Mолекулярно-эпидемиологическая характеристика и резистентность пневмококков у детей дошкольного возраста

Размещено на http://www.allbest.ru/

Mолекулярно-эпидемиологическая характеристика и резистентность пневмококков у детей дошкольного возраста

И.Н. Протасова¹, Н.В. Бахарева², О.В. Перьянова¹, Н.А. Ильенкова¹, Г.П. Мартынова¹, С.В. Домрачева³, О.П. Овчинникова⁴, Т.А. Елистратова¹, О.А. Тюшевская¹, Е.С. Соколовская¹, С.В. Сидоренко⁵, Т. Yamamoto⁶

Цель исследования. Определение серотипов, генотипов и резистентности к антимикробным препаратам штаммов Streptococcus pneumoniae, полученных от здоровых детей и детей с различными формами пневмококковой инфекции на территории Красноярского края.

Материал и методы. Проведено ПЦР-серотипирование, мультилокусноесиквенс-типирование (MLST) и определение чувствительности к антибиотикам методом дисков и серийных разведений в бульоне 49 штаммов S. pneumoniae,полученных от здоровых детей - бактерионосителей, и 23 штаммов, полученных от больных детей, поступивших в стационар по поводу острого отита, менингита, внебольничной пневмонии. В исследовании применялись бактериологический и молекулярно-генетические методы. Для определения статистической значимости различий использовали критерий у².

Результаты. Преобладающими серотипами/серогруппами и генотипами пневмококков у бактерионосителей являлись 23F (ST1500, CC30), 19A (ST320, CC320), 6ABC (ST315, CC315) и 15BC (ST1025, CC1025). У больных детей преобладали 19А (ST320, СС320) и 19F (ST271, ST1464, ST2323, ST9659 - СС320). В 71,4 % серотипы штаммов, полученных от бактерионосителей, и в 91,3 % - от больных детей соответствовали антигенному составу 13-валентной пневмококковой конъюгированной вакцины. Представители клональных комплексов 315 и 320 характеризовались одновременной резистентностью к эритромицину, азитромицину, клиндамицину и тетрациклину, умеренной устойчивостью к пенициллину, чувствительностью к цефтриаксону и ципрофлоксацину.

Заключение. Среди пневмококков, персистирующих в носоглотке и вызывающих инфекционные заболевания у детей дошкольного возраста, с высокой частотой встречаются штаммы с множественной лекарственной устойчивостью. Одним из путей преодоления резистентности на данном этапе является вакцинопрофилактика пневмококковой инфекции.

Ключевые слова: Streptococcus pneumoniae,носоглоточное носительство, пневмококковая инфекция, серотипы у детей, сиквенс-типы, резистентность, вакцинопрофилактика.

MOLECULAR - EPIDEMIOLOGICAL CHARACTERISTICS AND RESISTANCE OF PNEUMOCOCCUS IN CHILDREN OF PRESCHOOL AGE

The aim of the research. Identification of serotypes, genotypes and resistance to antimicrobial preparations of Streptococcus pneumoniae strains, obtained from healthy children and children with various forms of pneumococcal infection in the territory of Krasnoyarsk Territory.

Material and methods. PCR-serotyping, multilocus sequence typing (MLST), and antibiotic susceptibility determination by disk and serial dilution of 49 strains of S. pneumoniae in broth, obtained from healthy children who are bacteria-carriers and 23 strains, obtained from sick children who were hospitalized with acute otitis media, meningitis, community-acquired pneumonia. Bacteriological and molecular genetic methods were used in the research. To determine the statistical significance of the differences, the y² criterion was used.

Results. The predominant serotypes / serogroups and genotypes of pneumococci in bacteria-carriers were: 23F (ST1500, CC30), 19A (ST320, CC320), 6ABC (ST315, CC315) and 15BC (ST1025, CC1025). In sick children, 19A (ST320, CC320) and 19F (ST271, ST1464, ST2323, ST9659 - CC320) prevailed. In 71.4 % strains serotypes obtained from bacteria-carriers and in 91.3 % obtained from sick children corresponded to the antigenic composition of 13-valence pneumococcal conjugate vaccine.

Representatives of 315 and 320 clonal complexes were characterized by simultaneous resistance to erythromycin, azithromycin, clindamycin and tetracycline; moderate resistance to penicillin; sensitivity to ceftriaxone and ciprofloxacin.

