Використання імуногістохімічних маркерів у діагностиці аденоміозу

USE OF IMMUNOHISTOCHEMICAL MARKERS IN DIAGNOSTICS OF ADENOMYOSIS

In the structure of genital endometriosis, the frequency of adenomyosis is 70-90%. The search for minimally invasive techniques and markers for the early diagnosis of adenomyosis is still relevant.

The study of specific markers of progression of adenomyosis with the aim of improving its early diagnosis.

The study involved 61 women, the average age of 40 years, divided into groups depending on the severity of the pathological process and the presence of comorbidities. At the first stage of the study, standard clinical and laboratory examinations were performed.

The second stage: carrying out hysteroscopic surgery with a targeted biopsy of the endometrium with the underlying part of the myometrium. Morphological processing included a complex of histological and immunohistochemical methods.

The expression of vascular endothelial growth factor was found in the basal layer of the endometrium and in endometrioid heterotopies, which confirms the unidirectionality of the changes occurring in the foci of adenomyosis and in the basal layer of eutopic endometrium with internal genital endometriosis. Given the increased expression of Ki-67 proliferation protein, it can be argued that the markers, studied, can be used as diagnostic tools in detecting adenomyosis, including endometrium associated with hyperplastic processes.

Key words: adenomyosis, endometrial hyperplasia, vascular endothelial growth factor, proliferation protein Ki-67.

Вступ

У загальній структурі гінекологічних місці після запальних процесів та лейоміоми матки захворювань ендометріоз знаходиться на третьому [1, 2]. Ендометріоз тіла матки (аденоміоз) представляє собою гормонально-залежну доброякісну інвазію ендометрію в міометрій, що призводить до гіперплазії та гіпертрофії гладком'язових тканин [3, 4]. У структурі генітального ендометріозу частота ураження аденоміозом складає 70-90% [2, 4]. Процес занурення базального шару ендометрію в міометрій відбувається на фоні локальної сполучнотканинної недостатності, обумовленої порушенням нейроендокринного та імунного статусів організму, в основі якого лежить проліферація клітин ендометрію [5].

Відомо, що аденоміоз зустрічається у 12-50% жінок репродуктивного віку та діагностується переважно на пізніх стадіях [1, 2, 4]. Складність ранньої діагностики полягає у різномаїтті клінічних проявів, які притаманні й іншим гінекологічним захворюванням. Окрім клінічної картини, у діагностиці аденоміозу використовують ультразвукові методи, проте їх інформативність залежить від ступеня прояву патологічного процесу. Досі «золотим стандартом» діагностики залишається лапароскопічне оперативне втручання [7, 8]. Саме тому пошук малоінвазивних методик та маркерів діагностики аденоміозу на ранніх стадіях розвитку патологічного процесу є актуальним.

Мета дослідження. Вивчення специфічних маркерів прогресування аденоміозу, а саме судинного ендотеліального фактору росту (VEGF - vascular endothelial growth factor) та показника проліферації Ki-67, з метою вдосконалення його ранньої діагностики.

Матеріали і методи. У дослідженні приймали участь 61 жінка, віком від 27 до 53 років, яким було проведено гістероскопічне оперативне втручання. Після ретельного обстеження та встановлення діагнозу пацієнток було розподілено на наступні групи: до I досліджуваної групи увійшли 16 пацієнток з аденоміозом I-II ступеня; II групу співставлення - склали 18 пацієнток з аденоміозом у поєднанні з гіперпластичними процесами ендометрію (поліп, гіперплазія ендометрію); III група співставлення - включала 17 випадків гіперпластичних процесів ендометрію; IV група - група контролю, до якої увійшли 10 пацієнток з діагнозом: безпліддя I (ендокринного ґенезу, синдром полікістозних яєчників, перетинки порожнини матки).

На першому етапі дослідження пацієнткам усіх груп проводили стандартне клініко - лабораторне обстеження, а саме: збір скарг, анамнезу, оцінку об'єктивного статусу, бімануальний вагінальний огляд, ультразвукове дослідження та оцінку гормонального статусу.

Другим етапом було проведення гістероскопічного оперативного втручання, у ході якого пацієнткам II та III досліджуваних груп спершу було проведено видалення поліпів чи гіперплазії ендометрію, а далі пацієнткам усіх досліджуваних груп було взято прицільну біопсію ендометрію з підлягаючою частиною міометрію з протилежної сторони від патологічно зміненої ділянки у вигляді поліпу чи гіперплазії.

