Вивчення морфометричних характеристик капілярної сітки на пізніх етапах субкутанної імплантації пористого волокнистого матриксу

Размещено на http://www.Allbest.Ru/

ДВНЗ

Івано-Франківський національний медичний університет

Кафедра хірургічної стоматології

Вивчення морфометричних характеристик капілярної сітки на пізніх етапах субкутанної імплантації пористого волокнистого матриксу

Пантус А.В., к.м.н., доцент

м. Івано-Франківськ

Анотація

Проблема, що стоїть перед тканинною інженерією полягає в тому, щоб оптимізувати виділення, розмноження і диференціювання клітин, сконструювати матрикси або системи доставки, сприяючи підтримці, координації регенерації тканин у трьох вимірах. Одним із важливих критеріїв, який повинен враховуватись при конструюванні матриксу - його здатність підтримувати стабільну гемодинаміку всередині та навколо каркасу. Мета дослідження - експериментально оцінити характер розвитку судинної сітки на пізніх етапах субкутанної імплантації біополімерного волокнистого матриксу.

Дослідження проводилось на 20 лабораторних тваринах (кролі), які були поділені на 2 групи. Першій групі порівняння: 10-ом тваринам проводилось оперативне втручання, яке включало формування «кишені» в підшкірній клітковині та накладання швів. Другій групі: 10-ом тваринам проводилась підшкірна імплантація біополімерного матриксу в ділянку спини між лопатками. Для дослідження брали 9 сегментів: один центрально розташований і по 4 сегменти з парацентральної та з периферичної зон.

Статистичний аналіз результатів здійснено за допомогою комп'ютерних програм Microsoft Excel та Statistica 5.5 (Multiple Regression) із використанням методів варіаційної статистики, кореляції.

Отримані результати свідчать про відсутність як гострої, так і хронічної реактивної запальної інфільтрації, а також як гострої, так і хронічної реакції відторгнення імплантата як чужорідної субстанції у імплантованій ділянці тварини. Створений нами волокнистий матрикс завдяки своїй гігроскопічності та пористості створює своєрідний місток для проростання та розвитку капілярної сітки.

Ключові слова: імплантація, стоматологія, біополімер, біоімплантат, судинна сітка.

Summary

The study of the morphometric features of capillary network after three months of porous fiber matrix implantation

Pantus A.V.,PhD, ass. professor, Department of surgical dentistry Ivano-Frankivsk National Medical University

The problem facing tissue engineering is to optimize the selection, reproduction and differentiation of cells, to construct matrices or delivery systems, contributing to the maintenance, coordination of tissue regeneration in three dimensions. One of the important criteria that must be taken into account when constructing a matrix is its ability to maintain a stable hemodynamics inside and around the framework. The purpose of the study is to experimentally evaluate the development of the vascular net after three months of subcutaneous implantation of the biopolymer fibrous matrix.

The research was carried out on 20 lab animals (rabbits), which were divided into two groups. The first group: surgical intervention was performed to 10 animals, which included the creation of the pocket in the subcutaneous adipose tissue and suturing. The second group: the implantation of the biopolymer matrix into the area between the shoulder blades was performed to 10 animals. The month after the matrix with the underlying tissues was removed. It was divided into 25 parts for histological examination. 9 segments were chosen for analysis: the one from centrally located area, four segments from precentral and four ones from peripheral zones.

The histological slides were examined lightoptically with the help of the microscope Leica DME with different magnifications. The morphometric features were analyzed using the system for taking microscopic pictures of histological samples (microscope Leica DME and digital camera Nikon P5100) and by using the program ImageTool 2.0 for Windows. The research were conducted at the Department of Pathomorphology and Legal Medicine of Ivano-Frankivsk National Medical University.

Statistical analysis was performed with the aid of PC programs Microsoft Excel and Statistica 5.5 (Multiple Regression) using the methods of variation statistic and correlation.