Conclusion. Among pneumococci, that persist in the nasopharynx and cause infectious diseases in preschool children, strains with multiple drug resistance are frequently found. One of the ways to overcome resistance at this stage is vicinal prevention of pneumococcal infection.

Key words: Streptococcus pneumoniae, nasopharyngeal carriage, pneumococcal infection, serotypes in children, sequencing types, resistance, vicinal prevention.

Введение

ребенок резистентность streptococcus pneumoniae

Пневмококковая инфекция является одной из ведущих причин заболеваемости детей [1-4]. Заболевания, вызываемые пневмококком, подразделяются на инвазивные (менингит, бактериемия) и неинвазивные (средний отит, синуситы, бронхит, внебольничная пневмония) [2-4]. Источниками инфекции являются не только больные, но и бактерионосители; передача происходит воздушно-капельным путем [1, 3, 5]. Streptococcus pneumoniaeне является облигатным патогеном, но обладает широким набором факторов вирулентности, позволяющих ему эффективно колонизировать слизистую носоглотки и вызывать заболевания не только у детей, но и у пожилых людей, лиц с иммунодефицитами и хроническими заболеваниями органов дыхания [2, 6]. В связи с этим, во многих странах проводится массовая иммунопрофилактика пневмококковой инфекции (в США - с 2000г., в европейских странах - с 2006-2008гг.) [7, 8]. В Российской Федерации антипневмококковая вакцинация детей включена в Национальный календарь профилактических прививок в 2014г. [9]. Набор полисахаридных антигенов возбудителя, входящих в состав вакцин, зависит от спектра его антигенных вариантов (серотипов), актуальных в клинической практике. С течением времени происходит «замещение серотипов», что требует коррекции антигенного состава вакцин [7, 10].

S.pneumoniaeимеет 94 серотипа, что свидетельствует о высокой пластичности генома данного патогена, достигающейся благодаря рекомбинационной изменчивости [16]. Данное свойство обусловливает не только антигенное разнообразие, но и возрастающую устойчивость пневмококка к антибиотикам [11]. ПенициллинрезистентныеS. pneumoniaeвошли в перечень наиболее актуальных резистентных патогенов, представляющих угрозу для здоровья человека, опубликованный Всемирной Организацией здравоохранения в 2017г. [12].

Данное исследование было проведено с целью выявления актуальных генетических вариантов пневмококка, распространенных на территории Красноярского края среди здоровых носителей и больных детей с различными нозологическими формами пневмококковой инфекции, а также определения чувствительности S. pneumoniaeк антибактериальным препаратам.

Материал и методы

Объектом исследования явились 72 штамма S. pneumoniae, полученные от детей в возрасте до 7 лет. Данные изоляты были получены при обследовании 183 здоровых детей и 86 детей, поступивших в стационары г. Красноярска по поводу острого среднего отита, пневмонии, гнойного менингита в период с 2011 по 2015гг. Первую группу (группа I) составили 49 штаммов, выделенных от бактерионосителей (исследуемый материал - отделяемое носоглотки); вторую группу (группа II) - 23 штамма, выделенные от больных детей с диагнозами «Острый средний отит» (n=15, исследуемый материал - жидкость среднего уха), «Внебольничная пневмония» (n=4, исследуемый материал - индуцированная мокрота,), «Гнойный бактериальный менингит» (исследуемый материал - кровь, n=4).

В исследовании применялись классический бактериологический метод и молекулярно-генетические методы.

Для выделения чистых культур использовали Columbia Agar (Bio-Rad, Франция) с добавлением 5 % эритроцитарной массы, а также Chocolate Agar Base без селективной добавки (HiMedia, Индия). Инкубация проводилась в эксикаторе при температуре 35°С в течение 24 ч. Идентификация пневмококков проводилась на основании морфо-тинкториальных, культуральных, антигенных свойств (Slidexpneumo-Kit, bioMerteux, Франция), чувствительности к желчи и оптохину, а также с помощью ПЦР (детекциявидоспецифических генов cpsAи lytA).

