Характеристика свойств внутрибольничной популяции Klebsiella pneumoniae

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Характеристика свойств внутрибольничной популяции Klebsiella pneumoniae

С.А. Кузьменко, Н.И. Брежнева, А.Е. Гончаров, А.В. Тутельян

ФГБОУ ВО «Кемеровский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Кемерово, Россия, ГАУЗ КО «Клиническая больница им. С.В. Беляева», г. Кемерово, Россия, ГАУЗ КО «Областная детская клиническая больница», г. Кемерово, Россия, ФГБОУ ВО «Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова», г. Санкт- Петербург, Россия, ФБУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Роспотребнадзора», г. Москва, Россия

Резюме

Цель. Определить распространенность у пациентов детского возраста резистентных к антимикробным препаратам и дормантных форм Klebsiella pneumoniae .

Материалы и методы. Исследование проводилось в детском многопрофильном стационаре Кемеровской области с 2013 по 2018 годы. Изучена диско-диффузионным методом и методом серийных разведений с определением минимальных ингибирующих концентраций анализатором Vitek2 Compact чувствительность 485 штаммов Klebsiella pneumoniae к антибиотикам. Выполнено RAPD-типирование 34 культур Klebsiella pneumoniae с использованием программы Total Lab. Количественным методом серийных разведений проведено исследование чувствительности 42 штаммов Klebsiella pneumoniae к спиртосодержащим антисептикам и 76 штаммов к дезинфицирующим средствам, оценка чувствительности 24 штаммов Klebsiella pneumoniae к 4 сериям бактериофагов методом Аппельмана. Определение уровня персисторов в 39 клинических изолятах Klebsiella pneumoniae проводили в соответствии с методикой N. Kaldalu и соавт.

Результаты. Klebsiella pneumoniae в этиологически значимых количествах чаще всего выделялась из кишечника (826,41 на 1000 пациентов) [95% ДИ=80,24 - 84,80], глотки (33,96 на 1000) [95% ДИ=2,38-4,56]. Колонизация нескольких локусов одновременно составила 18,22 на 1000 пациентов [95% ДИ=4,42 - 7,22]. Установлена преимущественная циркуляция клональной линии А. Подавляющее большинство Klebsiella pneumoniae (92,76%) были резистентны к ампициллину. Минимальная доля резистентных штаммов была выявлена к карбапенемам и составила 3,41% - к имипенему и 4,25% - к меропенему. Треть штаммов (31,22%) - резистентны к амоксициллину с клавулановой кислотой, 34,90% штаммов продуцировали Я-лактамазу расширенного спектра. Доля резистентных штаммов к цефалоспоринам III поколения (цефотаксим, цефтазидим) составила 29,11% и 28,32% соответственно. К цефоперазону-сульбактаму резистентные штаммы встречались в 2,5 раза реже - 9,43% (р<0,0001). Доля резистентных штаммов к аминогликозидам составляла 14,35% - к нетилмицину и 15,06% - к амикацину, 20,71% - к гентамицину. Доля Klebsiella pneumoniae с высокой чувствительностью к поливалентному бактериофагу - всего лишь 6,81%. Исследуемые спиртосодержащие антисептики для обработки рук в 50% исследований оказались неэффективными в разведении 1:16. Абсолютно устойчивых штаммов Klebsiella pneumoniae к дезинфицирующим средствам выявлено не было. Выявлены клетки персисторы, формирующие дормантные формы.

Заключение. Госпитальная популяция Klebsiella pneumoniae характеризовалась преимущественной циркуляцией клональной линии А, с продукцией Я-лактамаз расширенного спектра у трети штаммов, резистентностью к ампициллину у подавляющего числа изолятов, резистентностью к бактериофагу и способностью формировать дормантные формы.

Ключевые слова: Klebsiella pneumoniae , клональная структура, клетки-персисторы, резистентность, антимикробные средства.

FEATURES OF NOSOCOMIAL KLEBSIELLA PNEUMONIAE POPULATION

SVETLANA A. KUZMENKO, NADEZHDA I. BREZHNEVA, ARTEMY E. GONCHAROV, ALEXEY V. TUTELYAN

Kemerovo State Medical University (22a, Voroshilova Street, Kemerovo, 650056), Russian Federation, Belyaev Kemerovo Regional Clinical Hospital, (22, Oktyabr'skiy Prospekt, Kemerovo, 650066), Russian Federation, Regional Pediatric Clinical Hospital (21, Oktyabr'skiy Prospekt, Kemerovo, 650056), Russian Federation, Metchnikoff North-Western State Medical University (41, Kirochnaya Street, Saint-Petersburg, 191015), Russian Federation, Central Research Institute of Epidemiology (3a, Novogirevskaya Street, Moscow, 111123), Russian Federation

Abstract

Aim.To determine the prevalence of resistant and dormant forms of Klebsiella pneumoniae in pediatric patients.

