Масс-спектрометрический анализ белков кальций-фосфатных бионов, выделенных из атеросклеротических бляшек

Размещено на http://www.allbest.ru/

Масс-спектрометрический анализ белков кальций-фосфатных бионов, выделенных из атеросклеротических бляшек

Южалин А.Е¹, Демидов Е.А.CRUK/MRC Oxford Institute for Radiation Oncology (Old Road Campus Research Building, Roosevelt Drive, Oxford OX3 7DQ), United KingdomInstitute of Cytology and Genetics, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences (10, ProspektLavrentyeva, Novosibirsk, 630090), Russian Federation, Пельтек С.Е.²

Кафедра онкологии, Оксфордский институт радиационной онкологии, Оксфордский университет, г. Оксфорд, Соединенное Королевство Великобритании и Северной Ирландии

²ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук», г. Новосибирск, Россия

Резюме

атеросклеротическая бляшка масс спектрометрия

Цель. Изучить белковый состав кальций-фосфатных бионов (КФБ), выделенных из атеросклеротических бляшек крупных артерий человека.

Материалы и методы. КФБ были выделены по оригинальному протоколу из атеросклеротических бляшек, полученных из бедренной артерии двух пациентов с ишемической болезнью сердца и гемодинамически значимым мультифокальным атеросклерозом. После разделения белков в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия с целью проведения протеомного анализа были проведены триптический гидролиз белков и времяпролетная матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация-масс-спектрометрия (МАЛДИ-ВП-МС). Спектры триптических гидролизатов отдельных белков идентифицировались при помощи поисковой системы Mascot.

Результаты. Было выявлено, что выделенные из атеросклеротических бляшек бедренной артерии человека КФБ содержат бычий и человеческий сывороточный альбумин, бычий альфа-2-макроглобулин, а также человеческий цитоплазматический актин 1. Таким образом, показано, что КФБ способны как адсорбировать белки из фетальной бычьей сыворотки в процессе культивирования, так и содержать в своем составе белки из атеросклеротических бляшек после их выделения.

Заключение. КФБ, выделенные из атеросклеротических бляшек крупных артерий человека, содержат в своем составе те же белки, что и искусственно синтезированные КФБ, однако адсорбируют не только белки сыворотки, но и белки бляшки.

Ключевые слова: кальций-фосфатные бионы, атеросклероз, бляшки, белковый состав, масс-спектрометрия, протеомика.

Abstract

MASS SPECTROMETRY OF PROTEINS EXTRACTED FROM PLAQUE-DERIVED CALCIUM PHOSPHATE BIONS

ARSENIY E. YUZHALIN¹, EVGENIY A. DEMIDOV², SERGEY E. PELTEK²

Materials and Methods.CPB were extract-Aim. To investigate the proteomic profile of cal- ed from femoral atherosclerotic plaques of two pa- cium phosphate bions (CPB) derived from athero- tients with coronary artery disease and significant sclerotic plaques of large human arteries. peripheral atherosclerosis utilizing an original protocol. After sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, we performed tryptic hydrolysis followed by matrix assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry (MAL- DI-TOF MS). Mass spectra were identified using the Mascot search engine.

Results.Plaque-derived CPB contained bovine and human serum albumin, bovine alpha-2-macroglobulin, and human cytoplasmic actin 1. Hence, we showed that CPB adsorb proteins from both fetal bovine serum and atherosclerotic plaques.

Conclusion.Plaque-derived CPB have similar proteomic profile to artificially synthesized CPB, yet adsorbing plaque proteins in addition to those characteristic for the serum.

Keywords: calcium phosphate bions, atherosclerosis, plaques, proteomic profile, mass spectrometry, proteomics.