Морфологічна обробка включала комплекс гістологічних методів. Отриманий матеріал було зафіксовано у 10% буферному розчині формаліну. Ущільнення тканин, зафіксованих формаліном, досягалось проведенням через спирти збільшуваної концентрації, розчин Нікіфорова (96% спирт та діетиловий ефір у співвідношенні 1:1), хлороформ та заливкою у парафін. З приготованих блоків для подальшого забарвлення готували серійні зрізи завтовшки 4-5 х10^-6м.

У всіх випадках використовували рутинний метод забарвлення гематоксиліном і еозином, а також забарвлення пікрофуксином за Ван Гізоном, методом Маллорі. Кожен досліджуваний випадок піддавали оглядовій мікроскопії, при якій давали загальну оцінку стану досліджуваних тканин: визначали характер патологічного процесу, проводили гістологічну верифікацію доброякісної проліферативної патології ендометрію (поліп ендометрію, гіперплазія ендометрію, поєднана проліферативна патологія ендометрію). За допомогою методів забарвлення за Ван Гізоном, методом Маллорі оцінювали стан сполучнотканинного компоненту ендометрію і перехідної зони стінки матки. При цьому методом за Ван Гізоном колагенові волокна сполучної тканини забарвлюються кислим фуксином у червоний колір, методом Маллорі колагенові волокна аніліновим синім забарвлюються в темно- синій колір, а еластичні волокна кислим фуксином - у червоний.

Крімцього,використовували імуногістохімічне дослідження з моноклональними антитілами (МКАТ) до білка проліферації Ki-67. Для проведення імуногістохімічних реакцій зрізи товщиною 4-5 мкм наносили на предметні скельця, попередньо оброблені адгезивної рідиною (poly-L- lysine), слідом за чим депарафінували згідно з прийнятими стандартами. Ми використовували нагрівання на водяній бані в цитратному буфері з pH = 6,0 (протягом 30 хв після досягнення температури 98°С) і автоклавування (5 хв при температурі + 121°С). Важливою умовою якісного імуногістохімічного дослідження є правильно підібраний титр антитіл, а також час і температура інкубації [9].

Оптимальною є інкубація при температурі 24°С протягом від 10 до 30 хв, в залежності від типу і розведення антитіл. МКАТ розводили згідно зі стандартними рекомендаціями: Ki-67 - 1 : 350. Як розчинник антитіл використовували розчин ANTIBODY DILUENT (DakoCytomation) [9, 10].

Для диференціювання структур тканини зрізи додатково забарвлювали гематоксиліном Майера протягом 3 хв. Дегідратація і включення в бальзам виконували відповідно до загальноприйнятих принципів [9].

Експресію Ki-67 оцінювали шляхом підрахунку відсотка забарвлених ядер на 1000 клітин окремо для епітелію, строми і лейоміоцитів.

Значення судинного ендотеліального фактора росту оцінювали також шляхом підрахунку площі експресії і оптичної щільності. Морфометричний

аналіз проводили за допомогою оптичного мікроскопа NikonEclipse E400, комп'ютера на базі IntelPentium 4 і програмного забезпечення «Відео- тест-Морфологія 5.0». Аналіз здійснювали при збільшенні »200.

Таблиця 1. ЗНАЧЕННЯ ЕКСПРЕСІЇ АНТИГЕНУ KI-67 У ДОСЛІДЖУВАНИХ ГРУПАХ

Примітка: * p<0,05 у порівнянні з контрольною групою жінок

Проводили статистичний аналіз отриманих даних за допомого пакету аналізу Microsoft Excel 2010. Результати досліджень було оброблено методами варіаційної статистики, для оцінки непараметричних показників, з визначенням критерію Фішера і критерія Стьюдента. У всіх випадках було визначено середнє арифметичне та стандартна помилка середнього.

Результати і обговорення

Вік обстежених жінок коливався від 27 до 53 років, середній вік складав 40,5 ± 1,1 років. При цьому третина пацієнток(32%)перебувалив перименопаузальному періоді (від 44 до 53 років), 68% - у репродуктивному періоді.

У пацієнток I досліджуваної групи було встановлено середній вік 38,2 ± 1,1 років. У клінічній картині переважали больовий синдром і порушення менструального циклу. У 18,8% жінок перебіг захворювання був безсимптомним. Скарги на періодичні болі в області малого тазу, що непов'язані з менструацією або статевим актом, пред'являли 81,3% (n = 13), дисменорея спостерігалась у 75% (n = 12), диспареунія у 68,8% (n = 11).

У пацієнток II досліджуваної групи середній вік складав 42,2 ± 1,1 роки. Скарги на періодичні болі в області малого тазу, що непов'язані з менструацією або статевим актом, пред'являли 66,6% (n = 12), дисменорея спостерігалась у 72,2% (n = 13), диспареунія у 61,1% (n = 11). При цьому 94,4% з них відзначали рясні кров'янисті виділення зі статевих шляхів під час менструацій, 77,7% - рясні кров'янисті виділення зі згустками, у 72,2% менструації тривали більше 7 днів. Міжменструальні кров'яні виділення відзначали 55,5% жінок.