Materials and Methods. The study was conducted in the Regional Pediatric Clinical Hospital from 2013 to 2018. Antibiotic resistance of Klebsiella pneumoniae strains (n = 485) was studied by the disk diffusion test and using serial dilutions to identify minimum inhibitory concentration (Vitek 2 Compact). RAPD-typing of 34 Klebsiella pneumoniae was performed using the Total Lab program. In addition, we studied susceptibility of 42 and 76 Klebsiella pneumoniae strains to antiseptics and disinfectants, respectively. Sensitivity of 24 Klebsiella pneumoniae strains to 4 series of bacteriophages was measured using the Appelman method. Persistence of 39 of Klebsiella pneumoniae clinical isolates was carried out by Kaldalu method.

Results.Klebsiella pneumoniae was most frequently found in the intestines (826.41 per 1000 patients, 95% Cl = 80.24-84.80) and the throat (33.96 per 1000, 95% Cl = 2.38-4.56). Colonization of multiple loci was identified in 18.22 per 1000 patients (95% Cl = 4.42-7.22). The dominant circulation of clonal line A was established. The vast majority of Klebsiella pneumoniae strains (92.76%) were ampicillin- resistant. The minimal proportion of resistant strains was found for carbapenems, being 3.41% for imipenem and 4.25% for meropenem. One third of the strains (31.22%) were resistant to amoxicillin combined with clavulanic acid, and 34.90% of the strains produced extended-spectrum P-lactamase. The share of resistant strains to third-generation cephalosporins (cefotaxime and ceftazidime) was 29.11% and 28.32%, respectively. For cefoperazone-sulbactam, resistant strains were found in 9.43%. Proportion of the strains resistant to aminoglycosides was 14.35% to netilmicin, 15.06% to amikacin, and 20.71% to gentamicin. The proportion of Klebsiella pneumoniae with high sensitivity to polyvalent bacteriophage was only 6.81%. Studied alcohol-based hand antiseptics were not effective at a 1:16 dilution in half of the experiments. Certain strains of Klebsiella pneumoniae were absolutely resistant to disinfectant, and persistent microorganisms forming dormant forms were also revealed.

Conclusion. The hospital population of Klebsiella pneumoniae was characterized by the predominant circulation of clonal line A which exhibited production of a wide -lactamase spectrum, demonstrated ampicillin and bacteriophage resistance, and frequently evolved into dormant forms.

Keywords: Klebsiella pneumoniae , clonal structure, persistors, resistance, antimicrobial agents.

Введение

Бактерии рода Klebsiella являются частой причиной возникновения инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи (ИСМП) [1, 2, 3]. По данным отечественных и зарубежных исследований, существует реальная угроза формирования и распространения резистентных штаммов бактерий рода Klebsiella среди пациентов медицинских организаций, что приводит к развитию серьезных осложнений и повышает риск летального исхода [4].

Развитие современных медицинских технологий приводит к изменению характера и интенсивности проявлений эпидемического процесса, постоянное давление антимикробных средств сопровождается распространением дормантных форм бактерий. Метаболически инертные микроорганизмы (персисторы) обладают способностью ускользать от воздействия любых антибиотиков [5,6]. Известно, что персисторы могут составлять более 10% всех микробных клеток и поддерживать сохранение возбудителя [7, 8, 9].

Мониторинг и анализ госпитальной популяции Klebsiella pneumoniae является важнейшей задачей госпитального эпидемиолога для оценки риска внутрибольничного инфицирования и формирования госпитальных клонов.

Цель исследования

Определить распространенность резистентных к антимикробным препаратам и персистирующих форм Klebsiella pneumoniae у пациентов детского возраста.

