Клеточные механизмы нейроиммунных взаимодействий в регуляции ориентировочно-исследовательского поведения

Размещено на http://allbest.ru

ФГБУ «НИИ Клинической иммунологии СО РАМН»

Клеточные механизмы нейроиммунных взаимодействий в регуляции ориентировочно-исследовательского поведения

Маркова Е.В.*^* Маркова Евгения Валерьевна, д.м.н., в.н.с. лаборатории нейроиммунологии , Княжева М.А., Козлов В.А.

Новосибирск

Аннотация

На основании результатов собственных оригинальных исследований, доказывающих возможность направленного изменения параметров ориентировочно-исследовательского поведения трансплантацией иммунокомпетентных клеток с определенными функциональными характеристиками, в настоящей работе продемонстрирована возможность получения нейролептического эффекта у экспериментальных животных путем трансплантации спленоцитов, предварительно обработанных аминазином. Рассматриваются механизмы полученного эффекта.

Abstract

Cellular mechanisms of neuroimmune interactions in the regulation of the exploratory behavior

Markova E. V., Knyazheva M. A., Kozlov V. A. «Clinical Immunology Research Institute» under the Russian Academy of Medical Sciences, Siberian Branch., Novosibirsk.

Based on the results of our own original researches on the possible direction change the exploratory behavior parameters by the transplantation of immune cells with specific functional characteristics in the present study we demonstrated the possibility of obtaining a neuroleptic effect in experimental animals by the transplantation of splenocytes, pretreated with chlorpromazine. The mechanisms of the obtaining effect were discussed.

Key words: immune system, immune cells, nervous system, exploratory behavior, cytokines.

Введение

Новая интегративная наука - психонейроиммунология, появившаяся в последней трети XX в., с каждым годом все больше привлекает внимание исследователей. Это обусловлено тем, что понимание функционального единства нервной и иммунной систем, характера взаимодействия между ними открывает впечатляющие перспективы в самых различных областях экспериментальной и клинической медицины, позволяет пересмотреть лечебную тактику при борьбе со многими заболеваниями. Существование интеграционных взаимоотношений иммунной и нервной систем, клеточные элементы которых характеризуются выраженным фенотипическим и функциональным сходством, подразумевает, в частности, возможность участия иммунокомпетентных клеток в регуляции процессов высшей нервной деятельности.

Как показали наши предыдущие исследования, функциональная активность иммунной системы, в частности ее клеточных элементов, связана с уровнем ориентировочно-исследовательского поведения [1, 2, 3]. Параметры данной поведенческой реакции могут быть направленно изменены путем трансплантации иммунокомпетентных клеток с определенными функциональными характеристиками [3, 4, 5, 6].

Нейролептики достаточно эффективны и широко применяются в психиатрической практике, являясь основой современной фармакотерапии ряда психических заболеваний и расстройств.

Однако они обладают рядом побочных эффектов, проявляющихся в аллергических реакциях, изменении картины крови, поражении печени и др. Некоторые из них, в частности препараты фенотиазинового ряда, могут вызывать острое снижение артериального давления (особенно у больных гипертонической болезнью), нарушения атриовентрикулярной и внутрижелудочковой проводимости, угнетение дыхательного центра, что в ряде случаев ограничивает возможности применения указанных препаратов и побуждает к поиску новых терапевтических подходов.

Цель - изучение возможности получения нейролептического эффекта у экспериментальных животных путем трансплантации иммунокомпетентных клеток, функциональная активность которых была изменена предварительной обработкой препаратом фенотиазинового ряда - аминазином. Актуальность исследования определяется как наличием широкого спектра неврозоподобных, аффективно-личностных, когнитивных и поведенческих нарушений, возникающих при вторичных иммунодефицитах вследствие повторных и хронически действующих экологических и социальных стрессоров, так и довольно активным проведением в настоящее время различных иммунотерапевтических мероприятий, в том числе и клеточной терапии при различной патологии.

Материалы и методы

Экспериментальные животные. Работа выполнена на мышах-самцах (CBAxC57Bl/6)F1 в возрасте 3 месяцев; средний вес животных составлял 18-20 граммов. Животных содержали в условиях лабораторного вивария в клетках по 10 особей в каждой, не менее 2 недель до начала эксперимента на стандартной диете, при свободном доступе к воде и нормальном световом режиме. Исследования проводились в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986), и правилами лабораторной практики (приказ Министерства здравоохранения РФ от 19.06.2003, № 267).

