Возбудители анаэробных инфекций

Размещено на http://www.allbest.ru/

Ознакомиться с основными видами микроорганизмов, осуществляющими масляно-кислое брожение

Масляно-кислое брожение - это процесс анаэробного разложения углеводов масляно-кислыми бактериями с образованием масляной кислоты и других продуктов по уравнению:С6Н1206 > СН3СН2СН2СООН +2С02+2Н2. Кроме масляной кислоты, в процессе брожения в заметных количествах образуется уксусная кислота, а при смещении реакции в кислую сторону (до рН 5,5) - в больших количествах бутиловый спирт и ацетон. Энергетическим материалом для масляно-кислых бактерий служит крахмал, водорастворимые углеводы типа декстринов, ди- и моносахаридов, органические кислоты (молочная и пировиноградная) и спирты - манит и глицерин. В качестве источника азота они используют самые различные азотистые соединения; пептон, аминокислоты, аммиачные соли, а некоторые даже атмосферный азот.

Бактерии, вызывающие масляно-кислое брожение, относятся к роду Clostridium. Масляно-кислые бактерии широко распространены в почве (до 90 % почвенных образцов, как правило, содержат эти бактерии), навозе, загрязненных водоемах, на разлагающихся растительных остатках, в молоке, на поверхности растений и т. д.

В природе масляно-кислые бактерии полезны. Образующаяся масляная кислота в невысоких концентрациях является веществом, стимулирующим рост высших растений.

Масляно-кислое брожение происходит в природных условиях в гигантских масштабах: на дне болот, в заболоченных почвах, илах и всех тех местах, куда ограничен доступ кислорода. Благодаря деятельности масляно-кислых бактерий разлагаются огромные количества органического вещества. Однако масляно-кислое брожение часто приносит значительный ущерб, вызывая массовую порчу овощей при хранении, вспучивание сыра, порчу консервов, прогоркание молока.

Clostridium spp. входят в состав нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта (автохтонная микрофлора); иногда их обнаруживают на коже и в полости рта (аллохтонная микрофлора). К роду Clostridium относятся также весьма опасные патогенные виды: Сlostridium tetani - возбудитель столбняка, Сlostridium perfringens -возбудитель газовой гангрены, Сlostridium botulinum - продуцент экзотоксина, одного из самых сильных биологических ядов (ботулизм). Все виды рода объединены в группы в зависимости от способности сбраживать те или иные органические соединения.

Первая группа - сахаролитические виды Clostridium, сбраживающие растворимые углеводы, крахмал или пектин с образованием бутирата, ацетата, СО2 и Н2. Брожение при участии некоторых микроорганизмов группы приводит к образованию из сахаров дополнительных нейтральных соединений (бутанола, пропанола, ацетона, небольших количеств этанола). В группу входят бактерии, вызывающие масляно-кислое и ацетонобутиловое брожения: С. pasteurianum, С. tyrobutyricum, С. butylicum, С. acetobutylicum и др.

Вторая группа - протеолитические виды Clostridium, сбраживающие аминокислоты. Обладают сильными протеолитическими свойствами и способны к интенсивному гидролизу белков с последующим сбраживанием аминокислот. Рост микроорганизмов средах с белком сопровождается образованием аммиака, СО2, Н2, жирных кислот и большого количества летучих соединений с неприятным запахом.

К группе относятся виды: С. sporogenes, С. регfringens, С. histolyticum, С. botulinum и др. Многие представители рода Clostridium, сбраживающие аминокислоты, способны также к сбраживанию углеводов.

Третья группа - виды Clostridium, сбраживающие азотсодержащие циклические соединения - пурины и пиримидины. Пурины (гуанин, гипоксантин, ксантин и др.) под влиянием С. acidi-urici и С. cylindrosporum превращаются в аммиак, ацетат и СО2. С. oroticum сбраживает пиримидины, при этом урацил распадается до аланина, СО2 и NH3, а оротовая кислота - до уксусной кислоты, СО2 и NH3.

Четвертая группа включает всего один вид - С. kluyveri, сбраживающий смесь этанола с ацетатом до бутирата и капроновой кислоты, а также небольшого количества водорода.

Получить накопительную культуру бактерий рода Clostridium, осуществляющих маслянокислое брожение

Получение накопительной культуры маслянокислых бактерий рода Clostridium проводят с использованием нечищеных клубней картофеля, на поверхности которых высока вероятность присутствия бактерий этого рода. Измельченные клубни помещают в водную среду, куда добавляют мел для создания нейтральной среды, так как масляно-кислые бактерии относятся к нейтралофилам. Чтобы в этой среде развивались преимущественно маслянокислые бактерии, следует создать в ней строго анаэробные условия и подвергнуть среду пастеризации (прогреванию при температуре около 80 єС в течение 10-15 мин). При нагревании споры маслянокислых бактерий остаются жизнеспособными, а попавшие с почвой неспорооразующие бактерии погибают.

Изучить морфологию бактерий, осуществляющих маслянокислое брожение

В настоящее время среди представителей Clostridium насчитывается более 80 видов бактерий. Они являются строгими (облигатными) анаэробы, представляют собой подвижные крупные палочки (перитрихальный тип жгутикования) с клостридиальным или плектридиальным типом спорообразования (рис. 11). У видов рода образуются споры, имеющие овальную или сферическую форму; они терморезистентны.

Окраска по Граму - положительная. Очень чувствительны к кислотности среды, оптимум рН 6,9-7,3. При рН ниже 4,9 прекращают развиваться. Характерная особенность маслянокислых бактерий - способность накапливать в клетках гранулезу в период образования спор и перед ним.

