Порівняльна характеристика показників імуногістохімічних реакцій печінки плодів самок щурів з підгострим інфекційно-запальним процесом і плодів щурів з хронічною внутрішньоутробною гіпоксією

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Порівняльна характеристика показників імуногістохімічних реакцій печінки плодів самок щурів з підгострим інфекційно-запальним процесом і плодів щурів з хронічною внутрішньоутробною гіпоксією

Марковський В.Д., Наумова О.В., Сакал Г.О.

Марковський В.Д., Наумова О.В., Сакал Г.О. Харківский національний медичний університет (м. Харків)

Резюме. Дане експериментальне дослідження побудовано на вивченні показників експресії імуногістохімічних реакцій (Кі-67 в гепатоцитах та клітинах строми печінки, інтерстиційних колагенів І і ІІІ типів, CD68, ИЛ-6) в печінці плодів з ХВГ та пролонгованим запальним процесом у матерів, інфікованих Staphylococcusaureus, Esherichiacoliі Klebsiellapneumoniae. В досліджуваних групах знайдено однотипність змін імуногістохімічних реакцій: зменшення рівня експресії КІ-67 у гепатоцитах, підвищення експресії КІ-67 в клітинах строми, збільшенням показників оптичної щільності світіння обох видів інтерсти-ційних колагенів в стромі печінки, збільшення рівня експресії CD68та кількості клітин-продуцентов ИЛ- 6. Знайдені зміни імуногістохімічних реакцій свідчать про зниження проліферативної активності гепатоцитів і посилення склеротичних змін в стромальному компоненті печінки, і мають більш виражений характер при материнський інфекції. Показниками впливу пролонгованого інфекційно-запального процесу в матері на морфофукціональний стан печінки плодів на відміну ХВГ є значуще наростання вмісту МКАт до CD68 та клітин-продуцентів ІЛ-6. Найбільш виражені патоморфологічні зміни в підгрупах з материнською інфекцією реєструються в печінці плодів від самок щурів, інфікованих K. pneumoniae.

Ключеві слова: внутрішньоутробне інфікування, внутрішньоутробна гіпоксія, вагітні, плоди.

Abstract. The purpose of the research was to study the features of the immune morphological state of the liver of fetuses with chronic intrauterine hypoxia (CIH) and fetuses of infected mothers with subacute infectious and inflammatory processes in experiment conducted on animals. The livers of 44 fetuses of rats were used for morphological studies. Rats were divided into 5 groups: 3 experimental (EG1, EG2, EG3), comparison group (CG) and control (KG). EG1, EG2 and EG3 (n = 8, n = 10 and n = 10) include fetuses of pregnant female rats with subacute infectious and inflammatory processes in the abdominal cavity caused by reference strains of Staphylococcus aureus, Esherichia coli and Klebsiellapneumoniae. CG (n = 7) includes fetuses with chronic intrauterine hypoxia. KG (n = 9) - the fetuses from female rats with the physiological pregnancy. Expression of CD68 antigens for the identification of activated Kupffer macrophages was studied by an indirect immune peroxidase method using the DAKO EnVision visualization system (Denmark), the intensity of liver cell proliferation was evaluated using MKA to Ki-67. The reactions with the Ki-67 were evaluated as follows: (-) - negative reaction (colored cells were absent), (+) - weak reaction (positive coloration of separate cells, (++) - medium (higher content of intensive colored cells), (+++) - intense (intense coloration of almost all cells). The density of the location of activated Kupffer macrophages in 1mm2 was counted by video microscopic morphometry using the Olympus DP-Soft (Version 3: 1) and Microsoft Excel. Interstitial collagenes and IL6-producing cells were identified by Indirect Coons method in the Brosman M. modification with monoclonal antibodies (MKA) to collagen types I and III, and IL6- producing cells (Novocastra Laboratories Ltd, UK). The optical density of the immunofluorescence of collagens of I, III types in the conventional units of luminescence was determined. The number of IL-6 producing cells was counted in the field of view of x1000. The received digital data were processed by methods of mathematical statistics using variational, alternative analyzes. To determine the reliability of the results, Mann-Whitney-Wilcoxon's criterion was used.