Выделение, культивирование и трансплантация спленоцитов. Животных забивали путем цервикальной дислокации; в стерильных условиях вскрывали брюшную полость, извлекали селезенку, очищали ее от соединительной ткани и помещали во флаконы с охлажденной до 4С средой 199 (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор») в объеме 5 мл на селезенку. Выделенные селезенки измельчали при помощи ножниц и осторожно ресуспензировали с помощью шприца, для того чтобы распались оставшиеся скопления клеток. Образовавшуюся суспензию клеток центрифугировали 8 минут при 150 g. После удаления надосадочной жидкости находящиеся в осадке спленоциты ресуспензировали в среде RPMI-1640. Жизнеспособность клеток определялась при помощи окраски трипановым синим.

Выделенные спленоциты обрабатывали in vitro аминазином из расчета 15*10⁶ клеток на 150 мкг аминазина в присутствии 3 % FCS в течение 25 минут. Концентрация препарата, применяемая для обработки клеток, определялась путем перерасчета терапевтической дозы с учетом веса и особенностей метаболизма животных. Затем, после 3-кратного центрифугирования с целью удаления остатков нейролептика, не соединившегося с рецепторами, прекультивированные с аминазином клетки внутривенно вводили мышам-реципиентам в концентрации 15*10 ⁶ клеток в объеме 0,2 мл физиологического раствора на 1 животное.

В контрольной группе животных подготовка и трансплантация спленоцитов проводились в аналогичных условиях эксперимента, за исключением того, что последние культивировались без присутствия аминазина.

Изучение поведения животных в тесте «открытое поле». Ориентировочно-исследователь-ское поведение животных оценивали в тесте «открытое поле» [7]. Для этого использовалась большая прямоугольная камера (100*100 см) с пластмассовыми стенками высотой 40 см. Полом служил лист белого пластика, на который черной краской нанесена решётка, делящая поле на 100 (10*10) равных квадратов.

Освещение проводилось бестеневой лампой мощностью 100 Вт, расположенной на высоте 100 см над центром поля. Животное помещали в угол камеры и регистрировали его моторную и исследовательскую активность в течение 5 минут с интервалом в 1 минуту.

Для каждого животного подсчитывались число пересеченных центральных и периферических квадратов, число вертикальных стоек (свободных и с опорой на стенку поля), суммарная горизонтальная и вертикальная двигательная активность. Для определения степени эмоциональной реактивности регистрировалось число фекальных болюсов. Все эксперименты проводились в период времени с 10 до 14 часов.

Пролиферативная активность спленоцитов после обработки in vitro аминазином оценивалась стандартным методом по включению в нуклеопротеидные фракции клеток радиоактивной метки (Н³-тимидин), как было описано ранее [2]. Результаты представляли в виде среднего счета (имп/мин).

Определение цитокинов. Количественное содержание цитокинов определяли в лизатах головного мозга животных-реципиентов. Лизаты головного мозга получали путем гомогенизирования тканей в среде RPMI-1640 (Биолот, Россия) с добавлением 0,1 % Triton Х-100 (GERBU Biotechnik GmbH), с последующим центрифугированием в течение 3 минут при 10 000 об/мин. Надосадочную жидкость использовали для исследования. Содержание цитокинов в исследуемых образцах оценивали методом ИФА (ELISA) с использованием специфических компонентов к цитокинам мыши производства фирмы «R&D Systems» (Великобритания). Принцип анализа «sandwich» - вариант твердофазного трехстадийного иммуноферментного анализа на планшетах (моноклональные антитела на подложке, конъюгат поликлональных антител с биотином) по технологии, разработанной в ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск, Россия), для определения цитокинов. Чувствительность наборов для ИЛ-1в и ИЛ-4 не превышает 5 пг/мл, для ИЛ-6 и ИНФ-г - 2 пг/мл, для ФНОб - 1 пг/мл.

Определение количества антителообразующих клеток в селезенке мышей. Способность мышей к иммунному ответу на эритроциты барана (ЭБ) оценивали на 5-е сутки после внутрибрюшинной иммунизации ЭБ по количеству локальных зон гемолиза в полужидкой среде модифицированным методом A. J. Cunningham [8].

Определение высоты реакции гиперчувствительности замедленного типа. Мышей иммунизировали внутрибрюшинным введением эритроцитов барана (0,5 % - 0,5 мл). Разрешающую дозу указанного антигена (50 % - 0,05 мл) вводили под апоневроз задней стопы через 96 часов. Формирование реакции ГЗТ оценивали через 24 часа после разрешающей инъекции по степени опухания лапы (изменения её толщины по сравнению с позитивно-контрольной задней лапой того же животного, в которую была введена среда RPMI - 1640). Индекс реакции (ИР) определяли для каждой мыши по формуле: ИР=(Ро-Рк)/Рк и выражали в процентах [9].

Статистическую обработку результатов проводили с использованием t-критерия Стьюдента (при нормальном распределении изучаемого признака) и парного критерия Манна-Уитни в случае отклонения от нормального распределения (компьютерная программа «Statistica 6.0»). Результаты представлены в виде М±SD. Различия считали достоверными при p<0,05.

