и перемешивали (раствор А), 1 мл раствора А помещали в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляли 2 мл 2% раствора алюминия хлорида в 96% этиловом спирте и 4 капли раствора разведенной уксусной кислоты, доводили объем раствора 96% этиловым спиртом до метки, перемешивали и оставляли на 40 мин (раствор Б).

Приготовление раствора сравнения: К 1 мл исходного раствора прибавляли 4 капли раствора разведенной уксусной кислоты и доводили до метки в мерной колбе вместимостью 25 мл 96% спиртом этиловым.

Приготовление 2% раствора алюминия хлорида в 96% спирте этиловом: 2 г алюминия хлорида помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяли в 50 мл 96% этилового спирта и доводили объем раствора до метки тем же спиртом.

Валидация методики количественного определения экстракта

Проводилась в соответствии с требованиями нормативной документации. Для подтверждения специфичности методики снимали спектры поглощения испытуемого раствора и раствора стандартного образца рутина, параллельно со спектром раствора - плацебо. Спектры поглощения испытуемого и стандартного образца имеют совпадающие максимумы светопоглощения при длине волны 415±2 нм, спектр раствора - плацебо такого максимума не имеет.

Для определения прецизионности методики оценивали повторяемость (сходимость): при проведении анализа в одинаковых условиях были получены сопоставимые результаты. Определение количественного содержания на разных приборах показало, что методика отвечает требованиям промежуточной (внутрилабораторной) прецизионности.

Правильность методики подтверждали методом добавок рутина в образец экстракта. Была построена градуировочная кривая зависимости оптической плотности от концентрации рутина в экстракте, представленная на рисунке 4. Установлен линейный характер этой зависимости.

Обсуждение результатов

С целью обнаружения флавоноидов в комплексном экстракте, содержащем ромашку (цветы) 0.04 части, календулу (цветки) 0.05 частей, тмин (плоды) 0.03 части, сосну (почки) 0.50 частей, тысячелистник (трава) 0.05 частей, мяту (лист) 0.16 частей, шиповник (плоды) 0.06 части, фенхель (плоды) 0.30 част, солодку (корень) 0.25 частей, полынь (трава) 0.40 частей, чабрец (трава) 0.15 частей, зверобой (трава) 0.05 частей, чистотел (трава) 0.02 части и в фитоэкстракте из гинкго билоба, проводили качественные реакции, характерные для этой группы биологически активных веществ.

Цианидиновая проба (проба Цинода). К 1 мл экстракта добавляли несколько капель кислоты хлористоводородной концентрированной и 30 мг порошка магния. Наблюдалось малиново - красное окрашивание.

Реакция комплексообразования с раствором ацетата свинца. При добавлении к 3 мл экстракта 1 мл 2% раствора ацетата свинца основного должно наблюдаться окрашивание раствора в желтый цвет.

Взаимодействие с щелочами. 1 мл экстракта смешивали 10% раствора натрия гидроксида. Раствор окрашивался в желто - бурый цвет.

Положительные результаты вышеперечисленных реакций свидетельствуют о наличии в комплексном экстракте веществ флавоноидной природы.

Обнаружение флавоноидов в фитоэкстракте из гинкго билоба двулопастном.

1. Цианидиновая реакция: 1 мл экстракта помещали в пробирку, добавляли цинковую пыль, затем по 5-7 капель концентрированной хлористоводородной кислоты и нагревали на кипящей водяной бане в течение 10 минут. Наблюдали красное окрашивание

2. Борно-лимонная реакция: К 1 мл экстракта прибавляли метанольные растворы H3BO3. Появилось жёлтое окрашивание с жёлто-зелёной флуоресценцией.

3. С раствором аммиака: К 1 мл экстракта прибавляли 1 мл раствора аммиака, появилось желтое окрашивание, при нагревании переходящее в оранжевое или красное.

Таким образом, проведенные химические реакции доказали наличие флавоноидов в экстракте гинкго двулопастного жидком.

Количественное определение суммы флавоноидов в комплексном экстракте

Содержание суммы флавоноидов в процентах (X) в пересчете на рутин вычисляли по методике описанной выше.

Содержание суммы флавоноидов в комплексном фитоэкстракте в пересчете на рутин составило 2.85±0.02%.

Валидация методики количественного определения

Проводилась в соответствии с требованиями нормативной документации, регламентирующей валидационные процессы, согласно ОСТу 64-02003-2004.

Рис. 1. Спектр поглощения флавоноидов в комплексном экстракте

Рис. 2. Спектр поглощения стандартного образца рутина

Рис. 3. Спектр поглощения плацебо

Таблица 1

Сходимость аналитической методики