Материалы и методы

Исследование проводилось в детском многопрофильном стационаре Кемеровской области с 2013 по 2018 годы. Для оценки клональной структуры выполнено RAPD-типирование 34 культур Klebsiella pneumoniae с использованием программы TotalLab (Bionumerics). Антибиотико-резистентность изучена у 485 штаммов Klebsiella pneumoniae диско-диффузионным методом и методом серийных разведений с определением минимальных ингибирующих концентраций анализатором Vitek2 compact (Франция) в соответствии с Клиническими рекомендациями «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам», 2015 г., 2 издание. Продуцирующие Я-лактамазы расширенного спектра (БЛРС) изоляты Klebsiella pneumoniae определяли диско-диффузионным методом с применением цефотаксима и цефтазидима как отдельно, так и в комбинации с клавулановой кислотой. Для контроля качества БЛРС тестов использовали штаммы Klebsiella pneumoniae АТСС 700603. Количественным методом серийных разведений проведено исследование чувствительности 42 штаммов Klebsiella pneumoniae к спиртосодержащим антисептикам и 118 штаммов к дезинфицирующим средствам. Исследование проведено в соответствии с Клиническими рекомендациями «Способ определения чувствительности бактерий к дезинфицирующим средствам при мониторинге устойчивости к антимикробным препаратам в медицинских организациях» (2015 г.). Исследованы современные дезинфицирующие средства отечественного производителя из разных химических групп, в т.ч. гуанидины с pH (9,5), кислотосодержащее средство с pH (3,6) и комбинированный препарат с содержанием солей и кислот с pH (8,5). Концентрация и экспозиция используемых растворов дезинфицирующих средств применялась в соответствии с инструкцией за- вода-производителя и режимов, используемых в детском многопрофильном стационаре. Доля спиртов в исследуемых образцах антисептиков составляла от 60 до 75%.

Изучена чувствительность 24 штаммов Klebsiella pneumoniae K 4 сериям бактериофагов методом Аппельмана (производитель ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава России): бактериофаг клебсиелл поливалентный очищенный: серии УЗ7, П 252, П 255, бактериофаг клебсиелл пневмонии очищенный: серия П 258.

Определение уровня персисторов среди 39 клинических изолятов Klebsiella pneumoniae проводили в соответствии с методикой N.Kaldalu и соавт. [10]. Культуру исследуемого штамма выращивали 16-18 часов в пробирках с бульоном Лурия (ЛБ) на шейкере (220 об/мин.) при 37°С, после чего культуру разводили ЛБ в 1000 раз, переносили мерно в пробирки по 3 мл, помещали на шейкер (220 об/ мин) и культивировали при 37°С с монито-рированием оптической плотности культуры на фотометре каждые 30 мин. Длительность культивирования устанавливали для каждого штамма (от 1,5 до 2,5 часов) по достижению оптической плотности бактериальной суспензии равной 0,05 - 0,08 при 620 нм, что соответствует 1-Зх108 КОЕ/мл (стандартизованная культура), затем определяли число КОЕ в 1 мл суспензии бактериальной культуры. На следующем этапе к стандартизованной культуре добавляли ципрофлоксацин в конечной концентрации, равной 12,5-кратной величине МПК в 1 мл бактериальной суспензии. Смесь хорошо перемешивали, инкубировали в шейкере (220 об/мин) при 37°С. Через 1,5 и 3,5 часа от начала инкубации проводили контроль антибактериального действия ципрофлоксацина путем определения количества выживших колоний. Параллельно через 3,5 часа от начала инкубации отбирали пробы, содержащие клетки- персисторы испытуемого штамма (3,5 часа - точка отбора клеток-персисторов). Все колонии бактерий, выросшие на 2-3-и сутки на ЛА (после обработки исходной культуры ципро-флоксацином в течение 3,5 часа), подвергали изучению на видовую принадлежность и чувствительность к ципрофлоксацину. В случае если выросшая культура бактерий соответствовала исходной культуре по фенотипическим признакам и уровню чувствительности к ципрофлоксацину, то предполагалось, что выделены клетки-персисторы изучаемого штамма Klebsiella pneumoniae.

Статистическая обработка данных проводилась с учетом характера распределения. Полученные данные не соответствовали нормальному распределению, поэтому для определения статистической значимости различий сопоставляемых совокупностей использовались непараметрические критерии оценки результатов исследования. Различия между группами оценивались при помощи критерия х2 и признавались статистически значимыми при вероятности отвергнуть верную нулевую гипотезу р<0,05. Использован эпидемиологический калькулятор WinPEPI, version11.65. Статистическая обработка данных по определению клеток-персистеров выполнена при помощи программы GraphPad InStat (GraphPad Software Inc., La Jol-la, CA, США).