By using a freezing microtome the slides 30-50 nm were made, then were dehydrated in alcohols of different concentrations, soaked in methyl salicylate and fixed in polystyrene. Afterwards, the slides were examined with the microscope MPS-6. The results display the absence of acute or chronic inflammatory infiltration as well as no transplantation rejection. The fiber matrix made by us, creates a peculiar bridge for germination and development of capillary network due to its hygroscopicity and sponginess.

Key words: implantation, dentistry, biopolymer, bioimplant, vascular mesh.

Постановка проблеми і аналіз останніх дослідження

На даний час у медицині та біоінженерії з кожним роком зростає інтерес до біополімерів. Матеріали в тканинній інженерії для створення біоімплантатів, повинні володіти спектром спеціальних властивостей і надавати інженерним або мікроінженерним конструкціям характеристик, властивих живим тканинам, а саме: здатність до самовідновлення, здатність змінювати будову і властивості в відповідь на фактори навколишнього середовища [1]. Проблема, що стоїть перед тканинною інженерією, полягає в тому, щоб оптимізувати виділення, розмноження і диференціювання клітин, сконструювати каркаси або системи доставки, сприяючи підтримці, координації регенерації тканин у трьох вимірах [2, 3]. Одним із важливих критеріїв, який повинен враховуватись при конструюванні матриксу - це його здатність підтримувати стабільну гемодинаміку всередині та навколо каркасу. Стабільність гемодинаміки та відповідно життєздатність тканин буде залежати передусім від характеру розвитку капілярної сітки всередині скафолда [4, 5].

Мета дослідження. Експериментально оцінити характер розвитку судинної сітки на пізніх етапах субкутанної імплантації біополімерного волокнистого матриксу.

Матеріали та методи дослідження. Запропоноване дослідження є фрагментом НДР «Комплексна оцінка та оптимізація методів прогнозування, діагностики та лікування стоматологічних захворювань у населення різних вікових груп» (№ держ- реєстрації 0114и001788).

Для проведення досліджень було використано розроблений нами волокнистий матрикс із гранул 100% чистого полілактиду. Матрикс розробляли методом фазового розділення полімеру. Товщина волокнистого матриксу в середньому становила 30 мм. Діаметр волокон становив від 1 мкм до 10 мкм.

Вище вказані матрикси піддавались гамма стерилізації. Герметично запаковані в подвійну упаковку для стерилізації скафолди рівномірно вкладались під електронний пучок з енергією частинок 4 мега електрон вольт (МеВ) і протяжністю імпульсів 4,5 мікросекунд (мкс). Кожен пакет «Мегїісот» стандартизований EN 868-5, 180 11140-1, 180 11607-1, в який був запакований полімер товщиною 0,6 мм. При опроміненні кількість імпульсів змінювалась від 4-70. Стерилізація відбувалась за наступними параметрами: частота роботи прискорювача складала 250 Гц, максимальна енергія електронів становила 5 МеВ, максимальна потужність пучка становила 5 кВт, тривалість імпульсів 4,5 мкс, імпульсний струм до 1,5 А, потужність гальмуючого випромінювання на відстані 1 м від мішені становила - 104 Р/сек. Доза опромінення об'єкта становила до 50 кГр з розрахунку об'єму та щільності матеріалу. Згідно норм максимально допустима доза 50 кГр, при максимальній енергії електронів 5 МеВ. Обробка електронами з енергією менше 10 МеВ не викликала ядерних трансмутацій, тобто не призводила до виникнення радіоактивних ізотопів і не створювала залишкового радіаційного фону об'єкту.

Після стерилізації біополімерні матрикси хірургічним шляхом імплантувались під шкіру лабораторної тварини. Дослідження проводилось на 20 лабораторних тваринах (кролі), які були поділені на 2 групи. Першій групі порівняння: 10-ом тваринам проводилось оперативне втручання, яке включало формування «кишені» в підшкірній клітковині та накладання швів. Другій групі: 10-ом тваринам проводилась підшкірна імплантація біополімерного матриксу в ділянку спини між лопатками. Через 3 місяці хірургічним шляхом матрикс разом із прилеглими тканинами видалявся з тіла тварини.