Результаты и обсуждение

По характеру поведения в «открытом поле» мыши (CBAx C57Bl/6)F1 достоверно разделяются на 3 группы: с активным, средним и пассивным типами ОИП [1, 2, 3]. Учитывая специфический эффект аминазина, вызывающего выраженное седативное действие, снижение моторной активности и мышечного тонуса, в экспериментах в качестве доноров и реципиентов использовались животные, характеризующиеся активным типом ОИП с высокими параметрами двигательной активности.

Показано, что прекультивирование спленоцитов данной группы мышей с аминазином модулировало функциональную активность указанных клеток, что проявлялось в снижении их спонтанной пролиферативной активности (рис. 1).

Рис. 1. Спонтанная пролиферативная активность спленоцитов, обработанных in vitro аминазином

Примечание. По оси ординат - имп/мин; ¦ - спленоциты, прекультивированные in vitro с аминазином; ? - спленоциты, прекультивированные в аналогичных условиях в отсутствии аминазина; n=12-17 в каждой группе; * - p<0,01 между группами.

Трансплантация обработанных нейролептиком иммунокомпетентных клеток сингенным реципиентам вызывала у последних достоверное снижение параметров горизонтальной и вертикальной двигательной активности в тесте «открытое поле», что свидетельствует о подавлении моторного и исследовательского компонентов ОИП (табл. 1).

Таблица 1

Параметры ориентировочно-исследовательского поведения мышей-реципиентов в тесте «открытое поле» после трансплантации иммунокомпетентных клеток, прекультивированных с аминазином (M±SD)

Примечание. Контрольная группа - мыши-реципиенты после трансплантации спленоцитов, прекультивированных в отсутствии аминазина; опытная группа - мыши-реципиенты после трансплантации спленоцитов, прекультивированных с аминазином; * - p<0,01 между контрольной и опытной группами животных.

Снижение показателей двигательной активности после трансплантации клеток регистрировалось на фоне изменения содержания в головном мозге провоспалительных цитокинов ИЛ-1в, ИЛ-6, ФНОб (рис. 2).

Изменение цитокинового фона головного мозга может, по нашему мнению, являться одним из механизмов продемонстрированного эффекта трансплантированных иммунокомпетентных клеток на двигательную активность животных.

Рис. 2. Содержание цитокинов в головном мозге мышей (CBAxC57Bl/6)F1 после трансплантации иммунокомпетентных клеток, обработанных in vitro аминазином

Примечание. По оси ординат - пкг / мл; ¦ - контрольная группа животных; ? - опытная группа животных; * - p<0,01 между контрольной и опытной группами животных.

Согласно данным ряда исследователей, указанные цитокины, как самостоятельно, так и посредством модуляции активности нейромедиаторных систем головного мозга, влияют на функциональную активность ЦНС, являясь одним из патогенетических факторов ряда психических заболеваний, в том числе и депрессии [10, 11, 13, 14, 15, 16].

Принимая во внимание существование афферентного звена нейроиммунных взаимодействий, одним из механизмов нейролептического эффекта трансплантации обработанных аминазином спленоцитов может быть также модуляция функциональной активности иммунной системы животных-реципиентов.

У последних после клеточной трансплантации регистрировалось снижение интенсивности гуморального и клеточного иммунного ответа. Установлено достоверное уменьшение числа антителообразующих клеток селезенки (как относительного, так и абсолютного) и снижение высоты реакции гиперчувствительности замедленного типа (табл. 2).

Таблица 2

Гуморальный и клеточный иммунный ответ у мышей (CBAxC57Bl/6)F1 после трансплантации клеток,

обработанных in vitro аминазином (M±SD)

Примечание. В каждой группе n=13--15; * - p<0,05; ** - p<0,01 между соответствующими показателями в контрольной и опытной группах животных.

Тот факт, что изменения выраженности реакции ГЗТ у реципиентов сопровождает соответствующие изменения параметров их поведения в тесте «открытое поле», подтверждает сделанный ранее нами, а также и другими авторами, вывод о существовании прямой зависимости между этими показателями у различных видов экспериментальных животных [1, 2, 3, 12, 17]. трансплантация иммунный нейролептический аминазин

Заключение

Продемонстрирована возможность получения нейролептического эффекта у экспериментальных животных путем трансплантации иммунокомпетентных клеток, экстракорпорально обработанных препаратом фенотиазинового ряда - аминазином.

Данный подход исключает нежелательные побочные эффекты, возникающие при непосредственном приеме соответствующих препаратов, что расширяет возможности использования последних, равно как и возможности применения клеточной терапии.