Определение серотипа S. pneumoniaeпроводили методом мультиплексной ПЦР, используя 39 пар праймеров [13] на приборе Applied Biosystems. Продукты амплификации детектировали в 1,5 % агарозном геле(Sigma, США) с последующей визуализацией бромистым этидием (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) при УФ-излучении (Х=310 нм) в трансиллюминатореMolecular Imager® Gel Doc XR System (Bio-Rad, США). Размеры ПЦР-продуктов определяли сравнением с маркером молекулярного веса ДНК (100 bpDNA Ladder; Евроген, Россия).

Мультилокусноесиквенс-типирование (MLST) штаммов S. pneumoniaeс определением аллельного профиля (сиквенс-типа) проводили с использованием базы данных, размещенной на вебсайте http://www.mlst.net/[14]. Полученные данные анализировали с помощью программного обеспечения eBURST[15] для определения принадлежности сиквенс-типов к определенному клональному комплексу. Секвениро-вание проводилось компанией «Синтол» (Россия).

Исследование чувствительности к антимикробным препаратам проводили согласно российским [16] и американским [17] рекомендациям диско-диффузионным методом и методом микроразведений в бульоне Мюллера-Хинтона с добавлением 2,5 % лизированной крови лошади. Интерпретацию результатов проводили согласно российским клиническим рекомендациям [15] и критериям EUCAST [18]. В качестве контроля использовался штамм S. pneumoniaeАТСС 49619.

Статистическая обработка материала выполнена с помощью программы «Statistica6.0». Для проверки статистической значимости гипотез использовали критерий у². Статистически значимыми считались различия при р<0,05.

Результаты и обсуждение

Среди штаммов S. pneumoniae, выделенных от бактерионосителей, были выявлены представители 5-ти серотипов и 6-ти серогрупп, относящиеся к 17 сиквенс-типам и 8 клональным комплексам (табл. 1). 11 изолятов представляли собой новые, впервые выявленные сиквенс-типы, внесенные в международную базу данных PubMLST(https://pubmlst.org/bigsdb?db=pubmlst_spneumoniae_isolates). Клинические штаммы отличались меньшим разнообразием, подразделялись на 4 серотипа, 3 серогруппы и относились к 13-ти сиквенс-типам и 6-ти клональным комплексам. Новыхсиквенс-типов не было выявлено.

Серотиповой пейзаж у больных и бактерионосителей различался. Многие антигенные варианты встречались только у больных, либо только у носителей. Это подтверждает имеющиеся исследовательские данные о том, что определенные серотипы пневмококка чаще вызывают инфекционные заболевания [19]. Частота встречаемости серотипа 19F была существенно выше в группе II, а типа 23F - в группе I (табл. 1).

Таблица 1Серотипы и генотипы пневмококков у бактерионосителей и больных детей

Необходимо отметить, что значительно чаще (p<0,001) у больных детей встречались пневмококки клонального комплекса 320: 19А (ST320, ST7915) и 19F (ST271, ST1464, ST2323, ST9659).

В 71,4 % у бактерионосителей и в 91,3 % у больных детей выявленные типы S. pneumoniaeсоответствовали серотиповому составу 13-валентной пневмококковой конъюгированной вакцины (ПКВ13), широко применяемой на территории РФ в рамках Национального календаря.

При анализе чувствительности к антибактериальным препаратам было выявлено, что клинические штаммы S. pneumoniaeотличались значительно более высоким уровнем резистентности. Так, подавляющее большинство данных изолятов демонстрировало устойчивость к макролидам (эритромицин, ази-тромицин), линкозамидам (клиндамицину) и тетрациклину (табл. 2).

Обращает на себя внимание умеренная устойчивость большинства клинических штаммов к пенициллину [16, 18], при этом лишь один изолят, полученный от больного с менингитом, обладал пенициллинрезис-тентностью. Штаммов, устойчивых к цефтриаксону, не было выявлено. Данный факт подтверждает актуальность использования бета-лактамных антибиотиков в качестве препаратов первого выбора при лечении пневмококковых заболеваний у детей [20].

Стопроцентная чувствительность к ципрофлок-сацину в данном случае не была клинически значима (фторхинолоны не показаны к применению у детей), однако, эти данные могут иметь значение при назначении антибактериальной терапии пневмококковых инфекций взрослым больным.