Введение

Кальций-фосфатные бионы (КФБ) представляют собой минерало-органические наночастицы диаметром от 80 до 500 нм, образующиеся в крови человека при перенасыщении ионами кальция и фосфора, оказывающие токсическое действие на эндотелиальные клетки и вызывающие развитие гипертрофии брюшной аорты крыс [1-3]. Детальное изучение патогенного действия КФБ требует подробной характеризации их химического состава, включая высокопроизводительные методы. В то время как минеральный профиль КФБ может быть изучен различными методами элементного анализа (к примеру, энергодисперсионной рентгеновской спектроскопией и атомно-эмиссионной спектроскопией), инфракрасной спектроскопией и спектроскопией комбинационного рассеяния света с целью анализа функциональных групп и рентгеновской порошковой дифрактометрией для определения химической формулы входящих в их состав соединений, исследование органического профиля КФБ технически затруднительно вследствие малого содержания биомакромолекул. Предыдущие эксперименты показали, что выделенные из атеросклеротических бляшек КФБ имеют в своем составе остаточные липиды, в то время как искусственно синтезированные КФБ не содержат веществ липидной природы [3]. Это позволило предположить, что белковый профиль КФБ, выделенных из атеросклеротических бляшек, и искусственно синтезированных КФБ также может несколько отличаться. Как правило, с целью общей оценки белкового состава КФБ целесообразно применять электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия, а для идентификации конкретных белков - иммуноблоттинг. В то же время для получения максимального количества данных о входящих в их состав белках необходимо проведение масс-спектрометрии, которая на текущем этапе развития науки является наиболее высокопроизводительным методом протеомики [4, 5].

Цель исследования

Изучить белковый состав кальций-фосфатных бионов (КФБ), выделенных из атеросклеротических бляшек крупных артерий человека.

Материалы и методы

Выделение кальций-фосфатных бионов из атеросклеротических бляшек

Сегменты кальцифицированных атеросклеротических бляшек из бедренных артерий двух пациентов с ишемической болезнью сердца и мультифокальным атеросклерозом (гемодинамически значимым стенозом артерий нижних конечностей) были получены в результате хирургического вмешательства. Ткань гомогенизировали при помощи ступки и пестика, проводили ультразвуковую дезинтеграцию (UD- 20, TechPan) в режиме наибольшей мощности и центрифугировали при 3,000 x g в течение 10 мин при 4°C (5804R, Eppendorf). Далее на осадок фильтровали через целлюлозно-ацетатный фильтр (Millipore) с диаметром пор 0,22 мкм, после чего 3 мл фильтрата добавлялись во флакон (T-25, Greiner) с 7 мл модифицированной по Дульбекко среды Игла (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM), которая дополнительно содержала 10% фетальной бычьей сыворотки (Gibco), 1% раствор L-глутами- на-пенициллина-стрептомицина (Gibco) и 0,4% раствор амфотерицинаB (Gibco). Все процедуры осуществляли в стерильных условиях. Культивирование КФБ проводили при 37°C, 5% CO₂и высокой влажности (MCO-18AIC, Sanyo) в течение 6 недель.

В качестве отрицательного контроля использовали культуральную среду с добавлением и без добавления аналогичного количества однократного фосфатно-солевого буфера (pH 7.4, Gibco), а также чистую среду DMEM (без сыворотки и иных добавок). Для подтверждения роли выделяемых из бляшки кальция и фосфора в формировании КФБ осуществляли такую же процедуру для тканей внутренней грудной артерии, которая практически никогда не поражается атеросклерозом (известны лишь единичные случаи в литературе). После 6 недель культивирования культуральную среду центрифугировали при 200,000 x g в течение 1 ч при 4°C (Optima MAX-XP, Beckman Coulter). Осадок растворяли в стерильной би- дистиллированной воде, содержание КФБ в растворе определяли измерением оптической плотности (УНИПЛАН/АИФР-01, Пикон) на длине волны 650 нм (ОП₆₅₀) и приводили все образцы к одной концентрации (ОП₆₅₀ = 0,080,10).

Разделение белков интактных кальций-фосфатных бионов

Образцы концентрировали на центрифужных концентраторах Vivaspin2 (Sartorius) до объема 20 мкл. Для проведения электрофореза белков в мини-геле (8x10 см, толщина 1 мм) концентрированные образцы смешивали в соотношении 1:1 с буфером Лэммли (0,05М Трис-HClpH 6,8; 2% додецилсульфат натрия; 0,002% бромфеноловый синий; 10% глицерин; 5% 2-меркаптоэтанол) и далее кипятили в течение 5 минут. В качестве маркера молекулярных масс использовали Precision Plus (Bio-Rad). На каждую дорожку наносили по 20 мкл образца, белки концентрировали в 4% полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (акриламид/бисакриламидв соотношении 37,5:1, 0,1% додецилсульфат натрия, 0,125 мМТрис-HClpH 6,8, 0,1% тетраметилэтилендиа- мин, 0,05% персульфат аммония) при силе тока 15 мА на гель и разделяли в 12% полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (акриламид/бисакриламид в соотношении 37,5:1, 0,1% додецилсульфат натрия, 0,375 мМТрис-HClpH 8,8, 0,05% тетраметилэтилен- диамин, 0,05% персульфат аммония) при силе тока 25 мА на гель в электрофоретической камере Mini-PROTEAN® TetraCell (Bio-Rad). Гели окрашивали флюоресцентным красителем Sypro Ruby (Molecular Probes), отмывали в 7% уксусной кислоте и 10% этаноле при комнатной температуре, промывали бидистиллированной водой и визуализировали при помощи гель-до-кументирующей системы VersaDoc MP4000 (Bio-Rad). Фотографии гелей представлены на рисунке 1.

