"Инсулин. Источники получения. Видовая специфичность. Иммуногенные примеси. Перспективы имплантации клеток, продуцирующих инсулин"

Инсулин - гормон пептидной природы, вырабатываемый поджелудочной железой и регулирующий уровень глюкозы в крови; препараты инсулина применяются для лечения сахарного диабета. Гормон синтезируется в бета-клетках, которые входят в отдельные гормон-секретирующие группы клеток поджелудочной железы, называемые островками лангерганса.

Молекула инсулина состоит из двух аминокислотных цепей; а-цепь содержит 21 аминокислоту, а в-цепь - 30 аминокислот. Цепи соединены друг с другом двумя дисульфидными мостиками (т.е. Каждый образован двумя атомами серы), а третий дисульфидный мостик связывает отдаленные друг от друга аминокислоты а-цепи. Соединенные цепи частично изгибаются и сворачиваются в глобулярную структуру, и такая конфигурация молекулы гормона важна для проявления его биологической активности.

Инсулин может существовать в нескольких формах: мономера, димера и гексамера. Гексамерная структура инсулина стабилизируется ионами цинка, который связывается остатками Гис в положении 10 в-цепи всех 6 субъединиц.

Первичная структура инсулина у разных биологических видов несколько различается, как различается и его важность в регуляции обмена углеводов. Наиболее близким к человеческому является инсулин свиньи, который различается с ним всего одним аминокислотным остатком: в 30 положении b-цепи свиного инсулина расположен аланин, а в инсулине человека - треонин; бычий инсулин отличается тремя аминокислотными остатками.

В обеих цепях во многих положениях встречаются замены, не оказывающие влияния на биологическую активность гормона. Наиболее часто эти замены обнаруживаются в положениях 8, 9 и 10 цепи а.

В то же время в положениях дисульфидных связей, остатков гидрофобных аминокислот в с-концевых участках в-цепи и с- и n-концевых остатков а-цепи замены встречаются очень редко, что свидетельствует о важности этих участков для проявления биологической активности инсулина. Использование химических модификаций и замен аминокислот в этих участках позволили установить структуру активного центра инсулина, в формировании которого принимают участие остатки фенилаланина в-цепи в положениях 24 и 25 и n- и с-концевые остатки цепи а.

Синтез и секреция инсулина не являются строго сопряжёнными процессами. Синтез гормона стимулируется глюкозой, а секреция его является са 2+-зависимым процессом и при дефиците са 2+снижается даже в условиях высокой концентрации глюкозы, которая стимулирует синтез инсулина.

Потребление глюкозы в-клетками происходит в основном при участии глют-1 и глют-2, и концентрация глюкозы в клетках быстро уравнивается с концентрацией глюкозы в крови. В в-клетках глюкоза превращается в глюкозо-6-фосфат глюкокиназой, имеющей высокую кm, вследствие чего скорость её фосфорилирования почти линейно зависит от концентрации глюкозы в крови. Фермент глюкокиназа - один из важнейших компонентов глюкозо-чувствительного аппарата в-клеток, в который, помимо глюкозы, вероятно, входят промежуточные продукты метаболизма глюкозы, цитратного цикла и атф. Мутации глюкокиназы приводят к развитию одной из форм сахарного диабета.

Инсулин - главный анаболический гормон. Он участвует в регуляции метаболизма, транспорта глюкозы, аминокислот, ионов, в синтезе белков.

Инсулин влияет также на процессы репликации и транскрипции, участвуя таким образом в регуляции клеточной дифференцировки, пролиферации и трансформации клеток.

Гормон поджелудочной железы стимулирует утилизацию глюкозы в клетках разными путями. Около 50% глюкозы используется в процессе гликолиза, 30 - 40% превращается в жиры и около 10% накапливается в форме гликогена. Общий результат стимуляции этих процессов - снижение концентрации глюкозы в крови.

В печени и жировой ткани инсулин стимулирует синтез жиров, обеспечивая получение для этого процесса необходимых субстратов (ацетил-коа, б-глицерофосфат и nadph) из глюкозы.

В адипоцитах инсулин активирует ацетил коа-карбок-силазу и лп-липазу и индуцирует синтез синтазы жирных кислот, ацетил-коа-карбоксилазы и лп-липазы.

Инсулин стимулирует пролиферацию большого количества клеток в культуре тканей, а также, вероятно, может участвовать в регуляции роста in vivo.

Обычно инсулин получают из поджелудочных желез свиней и коров. Отмечено, что инсулин животных часто вызывает побочные эффекты, в том числе аллергическую реакцию на такой препарат. Кроме того, сами возможности выделения и очистки гормона не беспредельны.

Существуют и другие методы получения инсулина:

-- биосинтетический, или полусинтетический;

-- генно-инженерный;

-- модифицированный генно-инженерный;

-- синтетический.

При производстве инсулина полу синтетическим методом используют природные источники сырья. В этом случае от очищенного инсулина свиньи отщепляют с-концевой октапептид в-цепи. Синтезируют с-концевой октапептид человеческого инсулина и присоединяют его химическим способом. Затем удаляют защитные группы и очищают полученный инсулин.