34,7 % штаммов группы I и 73,8 % - группы II обладали мультирезистентностью (устойчивостью к антибактериальным препаратам трех и более групп). Большинство (13 из 17-ти) резистентных изолятов I группы было получено от детей, находящихся в доме ребенка. Как известно, в закрытых детских коллективах с постоянным контактом между детьми процент колонизации пневмококком достаточно высок; при этом часто происходит распространение устойчивых к антибиотикам штаммов [6, 7].

Таблица 2Чувствительность к антибиотикам штаммов пневмококков, выделенных от бактерионосителей и больных детей

Рисунок. Серотипы и генотипы мультирезистентных штаммов S. pneumoniae. * - уровень статистическойзначимостир<0,01.

Figure.Serotypes and genotypes of multiresistance Streptococcus pneumoniae strains. *-the level of the statistical significance р<0,01.

Резистентные S. pneumoniaeво II группе были, в основном, получены от детей с гнойным средним отитом, многие из которых поступали в стационар на фоне антибактериальной терапии (при ее неэффективности на догоспитальном этапе).

Анализируя серотиповую и клональную принадлежность изолятов, необходимо отметить, что в обеих группах преобладали представители глобально распространенного мультирезистентногоклонального комплекса Taiwan^19F-14 (PMEN14) - 19A (CC320) и 19F (СС320) (рис.).

Все пневмококки серотипа 19А относились к одному сиквенс-типу - ST320; S. pneumoniae 19F подразделялись на 5 сиквенс-типов: ST236, ST271, ST1464, ST2323, ST9659.

Вышеуказанный клональный комплекс впервые был выявлен в 1997г. в Китае (ST236), затем - в других странах Юго-Восточной Азии, и вскоре распространился по всему миру, претерпев некоторые эволюционные изменения [10]. Некоторые авторы считают, что распространению данного генетического варианта пневмококка во многом способствовало начало массовой вакцинации ПКВ7 (в составе вакцины этот серотип отсутствует) [3, 10].

Также в небольшом количестве (рис. 1) среди устойчивых штаммов встречались представители глобально распространенного мультирезистентного комплекса Poland^6B-20, впервые выявленного на территории Европы.

Заключение

Мультирезистентные штаммы пневмококков, встречающиеся среди бактерионосителей и больных детей г. Красноярска, относятся к глобально распространенным клональным комплексам СС320 и СС315 и характеризуются устойчивостью к макролидам, линкозамидам, тетрациклинам, умеренной устойчивостью к пенициллину при сохранении чувствительности к цефтриаксону. Распространение данных генетических вариантов возбудителя является вакцинно-предотвратимым.

Учитывая разнообразие антигенных вариантов и возрастающую резистентность S. pneumoniaeк антибактериальным препаратам, необходим эпидемиологический мониторинг пневмококковой инфекции на территории РФ.

Литература / References

1. World Health Organization. Pneumococcal vaccines WHO position paper - 2012. Weekly Epidemiological Record. 2012;87(14):129-44.

2. Centers for Disease Control and Prevention. Pneumococcal disease. Accessed Aug 20, 2017. http://www.an- tibiotic.ru/index.php?article=2686

3. Devine VT, Jefferies JM, Clarke SC, Faust SN. Nasopharyngeal bacterial carriage in the conjugate vaccine era with a focus on pneumococci. Journal of Immunology Research. 2015;2015:394368. DOI:10.1155/2015/394368.

4. Рудакова АВ, Баранов AA, Лобзин ЮВ, Брико НИ, Намазова-Баранова ЛС, Таточенко ВК, Харит СМ, Сидоренко СВ, Королева ИС, Козлов РС, Маян- ский НА, Костинов МП, Снегова НФ. Фармакоэконо-мические аспекты вакцинации детей 13-валентной пневмококковой конъюгированной вакциной в Российской Федерации. Вопросысовременнойпедиатрии.2014;13(1):51-9. [Rudakova AV, Baranov AA, LobzinYuV, BrikoNI, Namazova-BaranovaLS, Tatochenko VK, Kharit SM, Sidorenko SV, Koroleva IS, Kozlov RS, MayanskiiNA, Kostinov MP, Snegova NF. Pharmacoeconomic assessment of 13-valent pneumococcal conjugate vaccine in immunization of children in Russian Federation.Current Pediatrics. 2014;13(1):51-9. (in Russian)]

5. Alderson MR. Status of research and development of pediatric vaccines for Streptococcus pneumoniae. Vaccine. 2016;34(26):2959-61. DOI:10.1016/j.vaccine.2016.03.107.

