Амінокислоти крові та органічні кислоти сечі у визначенні метаболічного статусу при перинатальному гіпоксично-ішемічному ураженні

Размещено на http://www.allbest.ru/

Амінокислоти крові та органічні кислоти сечі у визначенні метаболічного статусу при перинатальному гіпоксично-ішемічному ураженні

Г.О Яновська, О.Я. Гречаніна, Ю.Б. Гречаніна, Харківський національний медичний університет МОЗ України

Резюме

Гіпоксично-ішемічні ураження (ГІУ) головного мозку є частою причиною інвалідизації та дезадаптації дітей. Роль і взаємодія метаболічних шляхів у механізмах їх розвитку ясні ще не до кінця.

Мета роботи: вивчити зміни рівнів амінокислот (АК) крові та органічних кислот (ОК) сечі при перинатальному гіпоксично-ішемічному ураженні головного мозку.

Матеріали та методи: обстежено 117 новонароджених з ГІУ (із них 60 в гострому періоді - у віці до 1 місяця, і 57 в ранньому відновному періоді - у віці 1 - 4 місяці), та 35 відносно здорових новонароджених. Всім дітям проведено дослідження вільних АК крові методом високоефективної рідинної хроматографії.

У 98 дітей з ГІУ визначені ОК сечі методом газової хроматографії - мас-спектрометрії.

Аналіз амінокислот крові виявив: в гострому періоді ГІУ - підвищення рівнів АК, які є медіаторами (глутамат, р = 0,001, гліцин, р = 0,038), а також метіоніну (р = 0,015) і АК, що залучені до енергетичного метаболізму та підтримці постійного рівню глюкози крові: аланін (р = 0,001), треонін (р = 0,028), валін (р = 0,01), лейцин (р = 0,021); зниження рівнів триптофану (р = 0,0001) і тирозіну (р = 0,015), які є попередниками нейромедіаторів. У ранньому відновному періоді ГІУ більш часто відмічались зміни АК циклу сечовини, зниження валіну. При аналізі ОК сечі найчастіше зміненими були метаболіти циклу Кребса та дихального ланцюга (більш ніж 70% випадків), а також метаболіти АК з розгалуженим ланцюгом (більше за 60% випадків), що залучені до енергетичного та вуглеводного метаболізму. Виявлені кореляцій між змінами рівнів ОК в сечі та АК в крові.

Аналіз АК крові після перинатальної гіпоксії-ішемії виявив найбільш часті зміни рівнів АК, залучених до енергетичного, нейротрансмітерного метаболізму, детоксикації аміаку. Серед ОК сечі найчастіше були змінені метаболіти циклу Кребса та АК, залучених до енергетичного метаболізму. Робота демонструє наявність кореляцій між АК крові та ОК сечі, доцільність їх дослідження для оцінки метаболічного статусу після перинатальної гіпоксії.

Ключові слова. Перинатальний, гіпоксично-ішемічне ураження, амінокислоти, органічні кислоти.

Резюме

Аминокислоты крови и органические кислоты мочи в определении метаболического статуса при перинатальном гипоксически-ишемическом поражении

А.А. Яновская, Е.Я. Гречанина, Ю.Б. Гречанина Харьковский национальныймедицинский университет

Введение. Гипоксически-ишемические поражения (ГИП) головного мозга являются частой причиной инвалидизации и дезадаптации детей.

Роль и взаимодействие метаболических путей в механизмах их развития ясны еще не до конца.

Цель работы: изучить изменения уровней аминокислот (АК) крови и органических кислот (ОК) мочи при перинатальном гипоксически-ишеми- ческом поражении головного мозга.

Материалы и методы: обследовано 117 новорожденных с ГИП (из них 60 в остром периоде - в возрасте до 1 месяца, и 57 в раннем восстановительном периоде - в возрасте 1 - 4 месяца), и 35 относительно здоровых новорожденных. Всем детям проведено исследование свободных АК крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. У 98 детей с ГИУ исследованы ОК мочи методом газовой хроматографии - масс- спектрометрии.