Масс-спектрометрия

Белковые фракции вырезали из гелей при помощи прибора EXQuest Spot Cutter (BioRad) и переносили в пробирки. Триптический гидролиз белка был выполнен согласно следующему протоколу: кусочки гелей промывали 0,2M бикарбонатом аммония в 50% ацетонитриле при 37°С, затем высушивали 100% ацетонитрилом, добавляли 150 мкл 0,2М бикарбоната аммония и 20 мкл 0,045М дитиотреито- ла и инкубировали при 37°С в течение 30 мин. Далее гели снова сушили 100% ацетонитрилом и инкубировали в 0,1М йодацетамиде в темноте в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем гели высушивали 100% ацетонитрилом и проводили собственно триптический гидролиз белка путем регидратации геля раствором модифицированного свиного трипсина (Trypsin Gold, Mass Spectrometry Grade, Promega) с концентрацией 15 мкг/мл в 0,05М бикарбонате аммония. Гидролиз проводили в течение 17 ч при 37°С.

После проведения триптического гидролиза раствор отбирали в отдельные пробирки, к кусочкам геля добавляли 15 мкл раствора 70% ацетонитрила с 0,1% муравьиной кислотой и далее инкубировали 2 часа на термошейкере(TS-100C, Biosan) при 37°С и 1000 об/мин. Далее надосадки сливали вместе и упаривали досуха на центрифужном вакуумном испарителе (Concentrator Plus, Eppendorf).

Для проведения масс-спектрометрического анализа методом времяпролетной матрично-активированной лазерной десорбции/ионизаци- и-масс-спектрометрии (МАЛДИ-ВП-МС) образцы растворялись в 12 мкл 5% ацетонитрила с 0,1% муравьиной кислотой. Перед нанесением на мишень масс-спектрометра образцы концентрировались на микроколонкахZipTip C18 (Millipore) согласно протоколу производителя. В качестве матрицы использовался насыщенный раствор а-циано-4-гидроксикоричной кислоты (Fluka) в 70% ацетонитриле с 0,1% муравьиной кислотой. Спектры получали на приборе Solarix XR 7T (BrukerDaltonics). Спектры триптическихгидролизатов отдельных белков идентифицировались при помощи поисковой системы Mascot.

Результаты

Разработанная оригинальная методика позволила выделить кальций-фосфатные бионы из атеросклеротических бляшек, которые визуализировались как при макроскопическом обследовании, так и при измерении оптической плотности, после растворения в бидистилли-рованной воде придавая раствору ОП₆₅₀ в 0,080,10. При разделении белков методом электрофореза в полиакриламидном геле с последующим окрашиванием красителем Sypro Ruby в образцах КФБ от обоих пациентов было выявлено 10 полос, соответствующих различным бычьим или человеческим белкам (таблица 1, рисунок 1).

Идентификация белков после масс-спектрометрии показала, что молекулярные массы полос 1 и 2 соответствуют альфа-2-макроглобулину (167,5 кДа, рисунок 2, рисунок 3), полосы 5 - бычьему сывороточному альбумину (69 кДа, рисунок 4), а полосы 6 - человеческому цитоплазматическому актину 1 (42 кДа, рисунок 5).

Белки, соответствующие остальным полосам, идентифицированы не были. Полученные данные позволяют предположить, что КФБ способны как адсорбировать белки из фетальной бычьей сыворотки в процессе культивирования, так и содержать в своем составе белки из атеросклеротических бляшек после их выделения.