A comparative analysis of the parameters of immunohistochemical reactions of the liver of fetuses in the group with CIH and subgroups of fetuses from females of rats with a subacute infectious and inflammatory process caused by S.aureus, E. coli and K. Pneumoniae was conducted. Unidirectional pathomorphological changes in the form of signs of dyscirculatory, alterative, regenerative and compensatory processes were identified. In subgroups with CIH these changes were more expressive in comparison with the CG. At immunohistochemical determination of MKA to Ki-67 in the studied subgroups the level of expression of nuclear protein in stromal cells of portal tract was increased and declined in hepatocytes in comparison with CG, which indicates inhibition of hepatogenesis. In immunohistochemical typing of collagen I and III types in the portal liver tract of fetuses of rats with intrauterine infection in comparison with the CG the optical density of the glow of both types of collagen was significantly increased. These changes are associated with additional stimulation of collagen formation in a prolonged infectious process of the mother. Reducing of the proliferative activity of hepatocytes and sclerotic changes in the stromal component of the organ may lead to the disruption of the adaptive capacity of the liver in subsequent ontogenesis. In the immunohistochemical study the content of MKA to CD68 and IL6-producing cells was significantly increased in contrast to the CG in subgroups with maternal infection. It indicates the effect of prolonged infectious- inflammatory process of the mother on the morphofunctional state of the liver of fetuses. The most expressed pathomorphological changes in subgroups with CIH were found in the liver of fetuses from female rats infected with K.pneumoniae.

Keywords. intrauterine infection, intrauterine hypoxia, pregnantwomen, fetuses.

Вступ. Наявність у вагітної жінки інфекційної патології (гострі та хронічні інфекційні захворювання верхніх дихальних шляхів, шлунково-кишкового тракту, сечостатевої системи і т.п.) є суттєвою причиною виникнення ускладнень під час вагітності та пологів, обумовлює в антенатальному періоді формування інфекційної патології плода, вроджених вад розвитку, фетоплацентарної недостатності й пов'язаної з нею хронічної внутрішньоутробної гіпоксії (ХВГ) та затримки внутрішньоутробного розвитку плоду [1, 2, 3]. За даними ряду дослідників серед чинників перинатального інфікування питому вагу складають бактерії, серед яких в даний час провідними є грамнегативні факультативно анаеробні бактерії: ешерихії, клебсієли, протей та інші поліформні бактерії, також частими збудниками залишаються стафілококі [3,4,5,6]. Доведено, що внутрішньоутробні інфекції мають здатність до тривалої персистенції в організмі і сприяють імунодепресії материнського і дитячого організму, а також розвитку відстроченої патології різних органів і систем [7].

Перинатальне інфікування і супроводжуюча його хронічна фетоплацентарна недостатність при несприятливій акушерської ситуації можуть обумовлювати виникнення хронічної гіпоксії плода и викликати різні циркуляторно-дистрофічні, дизонтогенетичні, запальні, імунні, регенераторні зміни плаценти, головного мозку, легенів, серцево-судинної системи, печінки, надниркових залоз, що може привести к зриву компенсаційно-адаптивних механізмів у в антенатальному та постнатальному періодах розвитку дитини [8,9]. Разом з тим, більшість досліджень щодо особливостей впливу ВУІ на стан печінки нащадків присвячені вивченню функціональних змін гепатобіліарної системи без урахування патоморфологічних чинників їх розвитку, що обумовлює актуальність визначення критеріїв оцінки тканинного морфогенезу печінки в умовах материнської інфекції для розуміння патогенезу її впливу на стан гепатобіліарної системи у нащадків та для патогенетично-обґрунтованої орієнтації при розробці нових підходів їх корекції. інфекційний патологія вагітність печінка

Мета дослідження: в експерименті на тваринах вивчити особливості імуноморфологічного стану печінки плодів з хронічною внутрішньоутробною гіпоксією та плодів інфікованих матерів з підгострим інфекційно-запальним процесом.