Результаты. Анализ аминокислот крови выявил: в остром периоде ГИУ - повышение уровней АК, которые являются медиаторами (глутамат, р = 0,001, глицин, р = 0,038), а также метионина (р = 0,015) и АК, которые вовлечены в энергетический метаболизм и поддержание постоянного уровня глюкозы крови: аланин (р = 0,001), треонин (р = 0,028), валин (р = 0,01), лейцин (р = 0,021); снижение уровней триптофана (р = 0,0001) и тирозина (р = 0,015), которые являются предшественниками нейромедиаторов. В раннем восстановительном периоде более часто отмечались изменения АК цикла мочевины, снижение валина.

При анализе ОК мочи наиболее часто измененными были метаболиты цикла Кребса и дыхательной цепи (более 70% случаев), а также метаболиты АК с разветвленной цепью (более 60% случаев), которые также вовлечены в энергетический обмен. Обнаружены корреляции между изменениями уровней ОК в моче и АК в крови.

Выводы. Анализ АК крови после перинатальной гипоксии-ишемии обнаружил наиболее частые изменения уровней АК, вовлеченных в энергетический, нейротрансмиттерный метаболизм, детоксикацию аммиака. Выявлены изменения ОК мочи и их корреляция с изменениями АК крови. Работа демонстрирует целесообразность этих исследований для более глубокой оценки метаболического статуса после перинатальной гипоксии.

Ключевые слова: перинатальный; гипоксически-ишемическое поражение; аминокислоты; органические кислоты.

Summary

Amino acids of bloodand organic acids of urinein determining metabolicstatus with perinatalhypoxic-ischemicbrain damage

A. Yanovskaya, E.Ya. Grechanina, Yu.B. Grechanina Kharkov National Medical University(Kharkov, Ukraine)

Introduction. Hypoxic-ischemic lesions (HIL) of the brain are a frequent cause of disability and disadaptation of children. The role and interaction of metabolic pathways in the mechanisms of their development are not yet clear.Т. VU, № 3(25), 2017 Vol.

Objective: to study changes the levels of amino acids (AA) of blood and organic acids (OA) of urine with perinatal hypoxic-ischemic brain damage.

Materials and methods: 117 infants with GUI were examined (60 of them in the acute period - up to 1 month, and 57 in the early recovery period - at the age from 1 to 4 months), and 35 relatively healthy newborns. All children underwent a study of free AA blood by high-performance liquid chromatography.

In 98 children with HIL, the urine was examined by gas chromatography-mass spectrometry.

Results. Analysis of blood amino acids revealed: in the acute period of HIL, increase in the levels of AA, which are mediators (glutamate, p = 0.001, glycine, p = 0.038), and methionine (p = 0.015) and AA, which are involved in energy metabolism and maintenance of a constant blood glucose levels: alanine (p = 0.001), threonine (p = 0.028), valine (p = 0.01), leucine (p = 0.021); decrease in levels of tryptophan (p = 0.0001) and tyrosine (p = 0.015), which are the precursors of neurotransmitters. In the early recovery period, changes in the AA of the urea cycle, a decrease level of valine, were observed more frequently. In the analysis of urine, the most frequently altered metabolites of the Krebs cycle and the respiratory chain (more than 70% of cases), as well as branched chain metabolites (more than 60% of cases), which are also involved in energy metabolism. Correlations were found between changes in the levels of OA in urine and AA in the blood.

Conclusions. Analysis of blood AA after perinatal hypoxic-ischemic condition revealed the most frequent changes in the levels of AA involved in energy and neurotransmitter metabolism, detoxification of ammonia. Was detected changes of the level of OA in the urine and their correlation with changes in blood AA . The work demonstrates the feasibility of these studies for the deeper assessment of the metabolic status after perinatal hypoxia.

Keywords. Perinatal, hypoxic-ischemic lesions, amino acids, organic acids.

Вступ

Перинатальні ураження головного мозку є глобальною проблемою охорони здоров'я; їх наслідки часто стають причиною інвалідизації та дезадаптації дітей.