В настоящее время инсулин человека получают в основном двумя способами. Первый связан с модификацией свиного инсулина синтетико-ферментативным методом. Он основан на том, что свиной инсулин отличается от инсулина человека одной заменой на с-конце в-цепи ala30thr. Замену аланина на треонин осуществляют путем катализируемого ферментом отщепления аланина и присоединения вместо него защищенного по карбоксильной группе остатка треонина, присутствующего в реакционной смеси в большом избытке. После отщепления защитной о-трет-бутильной группы получают инсулин человека.

Второй способ получения инсулина человека - генно-инженерный, т. Е. Биотехнологическое получение инсулина.

В качестве компетентных клеток использовали е. Coli, а гены обеих цепей молекулы человеческого инсулина были получены методом химического синтеза. Эти гены присоединяли к з'-концу гена, кодирующего белок (3-галактозидазу, и вводили в векторную плазмиду. Трансформированные клетки е. Coli синтезировали химерные белки, состоящие из а- или в-цепи инсулина, присоединенные через метионин к 3-галактозидазе. С помощью бромцианина, специфически расщепляющего белки по остатку метионина, выделяли индивидуальную цепь инсулина. Однако образование дисульфидных цепей in vitro стало лимитирующей стадией всего процесса: выход биологически активного вещества был незначителен.

Поэтому был разработан метод получения проинсулина человека с последующим созреванием его in tube. Были получены двухцепочечные фрагменты ДНК, соответствующие гену, кодирующему человеческий инсулин. Они были встроены в плазмиду и перенесены в е. Coli. Полученные рекомбинантные клетки синтезировали проинсулин, который затем in vitro превращали в зрелый инсулин.

Видовая специфичность

Инсулины обычно классифицируют по происхождению (бычий, свиной, человеческий, а также аналоги человеческого инсулина) и продолжительности действия.

В зависимости от источников получения различают инсулины животного происхождения (главным образом препараты свиного инсулина), препараты инсулина человека полусинтетические (получают из свиного инсулина методом ферментативной трансформации), препараты инсулина человека генно-инженерные (днк-рекомбинантные, получаемые методом генной инженерии).

Для медицинского применения инсулин ранее получали в основном из поджелудочных желез крупного рогатого скота, затем из поджелудочных желез свиней. Поскольку бычий инсулин, отличающийся от человеческого тремя аминокислотами, достаточно часто вызывает аллергические реакции, на сегодняшний день он практически не применяется. Свиной инсулин, отличающийся от человеческого одной аминокислотой, реже вызывает аллергические реакции. Из препаратов инсулина животного происхождения предпочтение отдается монопиковому инсулину, получаемому из поджелудочной железы свиней. Получаемый методами генной инженерии инсулин полностью соответствует аминокислотному составу инсулина человека.

Активность инсулина определяют биологическим методом (по способности понижать содержание глюкозы в крови у кроликов) или физико-химическим методом (путем электрофореза на бумаге или методом хроматографии на бумаге). За одну единицу действия, или международную единицу, принимают активность 0,04082 мг кристаллического инсулина. Поджелудочная железа человека содержит до 8 мг инсулина (примерно 200 ед).

Препараты инсулина по длительности действия подразделяют на:

- инсулины ультракороткого действия (гипогликемический эффект развивается через 10-20 мин после п/к введения, пик действия достигается в среднем через 1-3 ч, длительность действия составляет 3-5 ч);

- инсулины короткого действия (начало действия обычно через 30-60 мин; максимум действия через 2-4 ч; продолжительность действия до 6-8 ч);

- препараты инсулина пролонгированного действия - включают в себя препараты средней продолжительности действия и препараты длительного действия;

- инсулины длительного действия (начало через 4-8 ч; пик спустя 8-18 ч; общая продолжительность 20-30 ч);

- препараты инсулина комбинированного действия (бифазные препараты) (гипогликемический эффект начинается через 30 мин после п/к введения, достигает максимума через 2-8 ч и продолжается до 18-20 ч);

Инсулины ультракороткого действия - аналоги инсулина человека. Известно, что эндогенный инсулин в в-клетках поджелудочной железы, а также молекулы гормона в выпускаемых растворах инсулина короткого действия полимеризованы и представляют собой гексамеры.

Инсулины короткого действия (их называют также растворимыми) - это растворы в буфере с нейтральными значениями ph (6,6-8,0). Они предназначены для подкожного, реже - внутримышечного введения.

Инсулины средней длительности действия хуже растворимы, медленнее всасываются из подкожной клетчатки, вследствие чего обладают более длительным эффектом. Продолжительное действие этих препаратов достигается наличием специального пролонгатора - протамина (изофан, протафан, базал) или цинка.

К инсулинам длительного действия относится инсулин гларгин - аналог человеческого инсулина, полученный методом днк-рекомбинантной технологии - первый препарат инсулина, который не имеет выраженного пика действия.