А Б В

Рисунок 11 Типы спорообразования у бактерий: А - бациллярный, Б - клостридиальный, В - плектридиальный

Род включает психрофильные, мезофильные и термофильные виды.

Температурный оптимум для роста большинства мезофильных видов лежит в диапазоне 30-40 °С. Для термофильных видов температурный оптимум составляет 60-75 °С. Оптимальная реакция среды для клостридий -нейтральная или слабощелочная. Типичный представитель маслянокислых бактерий - Clostridium butyricum. Это крупная палочка (1-2Ч10 мкм). Молодые клетки подвижны, на более поздних стадиях развития они теряют жгутики, приобретают веретенообразную форму и накапливают запасное питательное вещество - полисахарид гранулезу. При образовании спор клетки приобретают веретеновидную форму, иногда форму барабанной палочки.

Вопросы к лабораторной работе

1. Какие виды масляно-кислого брожения вам известны?

2. Какие микроорганизмы, осуществляющие масляно-кислое брожение вы изучали, их морфологические и биохимические свойства?

3. Каким образом производится получение накопительной культуры масляно-кислых бактерий рода Clostridium?

4. Как происходит спорообразование у бактерий рода Clostridium?

Получить накопительную культуру масляно-кислых бактерий:

1. Неочищенный картофель нарезать ломтиками, которые могут легко войти в пробирку.

2. Заполнить ими пробирку на 1/3 объема, добавить щепотку мела и заполнить водой почти до верха. Закрыть ватной пробкой.

3. Пробирки поместить в водяную баню при температуре 80 °С на 10-15 мин.

4. Вынуть ватные пробки и быстро заменить их резиновыми, проводя последние через пламя спиртовки и обжигая край пробирок.

5. Затем пробирки закрыть пробками и ставить в термостат с температурой 35 °С на 2-3 дня.

6. При этих условиях в жидкости обнаруживают бактерии масляно-кислого брожения. Элективные условия для прохождения в опыте масляно-кислого брожения:

1) наличие крахмала как специфического источника углерода, который используется только микроорганизмами, содержащими фермент амилазу, вызывающую гидролиз крахмала до глюкозы;

2) присутствие масляно-кислых бацилл на поверхности картофеля;

3) анаэробные условия под высоким столбиком жидкости;

4) нейтральная среда за счет внесения мела;

5) пастеризация, позволяющая отделить масляно-кислые бациллы от не споровых форм.

Исследовать микроорганизмы масляно-кислого брожения:

1. С помощью пипетки взять жидкость со дна пробирки, приготовить препарат «раздавленная капля» с добавлением раствора Люголя и «висячую каплю».

2. Культуру микроскопировать, в ней обнаруживается главным образом Clostridium pasteurianum - подвижные палочки с закругленными концами, одиночные и парные. В старых культурах у одного из концов клетки обнаруживается спора.

Исследовать спорообразование по Ауэски, результаты занести в табл. 1.

1. Сделать рисунок.

2. С культуральной жидкостью проводят качественную реакцию на масляную кислоту. Для этого к 5 мл жидкости добавляют 2 мл 5 %-ного хлорного железа. При нагревании образуется масляно-кислое железо коричневого цвета.

Морфология масляно-кислых бактерий

Метод, использованный для изучения морфологии

Внешний вид препарата при микроскопировании

«Висячая капля»

«Раздавленная капля» с раствором Люголя

Метод Ауэски для выявления спорообразования

Сделать обобщающий вывод по результатам исследования.

ВОЗБУДИТЕЛИ АНАЭРОБНЫХ ИНФЕКЦИЙ: СТОЛБНЯКА, БОТУЛИЗМА, ГАЗОВОЙ ГАНГРЕНЫ

Возбудитель стобняка

Таксономия

Семейство Bacillaceae, род Clostridium, виды C.tetani.

Морфологические и тинкториальные свойства

Грамположительная прямая палочка диаметром 0,5-1,1 мкм, перитрих. Капсул не образует. В мазках располагаются одиночно или цепочками.

Споры. Круглые, реже овальные, расположены терминально. Их диаметр в 2-3 раза превышает толщину бактерий, вследствие чего они напоминают «теннисные ракетки» или «барабанные палочки».

Культуральные свойства

Хемоорганотроф. Строгий анаэроб. Температурный оптимум 37єС.

На среде Китта-Тароцци рост медленный с равномерным помутнением и редким газообразованием. Культура издает неприятный запах выгребной ямы.

На кровяном агаре колонии круглые, плоские, с неровными краями, серые, вокруг колоний зона гемолиза.

В столбике сахарного агара колонии в виде комочков ваты.

На МПА и желатине возбудитель растёт медленно и образует тонкие прозрачные колонии двух типов: гладкие, прозрачные S-колонии и серовато-жёлтые, шероховатые R-колонии.

S-колонии образуют отростки, придающие им паукообразную форму.

Позднее отростки сливаются, образуя «сеточку» на поверхности среды.

При посеве столбиком в полужидкий агар через 24-48 ч S-колонии имеют вид пушинок с плотным коричневым центром; R-колонии имеют вид чечевичек.

Среда Цейсслера.

Биохимические свойства

Обладает слабыми протеолитическими свойствами - медленно гидролизует желатин, молоко свертывает к 4-7 дню в виде мелких хлопьев, не образует индола.

Восстанавливает нитраты в нитриты.