[1] Частота гіпоксично-ішемічного ураження мозку, за даними епідеміологічних досліджень в США, коливається від 2 до 9 на 1000 новонароджених. [2] Роль і взаємодія метаболічних шляхів у патогенезі гіпоксії-ішемії вивчені ще не до кінця, щоб бути основою для адекватної терапії. Провідним у патогенезі ГІУ є перезбудження глутаматних NMDA (N-метил-Э-аспартат) - рецепторів глутамату, що надмірно вивільняється з синапсів при загибелі нейронів. Це призводить до деполяризації мембрани, збільшує надходження хлоридів і кальцію в клітину, активує процеси протеолізу і апоптозу. [1, 3]

Дослідження останніх років метаболізму мозку після гіпоксії виявили цілий ряд змін: спостерігається тривала депресія метаболізму мітохондрій, порушується синтез нейротрансмітерів в астроцитах. Знижується активність пентозофосфатного шляху окиснення глюкози, що підвищує сприйнятливість мозку новонароджених до окисного стресу. [4] Тривають дослідження ролі амінокислот в процесах, що супроводжують гіпоксію. У гострому періоді ішемії виявлений дисбаланс АК у бік збільшення збуджуючих (аспарагінова і глутамінова) і зменшення гальмівних (гліцин, пролін, таурин). [5] Була доведена нейротрансмітерна роль серину; зв'язуючись з NMDA - рецепторами, він бере участь в механізмах ексайтотоксічності. [6] Доведено нейропротекторні властивості таурину, який в експерименті зменшував обсяг ураження мозку. [7]

Для більш глибокого розуміння процесів, що супроводжують перинатальну гіпоксію, важлива всебічна оцінка метаболічного фону. Були виявлені статистично значущі відмінності органічних кислот (ОК) сечі у новонароджених з гіпоксичним ураженням важкого ступеню. [8] Органічні кислоти - це низькомолекулярні токсичні речовини, що є продуктами обміну АК, вуглеводів, ліпідів та ін. Noto A, Pomero G, Mussap M та соавт. вказують на зміни концентрацій метаболітів сечі новонароджених протягом певного часу після гіпоксії-ішемії; ці зміни головним чином обумовлені виснаженням енергії, що може бути «відбитком» перинатальної асфіксії. [9, 10]

Мета роботи: вивчити зміни рівнів амінокислот (АК) крові та органічних кислот (ОК) сечі при гіпоксично-ішемічному ураженні (ГІУ) головного мозку.

Матеріали та методи

Нами обстежено 152 дитини, розділених на дві групи: ОГ - діти з ГІУ, n = 117; КГ - діти без ознак ГІУ, n = 35. У кожній групі виділено дві підгрупи: І - діти у віці до місяця, що відповідає гострому періоду ГІУ (ОГ (І), n = 60, і КГ (І), n = 17), і ІІ - діти у віці від 1 до 4 місяців, або ранній відновний період ГІУ (ОГ (ІІ), n = 57, і КГ (ІІ), n = 18). Всім дітям проводилося комплексне обстеження. Оцінено 23 вільних амінокислоти крові: аспарагінова (ЛСП) і глютамінова кислоти (ГЛУ), аспарагін (АСН), глютамін (ГЛН), серин (СЕР), метіонін (MET), цистин (ЦИС), таурін (ТАУ), гістидин (ГІС ), аргінін (АРГ), орнітин (ОРН), цитрулін (ЦИТ), треонін (ТРЕ), аланін (АЛА), триптофан (ТРИ), гліцин (ГЛІ), пролін (ПРО), валін (ВАЛ), ізолейцин (ІЛЕ), лейцин (ЛЕЙ), фенілаланін (ФЕН), тирозин (ТИР), лізин (ЛІЗ) методом високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) на апараті WATERS MODEL 510 HPLC PUMP.

У 98 дітей ОГ також оцінено 42 органічні сполуки сечі методом газової хроматографії - мас-спектрометрії з використанням газового хроматографу 6890N, мас-селективного детектору 5975 CVLMSD, автоінжектору 7683В. Серед ОК оцінювались ті, що переважно віддеркалюють зміни мітохондріального метаболізму (молочна, фумарова, бурштинова, яблучна, лимонна, ізолимонна, оксоглутарова кислоти), метаболіти нейротрансмітерів (гомованілова, ванілманделова, 5-гідро- ксиіндолоцтова кислоти), та група сполук, що утворюються в процесі катаболізму амінокислот; серед них метаболіти АК з розгалуженим ланцюгом (гідроксиізобутірова, еритронілова кислоти, 2-етилгідракрилова, 3-метилглутарова, 3-гідрокси- ізовалеріанова, 3-метилглутаконова, 3-гідрокси- метілглутарова, 3-гідроксиізобутірова кислоти), метаболіти сірковмісних амінокислот та кобаламіну (сульфіти, цистин, метилмалонова кислота, та зниження 5-оксопроліну), також метаболіти ароматичних амінокислот ФЕН і ТИР (2-гідроксифені- лоцтова, р-гідроксифенілмолочна, гідроксифеніл-молочна, гіппурова кислоти), метаболіти ГЛУ та АСП (№ацетилі-аспартанова, аконітова кислоти, та підвищення 5-оксипроліну), ЛІЗ та ТРИ (глутарова, індолоцтова, пімелінова кислоти), та маркери кетозу (3-гідроксибутірова, ацетооцтова, етилмалонова, метилбурштинова кислоти).