Обсуждение

Таблица 1. Идентификация белков по их триптической карте масс

Table 1.Trypticmass mapping analysis

Рисунок 1. Электрофореграмма белков КФБ, выделенных из атеросклеротических бляшек. Окраска Sypro Ruby, маркер молекулярных масс Precision Plus (BioRad)

Figure 1. Gelelectrophoresisofproteinsextractedfromplaque-derivedcalciumphosphatebions.SyproRubystaining, PrecisionPlusStandard

Проведение экспериментов по изучению патогенного действия как экзогенных, так и эндогенных наночастиц требует их полной характеризации, которая включает в себя оценку формы посредством электронной или атомно-силовой микроскопии, оценку размерности методами динамического рассеяния света, а также электронной или атомно-силовой микроскопии, оценку кристалличности методами спектроскопии комбинационного рассеяния света и рентгеновской порошковой дифрактометрии, анализ минерального профиля методами энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии, атомно-эмиссионной спектроскопии, инфракрасной спектроскопии, спектроскопии комбинационного рассеяния света и рентгеновской порошковой дифрактометрии, а также анализ органического профиля методами жидкостной и газовой масс-спектрометрии.

В данной работе был выполнен анализ белкового состава КФБ из атеросклеротических бляшек крупных артерий человека при помощи МАЛДИ-ВП-МС, который показал адсорбцию к КФБ как бычьих белков (из сыворотки для культивирования, так и человеческих белков (из бляшек).

Ранее масс-спектрометрический анализ протеомного профиля бионов был проведен группой из Тайваня, которая показала присутствие в КФБ фетуина-А, альбумина, аполипопротеинов А-1, А-11 и С-Ш, протромбина, компонента комплемента С3, С4 и Н, фактора комплемента В, альфа-субъединицы гемоглобина, бета-субъединицы фетального гемоглобина, альфа-1-антипротеиназы, витамин К-зависимых белков С и S, серотрансферрина, факторов коагуляции V, IX и X, ингибитора фактора коагуляции Х11а, витамин D-связывающего белка, адипонектина, альфа-2-макроглобули- на, антитромбина-Ш, альфа-фетопротеина, белка ЖР90, тромбоспондина-1, секретируемого фосфопротеина 24, остеопонтина, альфа-2-анти- плазмина, протеиндисульфидизомеразы, эндоплазмина, маннозосвязывающего белка С, альфа-цепи фибриногена и предшественника альфа-1-макроглобулина/бикунина [2]. Несмотря на такое разнообразие выявленных белков, все они имели бычье происхождение, поскольку для культивирования КФБ традиционно используется фетальная бычья сыворотка [2]. В проведенной работе также было показано, что КФБ адсорбируют в том числе и человеческие белки, в частности, из атеросклеротических бляшек, сохраняя таким образом профиль того микроокружения, в котором они находятся. При этом качественный белковый состав КФБ, выделенных из атеросклеротических бляшек, практически не отличается от такового искусственно синтезированных КФБ [3].

Заключение

КФБ, выделенные из атеросклеротических бляшек крупных артерий человека, содержат в своем составе те же белки, что и искусственно синтезированные КФБ, однако адсорбируют не только белки сыворотки, но и белки бляшки.

Литература / References

1. Heiss A, Pipich V, Jahnen-Dechent W, Schwahn D. Fetuin-A is a mineral carrier protein: small angle neutron scattering provides new insight on Fetuin-A controlled calcification inhibition. Biophys J. 2010; 99 (12): 3986-3995.

2. Wu CY, Young L, Young D, Martel J, Young JD. Bions: a family of biomimetic mineralo-organic complexes derived from biological fluids. PLoS One. 2013; 8 (9): e75501.

3. Kutikhin AG, Velikanova EA, Mukhamadiyarov RA, Glushkova TV, Borisov VV, MatveevaVG., et al. Apoptosis- mediated endothelial toxicity but not direct calcification or functional changes in anti-calcification proteins defines pathogenic effects of calcium phosphate bions. Sci Rep. 2016; (6): 27255.

4. Larance M, Lamond AI. Multidimensional proteomics for cell biology. Nat Rev Mol Cell Biol. 2015; 16 (5): 269-280.

5. Altelaar AF, Munoz J, Heck AJ. Next-generation proteomics: towards an integrative view of proteome dynamics. Nat Rev Genet. 2013; 14 (1): 35-48.

Размещено на Allbest.ru