Сахаролитических свойств нет, лишь редкие штаммы ферментируют глюкозу, лактозу.

Не образуют каталазу и оксидазу.

Антигенная структура

О- (общий) и Н-антигены (типоспецифический). По Н-антигену различают более 10 серотипов.

Факторы патогенности

Главным фактором патогенности является вырабатываемый экзотоксин, который состоит из двух фракций - тетаноспазмин (нейротоксин) и тетанолизин (разрушает эритроциты).

Тетанолизин - мембранотрпный токсин, разрушает эритроциты, подавляет фагоцитоз, обладает кардиотоксическим и летальным действием.

Тетаноспазмин - полипептид, специфически связывается с нервными клетками в области их мионевральных синапсов.

Продвижение токсина происходит от нейрона к нейрону через синапсы, в результате, токсин накапливается в центральной нервной системе в двигательных зонах спинного и головного мозга. Он блокирует синаптическую передачу - тормозит освобождена медиаторов, таких как глицин, ацетилхолин, норадреналин и вызывает тонико-клоническое сокращение мышцы.

Тетаноспазмин чувствителен к кислороду, солнечном свету и нагреванию.

Резистентность

Вегетативные формы разрушаются при кипячении в течение 5 мин. Споры устойчивы к низким температурам, солнечному свету, к химическим веществам (1% сулема, формалин, 5% фенол уничтожают их через 14 часов). В почве могут сохраняться десятки лет, а при благоприятных условиях прорастать и размножаться.

Эпидемиология

Возбудитель распространен повсеместно в почве.

Основной путь передачи - контактно-раневой через поврежденные кожные покровы и слизистые оболочки. Основная группа риска - работники сельского хозяйства.

Больной столбняком человек неконтагиозен

Входными воротами служат различные раны: огнестрельные, колотые, резаные, занозы, потертости, ожоги, обморожения, операционные, травмированные родовые пути.

Выделяют также столбняк новорожденных, связанный с попаданием через пупочный канатик земли, глины, навоза и других субстратов. Летальность при этой форме составляет 85% идостигает максимальных значений на 6-8 день жизни больного ребенка.

Патогенез и клиническая картина

Заболевание начинается после прорастания в ране спор возбудителя и продуцирования вегетативными клетками описанных токсинов, которые гематогенным путем разносятся по организму.

В клинической картине ведущими симптомами являются - тоническое сокращение поперечнополосатый мускулатуры и повышенная рефлекторная возбудимость от внешних раздражений.

Инкубационный период в среднем 6-14 дней. Чем короче инкубационный период, тем тяжелее протекает процесс.

У человека столбняк протекает по нисходящему типу. Независимо от места проникновения возбудителя в организм:

· вначале наступает спазм жевательной мускулатуры (тризм) и затылочных мышц;

· затем поражаются мышцы лица - у больного появляется вынужденная «сардоническая» улыбка;

· далее наступает спазм мускулатуры туловища и конечностей.

Так как спастическое сокращение разгибательной мускулатуры спины выражено сильнее, чем сгибательных мышц живота, больной лежит, опираясь на затылок и таз.

Малейшее раздражение вызывает клонические судороги поперечнополосатой мускулатуры, в результате тело приобретает вид «дуги» с выгибанием позвоночника (опистотонус). При этом больной находиться в ясном сознании.

Смерть наступает от паралича сердца либо от асфиксии вследствие поражения мышц гортани и диафрагмы. Повышение температуры бывает редко.

При столбняке новорожденных первым симптомом является:

• отказ ребенка от груди в связи с сокращением челюстных мышц,

• затем возникает типичная поза «лягушонка» - ребенок лежит на спине с запрокинутой головой, с согнутыми и подтянутыми к туловищу ногами, на лице - страдальческое выражение.

При послеоперационном и послеабортном столбняке наблюдается:

· молниеносное течение заболевание,

· смерть наступает от паралича дыхательного центра или сердечной недостаточности.

Клинические формы:

• Лёгкая форма(локальный столбняк) характеризуется периодическими спазмами в поражённой области.

• Генерализованная форма (генерализованный столбняк). Наиболее частая форма с характерными мышечными спазмами. Характерны тонические спазмы лица и глотки, разбитость, тахикардия, аритмии, менингит, гипокальциемия.

Иммунитет

После перенесенного заболевания иммунитет не вырабатывается.

Стойкий и длительный иммунитет формируется только после искусственной иммунизации столбнячным анатоксином.

Профилактика

Плановая активная иммунизация детей и взрослых против столбняка:

Проводят столбнячным анатоксином в чистом виде иди всоставе вакцин АКДС, АДС-М, TABte. У детей в соответствии скалендарем (3 - 4, 5 - б мес, 28 мес, 7 дет, 14 лет),взрослым через каждые 10 лет после последней вакцинации.

Экстренная иммунопрофилактика в связи с травмами:

• Пассивная иммунизация - однократно 3000 ME.

• Активно-пассивная - вводят столбнячный анатоксин через 30 минут 3000 MEантитоксической сыворотки или 950 MEгомологичного иммуноглобулина.Рекомендуется лицам, которые не прививались против столбняка.

• Активная ревакцинация столбнячным анатоксином. Может применяться лицам, которые прошли полный курс иммунизации и ревакцинации против столбняка.

Лечение

Своевременная и правильная хирургическая обработка ран.

Водят противостолбнячную антитоксическую сыворотку, полученную путем гипериммунизации лошадей столбнячным анатоксином и токсином. Сыворотку применяют в дозе 350 МЕ/кг веса больного и после десенсибилизации внутримышечно (внутривенно). Сыворотку вводят повторно до исчезновения рефлекторных судорог

Также используют очищенный столбнячной антитоксин и человеческий (гомологичный) противостолбнячный иммуноглобулин.