Методи дослідження: Дослідження проведено в рамках науково-дослідної роботи кафедри патологічної анатомії Харківського національного медичного університету «Вплив плодово-матерінської інфекції на ембріогенез та фетогенез нащадків (клініко-морфологічне дослідження)» (№ державної реєстрації 0115U000987).

На базі експериментальної біологічної клініки Харківського національного медичного університету, проводилося два експериментальних дослідження на щурах лінії WAG із суворим дотриманням вимог Європейської конвенції (Страсбург, 1986) з утримання, годівлі та догляду за піддослідними тваринами, а також виведенню їх з експерименту й подальшої утилізації.

Матеріалом для морфологічного дослідження послужила печінка 44 плодів самок щурів, що були поділені на 5 груп: 3 експериментальних (ЕГ1, ЕГ2, ЕГ3), групу порівняння (ГП) і контрольну (Ке). У ЕГ1, ЕГ2 і ЕГ3 (n=8, n=10 і n=10), увійшли плоди від вагітних самок щурів з підгострим інфекційно - запальним процесом в черевній порожнині, змодельовані з використанням відповідно референс-штамів Staphylococcusaureus, Esherichiacoliі Klebsiellapneumoniae [10]. Оскільки ВУІ плода часто супроводжується фетоплацентарної недостатністю й хронічною внутрішньоутробною гіпоксією плода [11], групу порівняння (n=7) склали плоди з ХВГ від вагітних самок щурів, які протягом всієї вагітності піддавалися щоденній високогірній гіпоксії [12]. КГ (n=9) склали плоди від вагітних самок щурів з фізіологічним перебігом вагітності.

Для імуногістохімічного методу дослідження використовували 2 методи - непрямий імунопероксидазний метод і непрямий метод Кунса в модифікації Brosman M. [13]. Непрямим імунопероксидазним методом з використанням системи візуалізації DAKOEnVision (Данія) вивчена експресія CD68 антигенів для ідентифікації активованих макрофагів Купфера, за допомогою МКАт до Ki-67 оцінювалася інтенсивність проліферації клітин печінки. Для оцінювання ІГХ реакцій з Ki-67 інтенсивність реакції оцінювалася таким чином: (-) - негативна реакція (забарвлені клітини відсутні), (+) - слабка реакція (позитивне забарвлення окремо розташованих клітин, (++) - помірна (більший вміст інтенсивно пофарбованих клітин), (+++) - інтенсивна (інтенсивно забарвлені майже всі клітини). Шляхом відеомікроскопіческой морфометрії з використанням програми OlympusDP-Soft (Version3: 1) і Microsoft Excel підраховували щільність розташування активованих макрофагів Купфера в 1мм2. Непрямим методом Кунса в модифікації Brosman M. на парафінових зрізах товщиною 5-6мкм виявляли інтерсти-ційні колагени та клітини-продуценти ІЛ-6 за допомогою моноклональних антитіл (МКАт) до колагенів I, III типів та клітин-продуцентів ІЛ-6 фірми Novocastra Laboratories Ltd, UK. Як люмінесцентну мітку використовували Fab-2-фрагменти кролячих антитіл проти імуноглобулінів миші, мічені ФІТЦ (флуоресцеїну ізотіоціанат). Препарати вивчали в люмінісцентному мікроскопі «Axioskor40» (Carl Zeiss, ФРН). Визначення оптичної щільності імунофлюоресценції колагену I, III типів здійснювали за допомогою методу Губіной-Вакулік з співавт. [12] І виражали в умовних одиницях світіння (ум. од. св.). Підраховувалась кількість клітин-продуцентів ІЛ-6 в полі зору х1000. Кількісні та якісні показники експресії відповідних маркерів вивчали не менше, ніж в 10 випадково обраних полях зору мікроскопа при збільшенні х100, х200, х400 і х1000 в залежності від необхідності. Отримані цифрові дані піддані статистичній обробці з використанням варіаційного, альтернативного аналізів з обчисленням середньої арифметичної, середньоквадратичного відхилення, середньої помилки середньої арифметичної, достовірності різниці [14]. Для визначення достовірності результатів використовували критерій Манна-Уїтні-Уилкоксона.