Результаты и обсуждение

Klebsiella pneumoniae в этиологически значимых количествах чаще всего выделялась из кишечника (826,41 [95% ДИ=80,24 - 84,80] на 1000 пациентов), глотки (33,96 95% ДИ=2,38- 4,56] на 1000). Колонизация нескольких локусов одновременно составила 18,22 [95% ДИ=4,42 - 7,22] на 1000 пациентов.

При оценке резистентности штаммов Klebsiella pneumoniae к антибиотикам выявлено, что подавляющее большинство (92,76%) были резистентны к ампициллину. Треть штаммов (31,22%) резистентны к амоксициллину с клавулановой кислотой, 34,90% штаммов продуцировали Я-лактамазу расширенного спектра, что может свидетельствовать о высоком риске формирования госпитальных клонов Klebsiella pneumoniae .

Доля резистентных штаммов к цефалоспо-ринам III поколения (цефотаксим, цефтази- дим) составила 29,11% и 28,32% соответственно. К цефоперазону-сульбактаму резистентные штаммы встречаются в 2,5 раза реже - 9,43% (р<0,0001), таблица 1.

Таблица 1. Доля резистентных к антибиотикам штаммов Klebsiella pneumoniae, выделенных в неонатологических отделениях за период 2013 - 2018 гг.

Таблица 2. Количество и структура использованных антибиотиков в неонатологических отделениях в 2017 г.

антибиотик медицинский эпидемический

Примечание: `данные по максимальной суточной дозе.

При тестировании Klebsiella pneumoniae к аминогликозидам установлено, что доля резистентных штаммов составляла 14,35% - к нетилмицину, 15,06% - к амикацину, 20,71% - к гентамицину. Следует отметить, что гентамицин в настоящее время используется в качестве базисной терапии при лечении бактериальных инфекций у новорожденных детей. Нетилми-цин в течение 2017 года не использовался в лечении, но на протяжении предыдущих лет входил в стандартную схему лечения новорожденных. Несмотря на то, что фторхинолоны крайне редко применяются в детской практике, в основном только по жизненным показаниям, тем не менее доля резистентных штаммов составила 16,73%. В неонатологических отделениях наблюдаемого детского многопрофильного стационара данная группа антибиотиков не используется с 2016 года.

Минимальная доля резистентных штаммов была выявлена к карбапенемам и составила 3,41% - к имипенему и 4,25% - к меропенему.

Анализ частоты использования различных групп антибиотиков с учетом назначения пациенту максимальной суточной дозы препарата выявил соотношение карбапенемы: цефалоспо-рины: ингибиторы Я -лактамаз: пенициллины аминогликозиды как 1:1,04:1,32:2,90:3,89 (таблица 2).

Формирование резистентности Klebsiella pneumoniae в зависимости от объемов используемых антибиотиков прослеживалось только в отношении группы пенициллинов.

Методом RAPD-типирования штаммов Klebsiella pneumoniae выявлены три клональные линии - А, В, С, с преимущественной циркуляцией линии А (рисунок 1).

Рисунок 1. RAPD-типирование штаммов Klebsiella pneumoniae

В процессе изучения свойств резистентности Klebsiella pneumoniae к спиртсодержащим антисептикам для деконтаминации рук установлено, что из 42 исследований в 7,14 %случаях эффективность препарата наблюдалась лишь в разведении 1:1. В 16,66% случаев Klebsiella pneumoniae демонстрировала резистентность в разведении 1:4. В разведении 1:8 доля резистентных штаммов составляла 40,47%, 1:16 - 50%, 1:32 - 64,28%, 1:64 - 78,57%, 1:128-85,71%.

Проведено определение чувствительности 118 штаммов Klebsiella pneumoniae к дезинфицирующим средствам. Были использованы современные дезинфицирующие средства отечественного производителя из разных химических групп, в том числе гуанидины с pH (9,5), кислотосодержащее средство с pH (3,6) и комбинированный препарат с содержанием солей и кислот с pH (8,5). Концентрация и экспозиция используемых растворов дезинфицирующих средств применялась в соответствии с инструкцией завода-производителя и режимов, используемых в детском многопрофильном стационаре. Все исследованные штаммы Klebsiella pneumoniae ,в т.ч. 35,23 % штаммов, продуцирующих Я-лактамазы, были чувствительны к дезинфицирующему средству, содержащему гуанидины. Доля резистентных Klebsiella pneumoniae к кислотосодержащим и комбинированным средствам с содержанием солей и кислот составила 40%. Устойчивых ко всем тестируемым дезинфицирующим средствам штаммов Klebsiella pneumoniae выявлено не было.