Всі маніпуляції з експериментальними тваринами проводили з дотриманням правил відповідно до «Європейської конвенції про захист хребетних тварин, що використовуються для дослідних та інших наукових цілей» [6].

Для здійснення загального гістологічного дослідження матрикс з оточуючими тканинами розсікали взаємно перпендикулярними розрізами на 25 однакових сегментів. Для дослідження брали 9 сегментів: один центрально розташований і по 4 сегменти з парацентральної та з периферичної зон. Отримані ділянки імпланту фіксували у 10% розчині нейтрального формаліну (Р^7,0). Час фіксації складав 24 години. В подальшому шматочки досліджуваних органів поміщали в висхідну батарею спиртів для дегідратації, далі у хлороформ, суміш хлороформ-парафін (1:1), парафін (при температурі 37°С). Після парафінової препідготовки, шматочки заливали в парафін. Виготовлення серійних парафінових зрізів товщиною 4-6 мкм проводилося на санному мікротомі. Забарвлення препаратів здійснювалося гематоксиліном і еозином [7].

Гістологічні препарати досліджувались світлооптично на мікроскопі Leica DME під різними збільшеннями об'єктива й окуляра. Морфометричні показники визначали за допомогою системи для отримання мікроскопічних зображень гістологічних мікропрепаратів (мікроскоп Leica DME та цифрова фотокамера "Nikon P5100") та програми аналізу зображень Image Tool 2.0 for Windows на кафедрі патоморфології та судової медицини Івано-Франківського національного медичного університету. Статистичний аналіз результатів здійснено за допомогою комп'ютерних програм Microsoft Exel та Statistica 5.5 (Multiple Regression) із використанням методів варіаційної статистики, кореляції.

судинний субкутанний імплантація волокнистий матрикс

Результати дослідження

При патоморфологічному дослідженні кровоносної системи периферичної ділянки імплантованих волокнистих полімерних матриксів тримісячного терміну у пухкому та компактному шарі сполучнотканинних волокон візуалізуються судини площею перерізу 3480,68 +3,56мкм², товщиною стінки 13,5+1,22 мкм. Згідно даних морфометричного дослідження, на 1 переріз судини припадає 90988,20+4,67 мкм² площі сполучної тканини (Рис. 1).

Рис. 1. Судини сполучної тканини периферичної зони. Забарвлення: гематоксилін та еозин. Об. 10, ок. 10

Поміж сполучнотканинними волокнами парацентральних зон волокнистого матриксу візуалізуються різного калібру судини середньою площею поперечного перерізу 4524,9+2,79мкм². Здебільшого судини за типом капілярів, артеріол (на один переріз судини припадає 84875,36+4,87 мкм² площі сполучної тканини), які мають округлий поперечний переріз, товщину стінки 7,0+1,04 мкм, у просвіті містять невелику кількість еритроцитів, ядра ендотеліоцитів овальної форми, з гомогенним хроматином.

Деякі судини за типом дрібних артерій, вен. В артеріях візуалізуються концентрично розташовані гладкі міоцити у кілька шарів, просвіт судин незначний. У венах дрібного калібру просвіт розширений, заповнений еритроцитами, ядра ендотеліоцитів овальні, витягнуті вздовж периметру судин, базальна мембрана чітка, гомогенна.

У сполучній тканині центральних зон імпланта відзначаються судини різного калібру: капіляри, артеріоли, венули (Рис.2.). Середня площа поперечного перерізу судин становить 6040,34+3,19мкм², товщина стінки - 6,28 +1,26 мкм. За даними морфометричного дослідження, на один переріз судини припадає 85014,29 +4,32 мкм² сполучної тканини.

У окремих поодиноких ділянках у сполучній та жировій тканинах міжволокнистих просторів імпланту виявляється вогнищева клітинна інфільтрація, яка представлена переважно лімфоцитами, в меншій мірі макрофагами. Місцями дана інфільтрація має периваскулярний характер.