У пацієнток III досліджуваної групи було встановлено середній вік 43,8 ± 1,1 рік. У клінічній картині переважали порушення менструального циклу. Дисменорея спостерігалась у 58,8% (n = 10), 94,1% відзначали рясні кров'янисті виділення зі статевих шляхів підчас менструацій, 76,4% - рясні кров'янисті виділення зі згустками, у 82,3% менструаціїтривалибільше7 днів.

Міжменструальні кров'яні виділення відзначали 58,8% жінок.

Окрім стандартного клініко-лабораторного обстеженняпацієнткам булопроведено ультразвукове дослідження органів малого тазу. У пацієнток I та II досліджуваних груп були виявлені наступні ознаки аденоміозу: збільшення передньо - заднього розміру матки у 97% пацієнток, асиметрія стінок матки 94,1%, наявність у міометрії гіперехогенних ділянок та ознак вертикальних смужок - у 91,1% жінок.

Після проведеного двухетапного оперативного втручання здійснено гістологічну оцінку матеріалу та проведено імуногістохімічне дослідження. Результат оцінювали як позитивний при випаданні солей хромогену саме в клітинах, причому у вигляді специфічної реакції (цитоплазматична або мембранна реакція).

Клітини, позитивні щодо експресії даного маркера, вивчали в 4-6 випадково обраних полях зору. Після підрахунку 300 гістологічно ідентифікованих об'єктів (ядер), обчислювали показники експресії за результатами всіх вивчених ділянок.

При оцінці імуногістохімічного забарвлення позитивна реакція з МКАТ до Кі-67 виявлялася коричневого кольору ядер клітин різного ступеня інтенсивності.

Експресія антигену Кі-67 в ядрах епітеліальних клітин залоз ендометріоїдних гетеротопій була позитивною, переважно в поверхнево розташованих гетеротопіях.

Експресія антигену Кі-67 була позитивна в ядрах епітеліальних клітин залоз вогнищ аденоміозу і в меншій мірі клітин цитогенної строми. Більше значення експресії зазначалося в епітелії залоз поверхнево розташованих гетеротопій - при аденоміозі І--ІІ ступенів, у порівнянні з іншими досліджуваними групами (табл. 1).

Таблиця 2. ЕКСПРЕСІЯ СУДИННОГО ЕНДОТЕЛІАЛЬНОГО ФАКТОРУ РОСТУ

Примітка: * p<0,001 у порівнянні з II досліджуваною групою

Позитивнаекспресіясудинногобазального шару ендометрію у матеріалах I та II ендотеліального фактора росту була виявлена в мембранах епітеліоцитів залоз вогнищ аденоміозу і досліджуваних груп.

При цьому більш виражене значення експресії було характерно для епітеліального компонента ендометріоїдних гетеротопій (табл. 2). У функціональному шарі ендометрію експресія цього маркера була відсутня.

Що стосується базального шару ендометрію, значення експресії судинного ендотеліального фактора росту було трохи вище в ділянках, що мають тенденцію до інвагінації у підлягаючий міометрій.

Відомо, що прогресування і зростання вогнищ аденоміозу відбуваються під впливом загального і локального гіперестрогенізму за участю місцево продукуючого фактору росту, а також судинного ендотеліального фактора росту [8]. При цьому, особливо у випадках інфільтративних форм ендометріозу, спостерігається збільшення проангіогенних і зниження антиангіогенної активності як у сироватці крові, так і в перитонеальній рідині. Встановлено, що надмірний ангіогенез сприяє імплантації еутопічного ендометрію [3, 4].

У результаті проведеного нами імуногістохімічного дослідження була виявлена експресія судинного ендотеліального фактора росту в базальному шарі ендометрію і в ендометріоїдних гетеротопій, що підтверджує значення і односпрямованість змін, що відбуваються в осередках аденоміозу і в базальному шарі еутопічного ендометрію при внутрішньому генітальному ендометріозі. Крім того, дослідження експресії антигену Кі-67, переважання проліферативних змін в епітелії залоз і клітинах цитогенної строми гетеротопій, розташованих у глибоких відділах міометрію, висока частота гіперпластичних процесів ендометрію показують значення проліферативної активності в ендометріоїдних гетеротопіях та в ендометрії при аденоміозі, у порівнянні з гіперпластичними процесами ендометрію.

Отже, з точки зору природи патологічних процесів аденоміоз можна вважати одним з варіантів патологічної регенерації.