Антибиотикотерапия - пенициллины, цефалоспорины.

Лабораторная диагностика

Материал для исследования - кусочки пораженный тканей, экссудат, перевязочный материал, инородное тело, выделения из пупочного канатика.

Бактериоскопическое исследование

Из отделяемого раны или экссудата готовят микропрепарат и окрашивают по Граму: обнаружение грамположительных прямых палочек с терминальным расположением спор.

Бактериологическое исследование

Выделение Clostridium tetani и идентификацию проводят по обычной для анаэробов схеме (смотри бактериологическое исследование газовой гангрены).

Специально для возбудителя столбняка предложен метод Филдса - исследуемый материал засевают на дно пробирки с сывороточным агаром и инкубируют 18-24 часа при 37єС.

Результат учитывают по наличию ползучего роста с образованием тонкой пленки на поверхности. Для получения чистой культуры проводят 3-5 таких пересевов.

Обнаружение столбнячного токсина

Биологическая проба на белых мышах.

- Исследуемый материал (некротизированная ткань или гной растираются в ступке с песком и физиологическим раствором) или фильтрат изучаемой культуры делят на две части

- Одну часть смешивают с антитоксической сывороткой и оставляют при комнатной температуре на 40 мин. (для нейтрализации токсина).

- После этого заражают белых мышей нативным материалом и смесью его с антитоксической сывороткой.

- При наличии в нативном материале столбнячного токсина опытные мыши погибают.

- Контрольные мыши, которым ввели смесь антитоксической сывороткой, остаются живыми.

Для обнаружения столбнячного токсина можно использовать РПГА с антительным диагностикумом, ПЦР, ИФА.

Возбудитель ботулизма

Таксономия столбняк гангрена ботулизм возбудитель

Семейство Bacillaceae, род Clostridium, виды C.botulinum.

Морфологические и тинкториальные свойства

Грамположительные крупные, полиморфные палочки с закругленными концами диаметром 0,5-1,5 мкм, имеют перитрихиальные жгутики. Капсул не образуют. Располагаются беспорядочно, иногда парами. Споры располагаются субтерминально (придает вид теннисной ракетки).

Культуральные свойства

Хемоорганотроф. Строгий анаэроб. Температурные оптимум 30-40єС.

На среде Китта-Тароцци рост с равномерным помутнением и газообразованием. Иногда отмечают запах прогорклого масла, но этот признак непостоянен.

На кровяном агаре колонии круглые, гладкие бело-серые или с неровными краями, неровные и матовы, вокруг колонийзона гемолиза.

В столбике сахарного агара колонии в виде пушинок.

На печёночном агаре образуют полиморфные звёздчатые колонии, в желатине -- сероватые, окружённые зоной разжиженной желатины.

Биохимические свойства

Сахаролитическая активность (до К и Г), протеолитическая: разжижает желатин, сыворотку, расщепляет яичный белок, кусочки мяса.

Бактерии I группы проявляют выраженные протеолитические свойства, гидролизуют желатину и эскулин, ферментируют глюкозу и мальтозу; проявляют липазную активность на яичном агаре.

Бактерии II группы проявляют сахаролитическую активность (глюкоза, мальтоза), но лишены протеолитической.

Бактерии III группы проявляют липазную активность и гидролизуют желатину.

Бактерии IV группы гидролизуют желатину, не проявляют сахаролитических свойств.

Антигенная структура

Жгутиковые группоспецифические (Н-) и соматические типоспецифические (О-) антигены. Образует 8 типов токсинов. Соответственно различают 8 серотипов - A, B, C1, C2, D, E, F, G.

Факторы патогенности

Главным фактором патогенности является вырабатываемый экзотоксин, который обладает выраженной нейротоксическим действием и представляет собой полипептид, состоящий из Н- иL-цепей:

Н-цепь ответственна за прикрепление нейротоксина к рецепторам мембраны клеток;

L-цепь - осуществляет блокирующее действие на холинергическую передачу возбуждения в синапсах.

Резистентность

Споры могут сохраняться десятки лет, а при благоприятных условиях прорастать и размножаться. Они хорошо переносят низкие температуры (до 19єC). Устойчива к нагреванию - переносят кипячение в течение 5 часов, при 105єС погибают через 1-2 часа, при 120єС - через 30 минут. Споры также устойчивы к бактерицидным веществам - 20% формалин убивает через 24 часа, этиловый спирт через 2 месяца, 10% хлор через 1 час.

Эпидемиология

Естественной средойявляется почва, откуда они попадают в воду, на пищевые продукты, фураж, в кишечник человека, животных, птиц и рыб.

Все продукты, загрязненные почвой, испражнениями человека и животных, могут быть причиной заболевания.

Основными факторами передачи являются консервированные продукты как домашнего, так и промышленного производства (мясные, рыбные, растительные, овощные, грибы, колбасы, ветчина и т.д.).

Ботулизм не контагиозен и возникает только при употреблении зараженного продукта.

Патогенез

Заболевания у человека вызывают бактерии типов А, В, Е и F; бактерии типов С и Dвызывают заболевания животных и птиц (в редких случаях от больных животных выделяют бактерии типов А и В). Патогенность типа G для человека и животных не доказана.

Главные факторы патогенности С. botulinum-- экзотоксины, так как в организме возбудитель практически не размножается.