Рис. 2. Судини сполучної тканини центральної зони. Забарвлення: гематоксилін та еозин. Об.10, ок. 10

На основі проведених досліджень встановлено, що стан капілярної сітки, яка оточує та пронизує волокна біополімерного матриксу, практично не відрізнявся від тварин контрольної групи. Невелика різниця стосувалась показників площі поперечного перерізу судин. В основній групі дані показники були дещо більшими, ніж у контрольній, що може бути пов'язано з більш посиленим синтезом сполучної тканини та адаптаційними механізмами спрямованими на виведення продуктів гідролізу полімеру. Зменшення показників площі сполучної тканини на один переріз судини від периферії до центру вказує пропорційний з усіх напрямків характер регенерації від периферії до центру.

Аналіз периферичної, парацентральної та центральної зон імплантованого волокнистого матриксу в тварин основної групи показав зростання площі поперечного перерізу судин від периферії до центру, що може свідчити про активне протікання біосинтетичних процесів у центральних відділах волокнистого матриксу, а відсутність ознак руйнування капілярів свідчить про відсутність накопичення продуктів гідролізу матеріалу і його своєчасне виведення із центральної зони.

Висновки

1. Відсутність значної кількості нейтрофільних лейкоцитів, збільшеної кількості макрофагів і лімфоцитів свідчить про відсутність як гострої, так і хронічної реактивної запальної інфільтрації, а також як гострої, так і хронічної реакції відторгнення імплантат як чужорідної субстанції в імплантованій ділянці тварини.

2. Створений нами волокнистий матрикс завдяки своїй гігроскопічності та пористості створює своєрідний місток для проростання та розвитку капілярної сітки.

References

1. Olesova V.N., Dovbnev V.A., Evstratov O.V., Zveryaev A.G., Zuev M.D., Lesnyak A.V. [i dr.]. Preimuschestva vremennyih nesyemnyih frezerovannyih i polimerizovannyih plastmassovyih protezov na im- plantatah. Klinichiskie issledovaniya. 2013;1:25-26. [in Russian].

2. Andryushechkina T.N., Berchenko G.N., Gioeva Y.U.A., Zoryan E.V., Atrushkevich V.G. Vliyanie kompleksnyih antigomotoksicheskih preparatov na tkani parodonta v aktivnom periode ortodonticheskogo lecheniya: eksperimentalno-morfologicheskoe i klinich- eskoe issledovanie. Klinicheskaya stomatologiya. 2015; 4: 42-49. [in Russian].

3. Balin V.N., Balin D.V., Iordanishvili A.K., Muzyikin M.I. Osteostimuliruyuschee deystvie ksenogennogo kostnogo materiala na reparativnyiy osteogenez (eksperimentalno-morfologicheskoe issledovanie). Stomatologiya. 2015; 94(2): 5-9 [in Russian].

4. Hayashi C.H., Gudino C.V., Gibson F.C. 3rd, Genco C.A. Review: Pathogen-induced inflammation at sites distant from oral infection: bacterial persistence and induction of cells specific innate immune inflammatory pathways. Mol. Oral. Microbiol. 2010; 5(25): 305-316.

5. Deev R.V., Isaev A.A., Kochish A.Y.U., Tihilov R.M. Kletochnyie tehnologii v travmatologii i ortopedii: puti razvitiya. Kletochnaya transplantologiya i tkanevaya injeneriya. 2016; 3(6): 22-33 [in Russian].

6. Poriadok provedennia naukovymy ustanovamy doslidiv, eksperymentiv na tvarynakh. Ofitsiinyi visnyk Ukrainy. Ofits. vyd. 2012; 24:82 [in Ukrainian].

7. Bahrii M.M., Dibrova V.A., Popadynets O.H., Hryshchuk M.I. Metodyky morfolohichnykh doslidzhen: monohrafiia. Vinnytsia: Nova knyha. 2016. 328 p. [in Ukrainian].

Размещено на allbest.ru