Комбинированные препараты инсулина представляют собой суспензии, состоящие из нейтрального растворимого инсулина короткого действия и инсулина-изофан (средней длительности действия) в определенных соотношениях.

Глава 2. Иммуногенные примеси

Вероятность развития ио (иммунный ответ) при введении бычьего или свиного инсулина значительно выше, чем при введении генно-инженерного человеческого инсулина или аналогов инсулина человека. Выраженность ио в данном случае определяется величиной различий в структуре молекулы экзогенного и эндогенного инсулина.

Переход к человеческим инсулинам и эволюция системы очистки привели к выраженному снижению иммуногенности препаратов инсулина, однако генно-инженерный инсулин человека, хоть и в меньшей степени, чем животные инсулины, способен вызвать ио при введении, вероятнее всего, в силу иных, нежели молекулярная структура, причин (например, вспомогательных компонентов и примесей).

Аналоги инсулина человека в целом обладают иммуногенностью, сопоставимой с таковой генно-инженерного человеческого инсулина. Данные непрямых сравнений иммуногенности не позволяют сказать, какие из аналогов инсулина человека являются наиболее иммуногенными: в одном исследовании было показано, что наиболее выраженный ио развивается при введении инсулинов гларгин и аспарт, тогда как данные других клинических исследований опровергают это утверждение. Подобная неоднозначность, вероятнее всего, связана с различиями в методике регистрации образования ат (антител) и будет разрешена с усовершенствованием и приведением аналитических методик к единообразию.

Одним из основных предикторов развития ио являются производственные примеси микроорганизма-продуцента (чаще - бактерии), с помощью которого был произведен инсулин. Эти примеси являются антигенами, на которые реагируют рецепторы антигенпрезентирующих клеток или в-лимфоцитов, что в итоге приводит к образованию ат.

К основным производственным примесям относятся липополисахариды, в-глюкан, флагеллин, днк/рнк, фрагменты белков продуцентов (hcp) и др. Следует отметить, что еще 20 лет назад не было четких руководств для оценки данных примесей.

Вспомогательные вещества используются для сохранения конформации молекулы инсулина, препятствуют деградации белка и применяются для достижения необходимых фармакологических свойств, но при этом они могут влиять на иммуногенность инсулина.

Одной из наиболее распространенных модификаций инсулинов является добавление нейтрального протамина хагедорна (нпх), представляющего собой белок форели. Добавление нпх к инсулину приводит к изменению его фармакокинетических свойств путем формирования кристаллов, которые пролонгируют время всасывания инсулина из подкожно-жировой клетчатки. Таким образом, удается получить инсулины средней продолжительности действия и миксы - готовые смеси инсулинов разной продолжительности действия.

Несмотря на широкое применение, наличие нпх потенциально может привести к развитию ио. Например, среди лекарственных препаратов инсулин растворимый, инсулин изофан нпх и инсулин двухфазный по данному параметру наибольшая иммуногенность ожидается у препарата инсулин изофан нпх, поскольку в данном ряду он содержит наибольшее количество протамина.

Глава 3. Перспективы имплантации клеток, продуцирующих инсулин

Эффективным методом лечения инсулинзависимого сд, является трансплантация инсулин-продуцирующих клеток (ипк). Донорские в-клетки трансплантируются как в составе поджелудочной железы (пж) целиком, так и в виде изолированных островков лангерганса. Однако применение метода ограничено недостатком донорского материала и необходимостью проведения пожизненной иммуносупрессивной терапии. Альтернативный способ получения ипк - дифференцировка из стволовых или прогениторных клеток. В настоящее время в качестве наиболее перспективного источника ипк рассматривают индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ипск). Такие ипк могут быть получены в неограниченном количестве и в случае трансплантации меньше подвергаются иммунной атаке со стороны реципиентов.

Трансплантация пж избавляет пациентов от искусственного введения инсулина на протяжении нескольких лет. Однако такая операция представялет собой объемное хирургическое вмешательство со смертностью от 1-3 % и серьезными осложнениями со стороны сердечно-сосудистой системы. Так же в дальнейшем пациентам требуется пожизненная иммуносупрессивная терапия, поэтому такая операция требуется людям с тяжелыми формами сд: терминальная стадия диабетической нефропатии, частые эпизоды тяжелой гипогликемии и нарушение восприятия гипогликемии.

Были предприняты попытки выделения в-клеток из островков лангерганса с целью их дальнейшей экспансии in vitro, но они не увенчались успехом, так как эти клетки являются терминально дифференцированными.

В настоящее время ипск рассматриваются как самый оптимальный вариант для клеточной терапии, благодаря их способности формировать ткани всех трех зародышевых листков и практически неограниченному пролиферативному потенциалу. В последнее время безопасность применения ипск была значительно повышена - разработаны методы получения ипск без инсерции транскрипционных факторов в геном - на основе вируса сендай и с использованием микрорнк. Кроме того, введется разработка протоколов культивирования и дифференцировки ипск в "xeno free" условиях, что позволяет снизить иммуногенность трансплантата и риск контаминации.

Заключение