Литература

1. Markova E. V., Gromykhina N. Yu., Abramov V. V., Kozlov V. A. The Peculiarities of the Immune Status in Mice with Different Level of Behavioral Reactions // Russ. J. Immunol. - 2000. - V. 5, № 1. - P. 89--95.

2. Markova E. V., Chernova T. G., Filimonov P. N., Abramov V. V., Kozlov V. A. Immunomorphological characteristics of animals with different levels of orientation and exploratory behavior // Bull. Exp. Biol. Med. - 2004. - V. 138, № 4. - P. 415--417.

3. Markova E. V. The immune system and the higher nervous activity: mechanisms of neuroimmune interactions in the realization and regulation of behavioral responses. - Germany : LAP LAMBERT Academic Publishing GmbH & Co. KG, 2012. - 259 p. ]

4. Markova E. V., Abramov V. V, Korotkova N. A., Kozlov V. A. Effect of transplantation of immunocompetent cell on oriental and exploratory behavior and cytokine gene expression in the brain of experimental animals // Bull. Exp. Biol. Med. - 2006. - V. 142, № 3. - P. 338--340.

5. Markova E. V., Abramov V. V., Kozlov V. A. Regulation of the Behavior Reactions by the Immune Cell Transplantation // Proceedings of the 2nd European Congress of Immunology. Free Papers / Editors R. E. Schmidt. - Bolonga, Italy, 2009. - P. 551--555.

6. Маркова Е. В., Козлов В. А. Механизмы регуляции ориентировочно-исследовательского поведения мышей (СBA x C57Bl/6)F1 иммунокомпетентными клетками // Вест. Уральской мед. академ. науки. - 2010. - № 2/1. - С. 49--51.

7. Bures J., Buresova O., Huston J. P. Techniques and Basic Experiments for the Study of Brain and Behavior. - Amsterdam : Elsevier Science, 1991. - 399 p.

8. Cunningham A. J. A method of increased sensitivity for detecting single antibody-forming cells // Nature. - 1965. - № 207. - P. 1106--1107.

9. Yoshikai Y., Miake S., Matsumoto T. et al. Effect of stimulation and blockade of mononuclear phagocyte system on the delayed footpad reaction to SRBC in mice // Immunol. - 1979. - V. 38, № 3. - P. 577--583.

10. Dantzer R. Cytokine, Sickness Behavior, and Depression // Immunol. Allergy Clin. North. Am. - 2009. - V. 29 (2). - Р. 247--264.

11. Dunn A. J. Effects of cytokines and infections on brain neurochemistry / R. Ader, D. L. Felten, N. Cohen eds. // Psychoneuroimmunology. - New York : Academic Press, 2001. - P. 649--666.

12. Viveros M. P., Fernandes B., Guayerbas N., Fuente M. D. Behavioral characterization of mouse model of premature immunosenscence // J. Neuroimmunol. - 2001. - V. 114. - P. 80--88.

13. Siegel A., Zalcman S. S. The Neuroimmunological Basis of Behavior and Mental Disordersэ. - Springer Science and Business Media LLC, 2009. - 438 p.

14. Kaster M. P., Gadotti V. M., Calixto J. B., Santos A. R., Rodrigues A. L. Depressive-like behavior induced by tumor necrosis factor-б in mice // Neuropharmacology. - 2012. - V. 62, № 1. - P. 419--426.

15. Monji A. The neuroinflammation hypothesis of psychiatric disorders // Seishin Shinkeigaku Zasshi. - 2012. - V. 114, № 2. - P. 124--133.

16. Девойно Л. В., Идова Г. В., Альперина Е. Л. Психонейроиммуномодуляция: поведение и иммунитет. Роль «нейромедиаторной установки мозга». - Новосибирск : Наука, 2009. - 168 с.

17. Markova E. V., Kozlov V. A., Trofimova N. A., Kolosova N. G. Stimulation of cell component of the immune response activates exploratory behavior in senescence Aaccelerated OXYS rats // J. Bull. Exp. Biol. Med. - 2005. - V. 140, № 3. - P. 345--347.

Транслитерация русских источников

18. Markova E. V., Kozlov V. A. Mehanizmyi regulyatsii ori-entirovochno-issledovatelskogo povedeniya myishey (SBA x C57Bl/6)F1 immunokompetentnyimi kletkami // Vestnik Uralskoy meditsinskoy akademicheskoy nauki. - 2010. - N 2/1. - S. 49--51.

19. Devoyno L. V., Idova G. V., Alperina E. L. Psihoney-roimmunomodulyatsiya: povedenie i immunitet. Rol «neyromediatornoy ustanovki mozga». - Novosibirsk : Nauka, 2009. - 168 s.

Размещено на Allbest.ru