Статистична обробка експериментальних даних проведена за допомогою програми статистичного аналізу Statistica 6 з використанням непараметричних методів хі-квадрат і Фішера. Відмінності вважалися значущими при р <0,05.

Результати та їх обговорення

Середній вік обстежених дітей склав в групі ОГ (І) 17,57 ± 1,04 доби, в групі ОГ (ІІ) - 65,5 ± 2,78 доби. Стан дітей в гострому періоді ГІУ розцінювався від середнього до дуже важкого. Провідними клініко-неврологічними синдромами у гострому періоді були: синдром пригнічення ЦНС - у 67,7% дітей, судомний синдром - у 51,7%, внутрішньочерепні крововиливи - у 19,7%; 48,3% дітей перенесли набряк головного мозку.

Порівняння змін АК крові у дітей в гострому і ранньому відновному періодах гіпоксичного ураження та групи контролю (табл. 1) виявило наступні зміни: у гострому періоді достовірно частіше були змінені: глутамат (р = 0,001), гліцин (р = 0,038), аланін (р = 0,001), валін (р = 0,01), треонін (р = 0,028) частіше були підвищеними; триптофан - знижений (р = 0,0001); частіше змінювався рівень ізолейцину (р = 0,007). При використанні точного критерію Фішера значущі відмінності виявлені також для амінокислот: аргінін (pFet = 0,011), лізин ^Fet = 0,011), метионін (pFet = 0,015), лейцин ^Fet = 0,021), гістидин (pFet = 0,028), тирозин (j>Fet = 0,015), цистин frFet = 0,035).

Ці амінокислоти активно залучені до метаболічних процесів, які змінюються в умовах гіпоксії та впливають на функціонування ЦНС. Так, перезбудження надмірним глутаматом NMDA - рецепторів є провідним у патогенезі гіпоксичного ураження. Підвищення рівнів амінокислот-медіаторів під дією гіпоксії - збуджуючого глутамату та гальмівного гліцину - співпадають з даними багатьох дослідників; також були описані зміни рівнів гістидину та цистину, які залучені до роботи антиоксидантних систем. [5].

Таблиця 1 Зміни рівнів амінокислот крові у обстежених дітей

Примітка. *- статистично значуща різниця (р<0,05) при порівнянні груп

Інші АК, зміни рівнів яких ми виявили, також залучені до процесів, що супроводжують гіпоксію. АЛА і амінокислоти з розгалуженим ланцюгом (ВАЛ, ІЛЕ) можуть бути залучені до глюконеогенезу і енергетичного обміну: АЛА як складова частина коензиму А, ВАЛ в циклі лимонної кислоти. [11, 12] Метионін є універсальним донором метильних груп в синтезі активних речовин (фосфатидилхолін, катехоламіни та ін.). Окрім того, метионін-тРНК, ініціюючи процеси трансляції, може впливати на регуляцію метаболічних процесів, що динамічно змінюються під дією гіпоксії. [13] Зниження рівнів ТРИ і ТИР може бути наслідком їх активного використання як субстратів для синтезу нейромедіаторів - серотоніну і дофаміну, а також катехоламінів. [11, 12]

У ранньому відновному періоді достовірно частіше змінювались рівні глутамату (р = 0,007), аланіну (р = 0,007), треоніну (р = 0,013), лізину (р = 0,003), триптофану (р = 0,003), гістидину (р = 0,008 ), глутаміну (р = 0,003), орнітину (р = 0,024), цитруліну (р = 0,005), метіоніну (р = 0,024) та серину (р = 0,031). При використанні точного критерію Фішера статистично значущі відмінності виявлені також для гліцину = 0,030), аргініну (рFet = 0,01), ізолейцину (рFet = 0,027), аспартату (р^ = 0,014) і аспарагіну (рFet = 0,019).