Ймовірно, репарація ендометрію, що виникає у відповідь на його пошкодження будь-якого характеру (механічна травма, запальний процес) під впливом різних факторів - гормональних, генетичних, імунологічних, паракринних - супроводжується інвагінацією базального шару ендометрію.

Здатність до інвазивного росту, високий проліферативний і ангіогенний потенціал елементів ендометріоїдних гетеротопій визначає подальше прогресування процесу і поширення в глибокі відділи міометрію.

Висновки

Таким чином, на підставі отриманих даних, що свідчать про підвищення експресії білка проліферації Ki-67 і інтенсифікацію процесу неоваскуляризації у біоптатах ендометрію з підлягаючим міометрієм при аденоміозі та за умов поєднання аденоміозу з гіперпластичними процесами ендометрію, можна стверджувати, що маркери, що вивчалися, можуть використовуватися в якості діагностичних у виявленні аденоміозу, у тому числі асоційованого з гіперпластичними процесами ендометрію.

На даний час продовжуються дослідження по визначенню відповідних біомаркерів для ранньої діагностики ендометріозу, а також факторів ризику його виникнення і характеру рецидивів. Виявлення значних потенційних біомаркерів могло б бути корисним для клініцистів як для освітлення патогенезу ендометріозу, так і для моніторингу рецидивів.

Перспективою наших подальших досліджень у даному напрямку є вивчення інших маркерів прогресування аденоміозу з метою вдосконалення його ранньої діагностики на матеріалі, отриманому не тільки інвазивним шляхом, а й неінвазивним (сироватка крові), а також пошук методів діагностування доклінічної стадії захворювання.

Список літератури

маркер аденоміоз діагностика

1. Татарчук Т.Ф. Новые подходы к проблемным вопросам лечения генитального эндометриоза / Т.Ф. Татарчук, Н.Ф. Захаренко, Т.Н.Тутченко // Репродуктивная эндокринология. - 2013. - №3. - С. 36-42.

2. Cockerham A.Z. Adenomyosis: achallengein clinical gynecology / A.Z. Cockerham // J. Midwifery Womens Health. - 2012. - Vol. 57, № 3. - P. 212-220.

3. Besker C.M. [Angiogenesis and endometrioses] / C.M. Besker, J. Bartley, S. Mechsner // Zentralbl. Gynacol. -2004. - Vol. 126, № 4. - P. 252258. -German.

4. Сенчук А.Я. Деякі особливості внутрішнього ендометріозу / А.Я. Сенчук, І.І. Чермак // Тези доповідей ІХ конгресу світової Федерації Українського лікарського товариства. - Київ, 2012. - С. 133.

5. Aromatase and endometriosis / S.E. Bulun, Z. Fang, G. Imir [et al.] // Semin. Reprod. Med. - 2004. - Vol. 22. - P.45-50.

6. Мовтаева Х.Р. Клинико-морфологическая и иммуногистохимическая характеристика эндометриоза : автореф. дис. канд. мед. наук :14.01.01 / Х. Р. Мовтаева. - Москва, 2010. - 23 с.

7. Пат. №46489 Україна, МПК⁵ G01N 33/00. Спосіб кількісного визначення вмісту антигену в біологічних тканинах / Губіна-Вакулик Г. І., Сорокіна І. В., Марковський В. Д., Купріянова Л. С., Сидоренко Р. В. ; заявник та патентовласник Харківський національний медичний університет. - № u200906730 ; заяв. 26.06.2009 ; опубл. 25.12.2009. - Бюл. № 24. - 2 с.

8. Дамиров М. М. Генитальный эндометриоз: взгляд практикующего врача: монография / М. М. Дамиров, О. Н. Олейникова, О. В. Майорова. - Москва: Бином, 2013. - 152 с.

9. Diagnostic immunohistochemistry / ed. D. J. Dabbs. - [Edinburgh] : Churchill Livingstone, 2006. - 848p.

10. Колесник А. В. Клинические аспекты сочетания аденомиоза и гиперпластических процессов эндометрия у женщин репродуктивного возраста / А. В. Колесник // Здоровье женщины. - 2013. - № 4. - С. 109-111.

11. Vascular endothelial growth factor (VEGF) in endometriosis / J. Donnez, P. Smoes, S. Gillerot [et al.] // Hum. Reprod. - 1998. - Vol. 13. - P. 1686-1690.

12.Vascular endothelial growth factor A and C gene expression in endometriosis / M. Takehara, M. Ueda, Y. Yamashita [et al.] // Hum. Pathol. - 2004. - Vol. 35, № 11. - Р. 1369-1375.

Размещено на Allbest.ru