Результати та їх обговорення. При імуногістохімічному дослідженні проліферативна активність гепатоцитів в Ке носила помірний характер (++), стромальних клітин - слабкий (+). У групі порівняння та експериментальних групах відзначалося зменшення рівня експресії МКАт до Ki-67 в гепатоцитах, який оцінювався як слабкий (+), що відображає зниження проліферативного потенціалу печінкових клітин плоду в умовах ХВГ та інфекційного процесу у матері. У клітинах строми, в тому числі фібробластах портальних трактів, у групах з ХВГ і ВУІ рівень експресії Ki-67 збільшувався та оцінювався як помірний (++), що пов'язано, мабуть, зі стимулюючою дією хронічної гіпоксії, що має місце, як в групі з «чистою» ХВГ, так і в експериментальних групах.

Стимуляція проліферативної і синтетичної активності фібробластів в умовах хронічної гіпоксії у групі порівняння і експериментальних групах приводила до посилення синтезу колагенових волокон в стромальному компоненті печінки з накопиченням їх в периваскулярній і перидуктальній сполучній тканини портальних трактів з розширенням останніх. При аналізі показників оптичної щільності імунофлюоресценції інтерстиційних колагенів І і ІІІ в печінці плодів щурів досліджуваних груп (табл. 1) при ХВГ і ВУІ в порівнянні з Ке відзначається достовірно збільшення вмісту обох видів колагенів з превалюванням незрілого колагену ІІІ типу, причому в групах з експериментальною ВУІ показники достовірно перевищують аналогічні в групі з ХВГ, досягають максимального значення в групі з клебсієльозною інфекцією у матері.

Таблиця 1. Показники оптичної щільності імунофлюоресценції інтерстиційних колагенів в печінці плодів досліджуваних груп, усл.од.св., (М±т)

Рівні значущості різниці: Р <0,05 - різниця достовірна; Р> 0,05 - різниця не достовірна.

В судинній базальній мембрані великих судин зазначається поява колагену ІІІ типу. Виявлене при ХВГ і ВУІ збільшення вмісту інтерстиційних колагенів обумовлене перш за все хронічною гіпоксією, а при материнській інфекції - додатковою стимуляцією колагеногенезу в умовах не компенсованою відновними процесами деструкції гепатоцитів і активації фібробластів під дією токсинів і антигенних факторів інфекційних агентів, що в подальшому онтогенезі може привести до розвитку склеротичних змін в печінці [15,16].

Клітини Купфера є резидентними макрофагами печінки, беруть участь в здійсненні внутрішньоорганної імунної відповіді за допомогою елімінації шкідливих мікроорганізмів або чужорідних об'єктів, видаленні зруйнованих клітин і клітинних уламків, підготовці тканини до регенерації, а також в гострій і хронічній відповіді печінки на дію токсичних сполук [17,18]. Імуногістохімічне дослідження рівня експресії МКАт до CD68 в групі порівняння і експериментальних групах виявило зміну щільності клітин, що прореагували в порівнянні з групою контролю (табл.2).

Таблиця 2. Показники щільності розташування купферівських клітин в печінці плодів досліджуваних груп, на 1 мм 2, (М±т)

Рівні значущості різниці: Р <0,05 - різниця достовірна; Р> 0,05 - різниця не достовірна.

Аналіз даних таблиці показав, що в ГП щільність розташування CD68 в печінці плодів щурів достовірно наростала у порівнянні з показником Ке, вірогідно внаслідок реактивної проліферації макрофагів у відповідь на деструктивні зміни, що розвивалися при ХВГ. В експериментальних групах рівень вмісту CD68 був значимо вищим у порівнянні з ГП, оскільки при розвитку плода в умовах внутрішньоутробного інфікування купферівські клітини не тільки беруть участь в фагоцитозі клітин, які загинули в результаті дії гіпоксичного фактора, але і здійснюють елімінацію токсинів і антигенних факторів інфекційних агентів. Найбільш високий показник щільності клітин, що прореагували, спостерігався у групі плодів від самок щурів з клебсієльозною інфекцією, що свідчить про більш важке ураження печінки у плодів цієї групи.