Доля Klebsiella pneumoniae с высокой чувствительностью к поливалентному клебсиеллезному бактериофагу составила всего лишь 6,81%, с низкой чувствительностью - 4,54%. Нелизабельные штаммы выявлены в 88,65% случаев.

Исследованные штаммы Klebsiella pneumoniae характеризовались различным содержанием персистирующих форм (от 1000 КОЕ/мл исходной суспензии до 520000 КОЕ/ мл). Если в 1 мл суспензии культуры содержалось более 10000 колоний, эти штаммы было принято считать образующими большое количество персисторов. Согласно принятому критерию 79,49% штаммов от общего количества изученных образовывали персистирующиеформы, а штаммы, продуцирующие Я-лакта- мазы образовывали персистирующие формы в 92,31% случаев.

Заключение

Госпитальная популяция Klebsiella pneumoniae характеризовалась преимущественной циркуляцией клональной линии А, с продукцией Я - лактамаз расширенного спектра у трети штаммов, резистентностью к ампициллину у подавляющего числа изолятов, резистентностью к клебсиел-лезному бактериофагу и высокой способностью формировать персистирующие формы.

Литература

1. Sui W, Zhou H, Du P, Wang L, Qin T, Wang M, et al. Whole genome sequence revealed the fine transmission map of carbapenem-resistant Klebsiella pneumonia isolates within a nosocomial outbreak. Antimicrob Resist Infect Control. 2018; 7: 70. doi: 10.1186/sl3756-018- 0363-8.

2. Gao B, Li X, Yang F, Chen W, Zhao Y, Bai G, et al. Molecular epidemiology and risk factors of ventilatorassociated pneumonia infection caused by carbapenem- resistant enterobacteriaceae. Front Pharmacol. 10: 262. doi: 10.3389/fphar.2019.00262.

3. Apondi OE, Oduor OC, GyeBK, Kipkoech MK. High prevalence of multi-drug resistant Klebsiella pneumoniae in a tertiary teaching hospital in Western Kenya. AfrJ Infect Dis. 2016; 10 (2): 89-95. doi: 10.21010/ajid. vl0i2.3.

4. Arena F, HenriciDe Angelis L, D'Andrea MM, Cannatelli A, FossatiL, Di Pilato V, et al. Infections caused by carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae with hypermucoviscous phenotype: A case report and literature review. Virulence. 2017; 8 (8): 1900-1908. doi: 10.1080/21505594.2017.1286439.

5. Li Y, Zhang L, Zhou Y, Zhang Z, Zhang X. Survival of bactericidal antibiotic treatment by tolerant persister cells of Klebsiella pneumonia. J Med Microb. 2018; 67 (3): 273-281. doi: 10.1099/jmm.0.000680.

6. Salisbury AM, Woo K, Sarkar S, Schultz G, Malone M, Mayer DO, et al. Tolerance of Biofilms to Antimicrobials and Significance to Antibiotic Resistance in Wounds. SurgTechnol Int. 2018; 33: 59-66.

7. Marcus V, Niza B, Takita M, De Souza AA. The MqsRA toxin-antitoxin system from xylellafastidiosa plays a key role in bacterial fitness, pathogenicity, and persister cell formation. Front Microbiol. 2016; 7: 904. doi: 10.3389/ fmicb.2016.00904.

8. Fasani RA, Savageau MA. Molecular mechanisms of multiple toxin-antitoxin systems are coordinated to govern the persister phenotype. Proc Natl AcadSci US A. 2013; 110 (27): E2528-37. doi: 10.1073/pnas.l301023110.2013.

9. Michiels JE, Van den Bergh B, Verstraeten N, Fauvart M, Michiels J. In vitro emergence of high persistence upon periodic aminoglycoside challenge in the ESKAPE pathogens. Antimicrob Agents Chemother. 2016; 60 (8): 4630-4637. doi: 10.1128/AAC.00757-16.

10. Kaldalu N, Joers A, Ingelman H, Tenson T. A general method for measuring persister levels in Escherichia coli cultures. Methods Mol Biol. 2016; 1333: 29-42. doi:10.1007/978-l-4939-2854-5_3.

Размещено на Allbest.ru