Ботулизм протекает как токсикоинфекция. Ботулинический токсин быстро всасывается в желудке и кишечнике, проникает в кровь, оттуда во все органы, избирательно действует на ядра продолговатого мозга и ганглиозные клетки спинного мозга.

Клиническая картина

Инкубационный период от 2 часов до 10 дней, но чаще 18-24 часа.

Чем больше инфицирующая доза, тем короче инкубационный период и тяжелее протекает заболевание.

Клиническая картина складывается из сочетания мионеврологических синдромов:

Раньше всего появляется офтальмоплегический синдром - нарушение аккомодации, неравномерно расширяются зрачки, появляется косоглазие, двоение в глазах, опущение век и иногда слепота - эти симптомы связаны с поражением глазодвигательных нервов.

Затем присоединяются парез мускулатуры языка (афония), затрудненное глотание, парезы мышц туловища и шеи, парез кишечника с запорами и метеоризмом.

Температура может не повышаться, сознание сохраняется.

Смерть наступает от паралича дыхания и сердца. Летальность составляет до 85%.

Клинические формы:

• раневой ботулизм (возникает при загрязнении некротизированных тканей почвой),

• ботулизм новорождённых (развивается у детей от 3 до 20 нед при заглатывании спор с последующим развитием вегетативных форм),

• неопределённо классифицируемый ботулизм (у детей старше 1 года и взрослых), не связанный с указанными факторами риска (пища, рана).

Проявления заболевания зависят от природы пищевого продукта, ставшего причиной отравления, количества токсина, поступившего в организм, и состояния больного.

Первые, но непостоянные признаки -- желудочно-кишечные расстройства (тошнота, рвота, боли в животе). Часто больные жалуются на сухость во рту или гиперсаливацию. Одновременно развиваются головная боль и нервнопаралитические явления -- нарушения глотания, дисфагия и офтальмоплегический синдром. Часто наступают односторонний или двусторонний блефароптоз н анизокория -- результат поражения сфинктера зрачка. Циркуляция токсина в кровотоке приводит к уменьшению притока крови к правому предсердию.

Кроме поражения ЦНС, ботулотоксин вызывает периферические поражения нервно-мышечной передачи, проявляющиеся сначала вялостью движений или полной адинамией с последующим развитием парезов и/или параличей глазных, глоточных и гортанных мышц, а также мышц шеи и конечностей.

Иммунитет

Типоспецифический антитоксический иммунитет, продолжительной и напряженность умеренная. Не формируется, АТ против определённого серовара.

Профилактика

• Соблюдение санитарно-гигиенического режима при обработке продуктов для изготовления консервов, колбас, солений и т.д.

• Термическая обработка готовых продуктов (консервов). Для солений необходимо использовать крепкие солевые растворы - 10-12%.

• Бактериологический контроль готовой продукции, соблюдение правил транспортировки и хранения.

• Применение противоботулинического анатоксина.

Лечение

Введение антитоксической сыворотки - 35 тыс. МЕ.

В первые стуки вводят повторно через каждые 5-10 часов внутримышечно, в тяжелых случаях - внутривенно.

Вначале вводят поливалентную, после установления типа токсина только гомологичную антисыворотку.

Промывание желудка.

Антибиотикотерапия, симптоматическая и общеукрепляющая терапия.

Лабораторная диагностика

Материал дляисследования- промывные воды желудка, испражнения, моча, рвотные массы, остатки пищи.

Цель исследования - обнаружение идентификация возбудителя и токсина.

Бактериологическое исследование

- Выделение Clostridiumbotulinum идентификацию проводят по обычной для анаэробов схеме (смотри бактериологическое исследование газовой гангрены).

Обнаружение ботулинического токсина

Биологическая проба на мышах

Берут 5 мышей. Одну заражают только исследуемом материалом или фильтратом полученной культуры, а остальных сммью материала с 200 АЕ антитоксической сывороткой соответствующего типа - А, В, С, Е.

Смеси выдерживают предварительно при комнатной температуры 40 минут для нейтрализации токсина.

При наличии в материале ботулотоксина погибают все мыши, кроме тоой, котоой ввели смесь материла с соответствующей типоспецифической сывороткой, которая нейтрализовала действие токсина.

РПГАс антительнымдиагностикумом, ПЦР, ИФА.

Возбудитель газовой гангрены

Таксономия

Семейство Bacillaceae, род Clostridium, виды С. perfringens, С.novyi, С.septicum, С.histolyticuт, С.sordellii, С difficile, С sporogenes.

С. perfringens

Морфологические и тинкториальные свойства

Нормальный обитатель кишечника человека и животных. Толстая неподвижная грамположительная палочка со слегка закруглёнными концами диаметром 0,9-1,3 мкм. Споры овальные, располагаются чаще центрально. образуют капсулу.

Культуральные свойства

Температурный оптимум 45єС.

На кровяном агаре образуют зону гемолиза, в столбике сахарного агара образуются дисковидные колонии.

На плотных средах бактерии образуют S- и R-колонии. S-колонии круглые, сочные, куполообразные, с гладкими ровными краями. Сначала они прозрачные, позднее становятся мутными, серовато-белыми. R-колонии неправильной формы, бугристые, с неровными шероховатыми краями; в глубине агара напоминают комочки ваты.

На агаре Цейсслера через 12-18 ч образуют гладкие сероватые колонии с ровными краями и плотным возвышением в центре. Колонии окружены зоной гемолиза; гемолиз может быть полным либо частичным. Характерное свойство колоний С. perfringensтипа А, служащее дифференцирующим признаком. - способность менять серовато-белый цвет на зеленовато-оливковый после кратковременного пребывания в аэробных условиях.