У порівнянні з гострим, у відновному періоді ГІУ зберігалося підвищення рівнів АК, що задіяні в енергетичному метаболізмі та глюконеогенезі - аланіну та треоніну. Це корелює з даними, які свідчать, що після гіпоксії спостерігається тривала депресія метаболізму мітохондрій. [4] Ми також виявили більш виражені зміни АК, залучених до детоксикації аміаку: крім аргініну, частіше зміненими були цитрулін, орнітин, глютамін; можливо це відповідь на катаболізм при гіпоксії. Частіше були зниженими АСП і АСН, які задіяні в механізмах ексайтотоксичності, а також, в імунній відповіді й фагоцитозі. Серин залучається до нейропроекції [6], синтезу медіаторів та глутатіону.

Органічні кислоти сечі є кінцевими продуктами багатьох метаболічних шляхів. Дослідження ОК сечі у дітей основної групи (табл. 2) виявило наступні особливості: зміни мітохондріальних метаболітів мали місце у більшості дітей із гіпоксичним ураженням - в гострому періоді у 74%, у ранньому відновному періоді у 77% дітей. У 34,0 % дітей ОГ (І) та 33,4% ОГ (ІІ) змінені метаболіти нейротрансмітерів. Серед метаболітів переважно амінокислотного походження найбільш часто були зміненими метаболіти АК з розгалуженим ланцюгом - у 62,0% дітей ОГ (І) та 67,5% ОГ (ІІ); метаболіти ФЕН, ТИР змінені в 50,0 % ОГ(І) та 41,7 % ОГ(ІІ). Метаболіти інших амінокислот частіше були змінені у дітей віком 1 - 4 місяці: метаболіти ГЛУ, АСП - в 36 % випадках ОГ (І) та 58,8 % випадках ОГ (ІІ), метаболіти сірковмісних амінокислот та кобаламіну - у 26 % ОГ(І) та 43,8 % ОГ(ІІ), метаболіти ЛІЗ та ТрИ - у 32 % та 45,8 % ОГ(І) та ОГ(ІІ) відповідно. Ознаки кетозу мали місце у 28% дітей ОГ (І) та 42,7 % ОГ (ІІ).

Таблиця 2 Зміни органічних сполук сечі у дітей з ГІУ

Ми дослідили наявність кореляцій між змінами рівнів органічних сполук в сечі та амінокислот у крові (табл. 3).

Виявлені зв'язки є відображенням шляхів катаболізму АК та їх перехрещення з іншими ланками обміну.

Таблиця 3 Амінокислоти крові, для яких виявлена сполученість із змінами ОК сечі

Примітка: * - статистично значуща різниця (р<0,05) при порівнянні груп.

Так, наявність залежності між підвищенням рівней АСП в крові та метаболітів ЛІЗ в сечі може бути наслідком використання АСП в синтезі лізину, а кореляція між підвищенням метаболітів ТРИ в сечі та ТРЕ крові може бути результатом перетворення треоніну в серин, з якого синтезується триптофан.

Залежність між підвищенням метаболітів ГЛУ, АСП в сечі та ТРЕ, АЛА, ЛІЗ в крові може бути наслідком залучання глутамату до синтезу цих амінокислот. Зв'язок глутамату крові із мітохондріальними метаболітами відображає задіяність глутамату в циклі Кребса як попередника в синтезі а-глутарата в мітохондріях.

Глутамат крові, перетворюючись на аспартат, далі може виконувати роль попередника в синтезі цистину та відновленні метіоніну, що активно використовується як донатор метильних груп; це може пояснити кореляцію між метаболітами сірковмісних АК сечі та ГЛУ в крові.

метаболічний мозок амінокислота сеча

Висновки

1. У гострому періоді ГІУ достовірно частіше підвищувались рівні наступних АК: глутамат, гліцин, аланін, валін, метіонін і лізин, які в першу чергу залучені до енергетичного обміну та глюконеогенезу. Знижувались рівні триптофану і тирозину, а також гістидину і цистину, які необхідні для синтезу медіаторів та антиоксидантної дії.