6. Sakai F, TalekarSJ, Klugman KP, Vidal JE, for the Investigators Group. Expression of Streptococcus pneumoniae virulence-related genes in the nasopharynx of healthy children. Neyrolles O, editor.PLoSONE. 2013;8(6):e67147. DOI:10.1371/journal.pone.0067147.

7. Richter SS, Heilmann KP, Dohrn CL, Riahi F, Dieke- ma DJ, Doern GV. Pneumococcal serotypes before and after introduction of conjugate vaccines, United States, 1999-2011. Emerging Infectious Diseases. 2013;19(7):1074- 83. DOI:10.3201/eid1907.121830

8. Weil-Olivier C, van der Linden M, de Schutter I, Dagan R, Mantovani L. Prevention of pneumococcal diseases in the post-seven valent vaccine era: a European perspective. BMC Infectious Diseases.12:207. 2012; DOI:10.1186/1471-2334-12-207

9. Резолюция заседания общественного Координационного совета по пневмококковой инфекции и вакцинации в России. Педиатрическаяфармакология.2015;1:120-2. [Resolution of the meeting of the Public Coordination Council on pneumococcal infection and vaccination in Russia. Pediatric Pharmacology. 2015;1:120-2. (in Russian)]

10. CroucherNJ, Chewapreecha C, Hanage WP, Harris SR, McGee L, van der Linden M, Song GH, Ko KS, de Len- castre H, Turner P, Bentley SD. Evidence for soft selective sweeps in the evolution of pneumococcal multidrug resistance and vaccine escape. Genome Biology and Evolution. 2014;6(7):1589-602. DOI:10.1093/gbe/evu120

11. Song JY, Nahm MH, Moseley MA. Clinical implications of pneumococcal serotypes: invasive disease potential, clinical presentations, and antibiotic resistance. Journal of Korean Medical Science. 2013;28(1):4-15. DOI:10.3346/jkms.2013.28.1.4

12. ВОЗ опубликовала список микроорганизмов, для борьбы с которыми срочно требуется создание новых антибиотиков. Ссылка активна на 20.08.2017. [WHO has published the list of microorganisms to combat which urgently require creation of new antibiotics. Accessed Aug 20, 2017. (in Russian)] http:// www.antibiotic.ru/index.php?article=2686

13. PCR deduction of pneumococcal serotypes. Accessed Aug 21, 2017. https://www.cdc.gov/streplab/pcr.html

14. MLST. Multi Locus Sequence Typing. Accessed Aug 21, 2017. http://www.antibiotic.ru/index.php?arti- cle=2686

15. eBURSTv3 Accessed Aug 21, 2017. http://www.an- tibiotic.ru/index.php?article=2686

16. Клинические рекомендации «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам (2015)». Ссылка активна на 21.08.2017. [Clinical recommendations. Determination of the antimicrobial susceptibility of microorganisms (2015). Accessed Aug 21, 2017. (in Russian)] http://www.antibiotic. ru/minzdrav/clinical-recommendations/

17. CLSI. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; twenty-sixth informational supplement. CLSI document M100-S26. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute; 2016.

16. EUCAST. Clinical breakpoints - bacteria (2017).Accessed Aug 21, 2017.http://www.eucast.org/clinical_ breakpoints

19. Geno KA, Gilbert GL, Song JY. Pneumococcal capsules and their types: past, present, and future. Clinical Microbiology Reviews. 2015;28(3):871-99. DOI:10.1128/ CMR.00024-15.

20. Яковлев СВ, Сидоренко СВ, Рафальский ВВ, Спичак ТВ, ред. Стратегия и тактика рационального применения антимикробных средств в амбулаторной практике: Евразийские клинические рекомендации. М.: Пре100 Принт; 2016. 144 с. [Yakovlev SV, Sidorenko SV, Rafalskij VV, Spichak TV, editors. Strategy and tactics of rational use of antimicrobials in ambulatory practice: Eurasian clinical guidelines. М.: Pre100 Print; 2016. 144 p. (in Russian)]

Размещено на Allbest.ru