На желточном агаре бактерии образуют колонии, окружённые зоной перламутрового преципитата (фосфорилхолин), образующегося из лецитина куриного желтка под действием лецитиназы.

Рост в жидких и полужидких средах. Культуры С. peifringens типа А имеют характерный запах масляной кислоты. Оптимум pH 7,2-7,4, но могут расти в интервале 5,0-8,5.

На средах, содержащих глюкозу, рост происходит очень бурно с образованием Н₂ и СО₂, и заканчивается через 8-12 ч.

Первые признаки роста на среде Китта-Тароцци могут проявляться уже через 1 --2 ч (особенно при 43 °С) и проявляются помутнением и появлением пузырьков газа из-под кусочков печени при встряхивании.

Биохимические свойства

Ферментирует также лактозу, мальтозу сахарозу с образованием кислоты и газа, не окисляют маннит.

Молоко створаживают через 3-5 часов образованием рыхлого сгустка отделением прозрачной сыворотки (с образованием крупноячеистого губчатого сгустка, напоминающего пену на волнах. Это феномен известен как «штормовая реакция»). Разжижает желатин.

Восстанавливает нитраты, расщепляет лактозу, образовывает лецитиназу.

Антигенная структура

6 сероваров (A-F).

Факторы патогенности

· Экзотоксин- гемотоксическое, нейротоксическое, некротическое, Лейкотоксическое и летальное действие:

o б-Токсин (лецитиназа С).Продуцируют все типы С. peifringens, но наиболее интенсивно тип А. Проявляет дерматонекротизирующее, гемолитическое и летальное (убивает лабораторных животных при внутривенном введении) действие.

o в-Токсин. Основные продуценты -- бактерии типов В и С. Проявляет некротизирующее и летальное действие; гемолитического действия не оказывает. Invivoвызывает развитие некротических энтеритов;

o д-Токсин. Основные продуценты -- бактерии типов В и С. Проявляет летальное действие и гемолитическую активность (лизирует эритроциты барана, но не эритроциты кролика или лошади).

o и-Токсин. Основной продуцент -- С. peifringensтипа С; бактерии типов А, В, Dи Е образуют его в меньших количествах. Проявляет дерматонекротизирующее, летальное действие и гемолитическую активность (разрушает эритроциты барана и лошади),

o е- и й-Токсины. е-Токсин продуцируют бактерии типов В и D, й-токсин -- бактерии типа Е.Проявляют летальное и дерматонекротизирующее действие.

o к-Токсин (коллагеназа и желатиназа). Продуценты -- бактерии типов А, С, Е и некоторые штаммы типа D. Разрушает ретикулярную ткань мышц и коллагеновые волокна соединительной ткани. Оказывает летальное и некротизирующее действие.

o л-Токсин (протеиназа).Проявляет активность экзоэнзима, обусловливающего некротические свойства. Расщепляет денатурированный коллаген и желатину; во многом напоминает действие фибринолизина.

o г- и з-Токсины. Оказывают летальное действие на лабораторных животных; их биохимическая природа остаётся неизвестной.

o м- и н-Токсины (гиалуронидаза и ДНКаза).м-Токсин ответственен за повышение проницаемости тканей. н-Токсин расщепляет нуклеиновые кислоты, тем самым нарушая реакции белкового синтеза.

· Энтеротоксин. Продуценты -- бактерии типов А и С, вызывающие пищевые токсикоинфекции. Термолабильный протеин, образующийся при споруляции бактерий в толстой кишке. Вызывает рвоту и диарею, оказывает летальное действие, а также обусловливает появление эритематозной кожной сыпи у лабораторных животных. Диарея развивается вследствие потери воды и электролитов за счёт дилатации и повышения проницаемости капилляров.

Патогенез и клиническая картина

Микроорганизмы, а чаще их споры могут быть занесены в рану из внешней среды, а также с кожи или из ЖКТ пациента.

Газовая гангрена:

· обширное отслоение кожных покровов,

· распад мышечной ткани,

· кровянистый экссудат,

· пузырьки газа в подкожной клетчатке,

· мышцы дряблые и имеют вид вареного мяса,

· образование газа с гнилостным запахом.

Пищевые токсикоинфекции:

С. petfringensтипа А вызывает преимущественно токсикоинфекциилёгкой и средней степени тяжести. Заболевания развиваются остро, с болями в животе, рвотой (иногда с примесью крови) и диареей (до 20 раз в сутки). Симптомы исчезают в последующие 12- 24 ч. Летальные исходы наблюдают редко, обычно у ослабленных пациентов -- пожилых лиц, хронических больных и детей с нарушениями питания.

С. petfringensтипа С вызывает некротический энтерит. При острых формах болезнь может закончиться смертью пациента в течение 12-24 ч. Симптомы аналогичны поражениям, вызываемым бактериями серовара А, и обусловлены действием -токсина.

С.novyi

Грамположительная полиморфная толстая палочка, диаметром0,8-1,4

мкм,могут располагаться в виде цепочек. Капсул не образует, перитрих. Споры овальные и располагаются субтерминально. Строгий анаэроб. Температурный оптимум 40-45єС.

На среде КиттаТароцци растет помутнение дает большой осадок. Наблюдается умеренная ферментация глюкозы с образованием газа. Молоко свертывают медленно, разжижает желатин. На кровяном агареобразует серые, бугристые колонии с приподнятым центром и зоной гемолиза. В столбике сахарного агарадает хлопьевидные колонии. Ферментирует глюкозу, мальтозу и не ферментирует лактозу.