2. У відновному періоді частіше були змінені амінокислоти, залучені до детоксикації аміаку, енергетичного метаболізму.

3. Серед ОК сечі найчастіше були змінені метаболіти циклу Кребса та АК, залучені до енергетичного метаболізму.

4. Робота демонструє спектр змін АК при ГІУ, їх взаємозв'язок з іншими метаболічними шляхами; наявність кореляцій між АК крові та ОК сечі та доцільність їх сумісного дослідження для оцінки метаболічного статусу після перинатальної гіпоксії.

Перспективи подальших досліджень

Ми вважаємо за доцільне вивчення змін амінокислот крові та органічних кислот сечі в залежності від важкості стану та особливостей перебігу ГІУ.

Література

1. Шабалов НП. Неонатология: учеб. пособ. В 2 т. Т. I. 3-е изд., испр. и дополн. М.: МЕД- пресс-информ; 2004. 608 с.

2. Van Eerden P, Bernstein PS. Neonatal Encephalopathy and Cerebral Palsy: Defining the Pathogenesis and Pathophysiology. Washington; 2003. 94 p.

3. Пипа ЛВ, Свістільнік ТВ. Вивчення впливу ексайтотоксичних амінокислот на ступінь порушення свідомості при гнійних менінгітах у дітей. Здоровье ребенка. 2013;4:131-4.

4. Brekke E, Berger HR, Widerae M, Sonnewald U, Morken TS. Glucose and Intermediary Metabolism and Astrocyte-Neuron Interactions Following Neonatal Hypoxia-Ischemia in Rat. Neurochem Res. 2017 Jan;42(1):115-32.

5. Зозуля І.С., Боброва В.І., М'ясникова М.П., Сич Н.С. Стан нейроамінокислот у хворих у гострому періоді інфаркту мозку з когнітивними порушеннями. Міжнародний неврологічний журнал. [Інтернет]. [цитовано 2017 Сер 12]; 2010;7.

6. Fuchs S.A., Peeters-Scholte C.M., de Barse M.M., Roeleveld M.W., Klomp L.W., Berger R, et al. Increased concentrations of both NMDA receptor co-agonists D-serine and glycine in global ischemia: a potential novel treatment target for perinatal asphyxia. Amino Acids. 2012 Jul;43(1):355-63.

7. Zhu X.Y., Ma P.S., Wu W., Zhou R., Hao Y.J., Niu Y. et al. Neuroprotective actions of taurine on hypoxic-ischemic brain damage in neonatal rats. Brain Res Bull. 2016;124:295-305.

8. Walker V, Mills GA. Effects of birth asphyxia on urinary organic acid excretion. Biol Neonate. 1992;61(3):162-72.

9. Noto A., Pomero G., Mussap M., Barberini L., Fattuoni C., Palmas F., et al. Urinary gas chromatography mass spectrometry metabolomics in asphyxiated newborns undergoing hypothermia: from the birth to the first month of life. Ann Transl Med. 2016 Nov;4(21):417. doi: 10.21037/atm.2016.11.27.

10. Beckstrom A.C., Humston E.M., Snyder L.R., Synovec R.E., Juul S.E. Application of comprehensive two-dimensional gas chromatography with time-of-flight mass spectrometry method to identify potential biomarkers of perinatal asphyxia in a non-human primate model. J Chromatogr A. 2011 Apr 8;1218(14):1899- 906.

11. Сыровая А.О., Шаповал Л.Г., Макаров В.А., Петюнина В.Н., Грабовецкая Е.Р., Андреева С.В., и др. Аминокислоты глазами химиков, фармацевтов, биологов. В 2-х т. Т. 1. Харьков: Щедра садиба плюс; 2014. 228 с.

12. Северин С.Е., редактор. Биологическая химия: учебник. М/: ГЭОТАР-Медиа; 2004. 784 с.

13. Punzo D, Errico F, Cristino L, Sacchi S, Keller S, Belardo C, et al. Age-Related Changes in D-Aspartate Oxidase Promoter Methylation Control Extracellular D-Aspartate Levels and Prevent Precocious Cell Death during Brain Aging. J Neurosci. 2016 Mar;36(10):3064-78.

Размещено на Allbest.ru