ИЛ-6є багатофункціональним цитокіном, який секретується як лімфоїдними, так і нелімфоїдними клітинами. Він відіграє ключову роль в імунній реакції, кровотворенні і є важливим цитокіном в проліферації і диференціації клітин. ІЛ-6 відноситься до прозапальних цитокінів, є регулятором природного імунітету і бере участь в неспецифічної захисту організму від бактеріальних і вірусних інфекцій [19]. Імуногістохімічне дослідження експресії МКАт до ИЛ-6 не визначило клітин-продуцентів ІЛ-6 в печінці плодів Ке, у ГП в полі зору їхня кількість складала 0-1 екземпляр, в середньому - 0,19±0,007 клітин у полі зору. В експериментальних групах кількість клітин, що продукували ИЛ-6 достовірно зростала у порівнянні з ГП. У ЕГ1 і ЕГ2 в полі зору визначалося 0-4 клітини-продуцента ИЛ-6, середня кількість - 2,03±0,13 (р<0,05) і 2,41 (р<0,05) відповідно. У ЕГ3 в полі зору нараховувалося 1-7 клітин, в середньому - 4,81 (р<0,05) екземплярів. При цьому значення цього показника у групі ЕГ3 було також значуще вище у порівнянні з аналогічними у ЕГ1 та ЕГ2, що свідчить про більшу активність запального процесу при інфекційному процесі, викликаному Klebsiellapneumoniae.

Виводи:

1. При імуногістохімічному визначенні МКАт до Ki-67 в порівнянні з Ке у ГП та досліджуваних підгрупах наростає рівень експресії ядерного білка в стромальних клітинах портальних трактів і знижується в гепатоцитах, що свідчить про гальмування їхньої проліферативної активності.

При імуногістохімічному типуванні колагену І і ІІІ типів в зонах портальних трактів печінки плодів щурів з материнською інфекцією та ХВГ наростають значення оптичної щільності світіння обох типів колагену, але в ЕГ1-ЕГ3 в порівнянні з ГП вони значуще більші, що пов'язано з дією хронічної гіпоксії та додатковою стимуляцією утворення колагену в умовах пролонгованого інфекційного процесу у матері. Зниження проліферативної активності гепатоцитів і посилення склеротичних змін в стромальному компоненті органу може призвести до зриву адаптаційних можливостей печінки в подальшому онтогенезі.

На відміну від ГП в групах з материнською інфекцією при імуногістохімічному дослідженні різко наростає вміст МКАт до CD68та клітин-продуцентів ІЛ-6, що є показниками впливу пролонгованого інфекційно-запального процесу в матері на морфофукціональний стан печінки плодів. В підгрупах з ВУІ найбільш виражені зміни імуногістохімічних реакцій реєструвалися в печінці плодів від самок щурів, інфікованих K.pneumoniae.

Список літератури

1. Kemp M.W. Preterm birth, intrauterine infection, and fetal inflammation / M.W. Kemp // Frontiers in Immunology. - 2014. - Vol. 5. - P. 1-11. Australia

2. Eukaryote' Made Thermostable DNA Polymerase Enables Rapid PCR'Based Detection of Mycoplasma, Ureaplasma and Other Bacteria in the Amniotic Fluid of Preterm Labor Cases / T. Ueno, H. Niimi, N. Yoneda [et al.] // PLoS One. -- 2015. -- Vol. 10. -- P. e0129032. UNITED STATES.

3. Gnatko O.P. vnytriytrobni infekcii/ O.P. Gnatko, N.G. Skyriatina// Imynologiataalergologia: naykaIpraktuka. - 2015. №1. - S. 74-78. Ukrainian.

4. Косенкова, Е. Г. Инфекции специфичные для перинатального периода (внутриутробные инфекции): распространенность, этиопатогенез и диагностика / Е. Г. Косенкова, И. М. Лысенко, Л. Н. Журавлева // Охрана материнства и детства. - 2011. - № 2 (18). - С. 18-25.

5. Жабченко И.А. Особенности функционирования и факторы вирулентности уропатогенных штаммов Esherichiacoliи их значение в клинической практике / И.А. Жабченко // Здоровье женщины. --2013. -- № 1. -- С. 114--116.