Патогенность связана с экзотоксином, который оказывает такое же действие, что и при заражении С. perfringens.

По антигенной структуре выделяют₃ типа - А, в, С

C.septicum

Тонкая длинная полиморфная палочка, диаметром 1,1-1,6 мкм грамположительная. Споры располагаются субтерминально или центрально. Капсулы не образует, перитрихи.

На среде Китта-Тароцци растет в виде помутнения. Наблюдается ферментация глюкозы с образованием кислоты и газа. Молоко свертывают медленно, разжижает желатин.На кровяном агаре образует колонии с тонкими отростками и зоной гемолиза

В столбике сахарного агара колонии имеют вид Пушинок с уплотненным центром. Ферментирует глюкозу, мальтозу, лактозу с образованием кислоты и газа, не ферментирует маннит и сахарозу.

Продуцирует экзотоксин, обладающий гемотоксическим, некротоксическим и летальным действием.

C.histolyticum

В природе встречается в почве, веточных водах, иногда в кишечнике.

Прямая палочка диаметром 0,6-1 мкм, перитрих. Капсул не образует. Споры располагаются субтерминально. Углеводы не ферментирует.

На среде Киттз-Тароцци растет в виде помутнения. В столбике сахарного агара колони мохнатые и неправильной формы. На кровяном агаре колонии мелкие, прозрачные, как капельки росы с узкой зоной гемолиза. Обладает сильными протеолитическими свойствами - быстро разжижает желатин, свертывает молоко, вызывает протеолиз мягких тканей с обнажением костей и отпадением конечностей. Продуцирует некротоксический и летальный экзотоксины.

C.sordellii

Прямая грамположительная палочка диаметром 1,1-1,6 мкм, иногда образует цепочки, перитрих, капсул не образует, споры располагаются субтерминально или центрально.

Быстро разжижает желатин, ферментирует глюкозу, левулозу, мальтозу с образованием кислоты и газа. Медленно свертывает молоко.

Температурный оптимум 37єС.

C.sporogenes

Прямая палочка диаметром 0,3-0,4 мкм, грамположительна, перитрих, капсул не образует, споры располагаются субтерминально.

На среде Китта-Тароцци растет в виде помутнения и газообразованием. Температурный оптимум 30-40єС.

В ранах вызывает протеолиз мертвых тканей, обусловливая гнилостный запах.

C.difficile

Обнаруживается у 3% здоровых людей в кишечнике.

Палочка диаметром 1,3-1,6 мкм_, грамположительна, перитрих, капсул не образует, споры располагаются субтерминально.

Температурный оптимум 30-37єС.

На среде Китта-Тароцци растет в виде зернистого осадка. На плотных средах колонии круглые, серовато-белого цвета с матовой поверхностью. На кровяном агаре гемолиза не дает, молоко не створаживает.

Патогенность обусловлена токсическим комплексом из цитотоксина, энтеротоксина и летального токсина.

В 90-100% случаев является возбудителем антибиотикозависимых псевдомембранозных колитов

Эпидемиология

Резервуар инфекции - почва.

Путь передачи - раневой.

Патогенез и клиническая картина

Инкубационный период-до 5 дней.

Формы газовой гангрены:

· Анаэробная инфекция мягких конечностей и туловища.

· Анаэробная инфекция мозга.

· Послеродовая или послеабортная анаэробная инфекция.

· Анаэробная инфекция органов брюшной полости ибрюшины.

· Анаэробная инфекция органов грудной полости.

· Анаэробный остеомиелит.

Для анаэробной инфекции характерны:

прогрессирующий некроз тканей,

отек, газообразование в тканях,

отравление токсинами возбудителя и продуктами рас лада тканей.

Клостридии - некропаразиты, благоприятной средойдля их служат мертвые или поврежденные ткани. Наиболее опасны тяжелые повреждения с обширной раневой поверхностью, нарушением кровообращения, гематомами, размозжением мышц, раздроблением костей и т.д.

Попадая в такие раны, клостридии начинают быстро размножаться и выделять экзотоксин. Они проникают в здоровую ткань, вызывая их некроз.

В патогенном действии клостридии различают 2 стадии:

Образование отека. Вследствие действия токсина повышается проницаемость сосудов для плазмы, клеток крови. Это приводит к сдавливанию тканей и поступлению токсинов.

Развитие газовой гангрены - некроз мышечной и соединительной тканей. Газообразование является результатом активной ферментативной активности клостридииТоксины вызывают некроз тканей и сильнейшую интоксикацию. Чем больше зона поражения, тем сильнее интоксикация.

Иммунитет

Антитоксический ненапряженный иммунитет.

Лечение

-- активное хирургическое лечение -- широкое вскрытие всех подозрительных участков параллельными (лампасными) разрезами, иссечение нежизнеспособных тканей, дренирование раны, которая должна оставаться открытой. В дно и края ран вводят антибиотики широкого спектра действия. При подтверждении диагноза и распространении гангрены необходима немедленная ампутация или экзартикуляция конечности. Рану после ампутации зашивать нельзя.

-- общие мероприятия - интенсивная инфузионная терапия с введением альбумина, плазмы, растворов электролитов и белков. В/в или в/aвводят высокие дозы антибиотиков.

-- Противогангренозные антитоксические сыворотки (при выявлении возбудителя - моновалентные, а при не установленном - поливалентные) вводят внутривенно в дозе

150000 АЕ + специфический иммуноглобулин.

Профилактика

ПХО раны с иссечением нежизнеспособных тканей, краёв и дна раны в пределах здоровых тканей, + местная и общая терапия антибиотиками широкого спектра действия.

Активная профилактика -- анатоксин.

Пассивная профилактика: противогангренозная антитоксическая сыворотка.

Лабораторная диагностика

Материал для исследования - кусочки пораженный тканей, отечная жидкость, перевязочный материал, почва, испражнения, продукты.

Бактериоскопическое исследование

Из отделяемого раны или экссудата готовят микропрепарат и окрашивают по Граму

Результат - обнаружение грамположительных палочек.

Бактериологическое исследование

1этап

Посевматериала в прогретую в течение 30 минут при 85єС среду Китта-Тароцци, повторно кипятят и инкубируют от 20 минут до 3-5 часов.

2 этап

Учет результатов в среде Китта-Тароцци по наличию помутнения, осадка и газообразования.

Пересев:

? на сахаро-кровяной агар по методу Цейсслера,

? в столбики сахарного агара по методу Вейнберга.

Инкубация 18-24 часа при 37єС.

3 этап

Учет результатов на питательныхпо признакам:

Культуральным в зависимости от возбудителя (бело-серые круглые колонии на КСА и рост в виде пушинок, комочков ваты или округлыхзерен на СА).

Обнаружение грамположительных палочек в мазках, окрашенных по Граму.

Наличие гемолиза.

Пересев подозрительных колоний в среду Китта-Тароцци.

Инкубация 18-24 часа при 37єС.

4 этап

Идентификация чистой культуры следующим признакам:

Обнаружение грамположительных палочек в мазках, окрашенных по Граму.

Биохимические свойства -сахаролитические и протеолитические (в зависимости от возбудителя).

Заражение белых мышей исследуемым материалом или фильтратом бульонной идентификации токсина (токсигенности) помощью реакции нейтрализации.

Ускоренная диагностика:

РИФ, ПЦР, ИФА.

Посев материала в прогретую среду Китта-Тароцци, Вильсона-Блера и в молоко. Инкубация в термостате 5-6 часов при 37єС.

В результате: в ср. Китта-Тароцци - помутнение и газообразование, в ср Вильсона-Блера - почернение среды, в молоке - створаживание.

Лабораторная диагностика возбудителей анаэробных инфекций

Материал для исследования:

· возбудитель столбняка-кусочки пораженных тканей, экссудат, перевязочный материал, инородное тело, выделения из пупочного канатика.

· возбудитель ботулизма-промывные воды желудка, испражнения, моча, рвотные массы, остатки пищи.

· возбудитель газовой гангрены -кусочки пораженный тканей, отечная жидкость, перевязочный материал, почва, испражнения, продукты.

Бактериоскопический метод

Из исследуемого материала делают мазок, окашивают по Граму, обнаруживают Грам+ палочки.

Если материал был взят из внешней среды, то применяют окраску по Цилю-Нильсену (выявление спор: возбудитель столбняка - круглые, реже овальные, терминальные, напоминают «барабанные палочки;

возбудитель ботулизма - располагаются субтерминально, вид теннисной ракетки;

возбудитель газовой гангрены - споры овальные, располагаются чаще центрально). Для выявления С. perfringensмазок окрашивают по Бурри-Гинсу(выявление капсул).

Бактериологический метод (основной)

Изначально делают посев материала на прогретую на водяной бане в течение 30 минут при 85єС (чтобы растворить кислород и убрать вегетативные форы сопутствующей микрофлоры) среду Китта-Тароцци, заливают маслом, повторно кипятят и инкубируют от 20 минут до 3-5 часов.

Китта-Тароцци (помутнение, газообразование, возможно растворение кусочков паренхиматозных органов).

Делаем пересев на какую-нибудь плотную среду:

-- Вильсона-Блера (почернение среды, колонии в виде «маковых зерен»),

-- Цейсслера -- кровяно-сахарный агар (сероватые колонии в виде «паучков», окруженные зоной гемолиза),

--Высокий столбик сахарного агара (S-форма - в виде зерен чечевицы, R-форма -- в виде пушинок),

--Железосульфитный агар.

Получаем выросшую культуру. Затем выделяем чистую культуры, накапливаем на среде Китта-Тароцци. Чистая культура выделяется и накапливается на жидкой питательной среде, потому что среду Китта-Тароццци можно профильтровать и процентрифугировать. Полученный осадок используют для микроскопии. Надосадочную жидкость - для постановки реакции нейтрализации на белых мышах.

Реакция нейтрализации:

Одной мышке вводим порцию надосадочной жидкости в нативном состоянии, второй мышке вводим часть надосадочной жидкости, смешанной со специфической анатотоксическойсывороткой, предварительно выдержанной в термостате в течение 30-60 минут. Первая мышка обязательно погибает, так как ей ввели экзотоксин, вторая мышка выживает, потому что мы ввели ей экзотоксин,смешанныйсо специфической анатотоксической сывороткой, и произошла реакция нейтрализации. Особенно широко применяется для выявления ботулизма, а именно для выявлениятипаботулотоксина: одной мышке вводят часть надосадочной жидкости, смешанной с антисывороткой типа А, второй -смешанной сантисывороткой типа В, третьей смешанной с антисывороткойтипа Е, четвертой только нативнуюнадосадочную жидкость. Последняя мышка точно погибнет, из других может кто-то выживет.

Размещено на Allbest.ru