6. Roca A 1, Bojang A, Camara B, Oluwalana C, Lette K, West P, D'Alessandro U , Bottomley C Maternal colonization with Staphylococcus aureus and Group B streptococcus is associated with colonization in newborns. ClinMicrobiol Infect. 2017 Dec; 23(12): 974-979.

7. Т. Л. Гуцул с соавт., 2011. Евсюкова ИИ, Королева ЛИ. Актуальные проблемы диагностики и лечения внутриутробной хламидийной инфекции. Педиатрия. 2003;2:82-87

8. Шевченко Л.И. Влияние гипоксических состояний различного генеза на развитие плода и течение раннего неонатального периода у новорожденных / Л.И. Шевченко, Т.К. Знаменская, Е.В. Розова // Неонатологія, хірургія та перинатальна медицина.. - 2011. - Т. І, № 1. - С. 113-118.

9. Плитень О.Н. Влияние хронической антенатальной гипоксии и имеющихся у матери хронических инфекционных заболеваний различных органов и систем на гистологические особенности тимуса плодов и новорожденных / О.Н. Плитень // Експериментальна і клінічна медицина. - 2015. - №2 (67). - С. 38-43.

10. Патент на винахід Спосіб моделюваннявнутрішньоутробного інфікування плода та новонародженого як наслідку підгострогоінфекційно-запального процесу матері / В.Д. Марковський, І.В. Сорокіна, М.С. Мирошниченко, О.М. Плітень, М.М. Мішина, А.С. Шапкін, О.В. Калужина (UA).№ а 2014 00681; заявл. 24.01.2014; опубл. 10.06.2014, Бюл. № 11.

11. Плитень О.Н. Влияние хронической антенатальной гипоксии и имеющихся у матери хронических инфекционных заболеваний различных органов и систем на гистологические особенности тимуса плодов и новорожденных / О.Н. Плитень // Експериментальна і клінічна медицина. - 2015. - №2 (67). - С. 38-43.

12. Пат.накорисну модель 88459 Україна, МПК G09B23/28. Спосіб моделювання внутрішньоутробної гіпоксії з асфіксією новонародженого в пологах / В.Д. Марковський, І.В. Сорокіна, Г.І. Губіна-Вакулик, О.А. Омельченко, О.В. Кихтенко, М.С. Мирошниченко, О.М. Плітень(UA). - № u2013 13681; заявл. 25.11.2013; опубл. 11.03.2014. Бюл. № 5.

13. Berhan Y. A meta-analysis of selected maternal and fetal factors for perinatal mortality / Y. Berhan, A. Berhan// Ethiop. J. Health Sci. - 2014. - Vol. 24, (l). - P. 55-68.

14. Лапач С.Н. Статистические методы в медико-биологических исследованиях с использованием Excel/ С.Н. Лапач, А.В. Чубенко, П.Н. Бабич. К.: Морион, 2000. - 320.

15. Туманский В.А. Цирроз печени: пути прогрессии и возможности репаративной регенерации / В.А. Туманский, А.С. Тугушев, Ю.А. Шебеко // Патология. - 2009. - Т.9, №3. - С.17-25.

16. Фадеенко Г.Д. Патогенетические механизмы фиброза печени. Инновационные диагностические и прогностические критерии /Г.Д.Фадеенко, Н.А.Кравченко //Укр. терапевтичний журнал.- 2010.- №1.- С.19-26.

17. Cubero, F.J. Kupffer cells and alcoholic liver disease. / F.J. Cubero, N. Nieto //Rev EspEnferm Dig. 2006. - V.98, №6. - P. 460-472, 46;

18. Roberts, R.A. Role of the Kupffer cell in mediating hepatic toxicity and carcinogenesis. / R.A. Roberts, P.E. Ganey, C. Ju, et al. / /Toxicol Sci. - 2007. - 96. - №1. - P. 2-15. R. Bataller, D.A. Brenner Liver fibrosis. J. Clin. Invest. 115:209-218 (2005).

Размещено на Allbest.ru