Вплив похідних піролу на слизову оболонку товстої кишки щурів, порівняно з глюкокортикоїдним препаратом, за умов розвитку експериментального коліту

Размещено на http://www.allbest.ru/

Вплив похідних піролу на слизову оболонку товстої кишки щурів, порівняно з глюкокортикоїдним препаратом, за умов розвитку експериментального коліту

Марина Єна,

Галина Кузнецова,

Наталія Дзюбенко,

Володимир Рибальченко

Досліджено стан слизової оболонки нисхідної ободової кишки щурів за умов дії похідних піролу 5-аміно- 4-(1,3-бензотіазол-2-іл)-1 -(3 -метоксифеніл)-1,2-дигідро-3Н-пірол-3 -ону (Д1) та 1 -(4-С1-бензил)-3-С1-4-(СГ₃- феніламіно)-1Н-пірол-2,5-діон (МІ-1), які характеризуються цитостатичною дією, протизапальними властивостями та не пошкоджують слизову оболонку товстої кишки щурів, про що свідчать отримані дані. Установлено, що МІ-1 за умов індукованого експериментального коліту виявляє максимальний протизапальний та захисний ефект щодо слизової оболонки низхідної ободової кишки, тоді й захисна дія Д1 та комбінації Д1 і МІ-1 є значно слабшими. Сумісна дія похідних піролу із традиційним протизапальним засобом - преднізолоном - відносно слизової оболонки низхідної ободової кишки при застосуванні за умов коліту є слабшою, порівняно з преднізолоном і, зокрема, із досліджуваними похідними піролу. При цьому в ряду преднізолон+МІ-1, предні- золон+Д1, преднізолон+Д1+М1 протизапальна активність спадає.

Ключові слова: експериментальний коліт, преднізолон, похідні піролу, слизова оболонка низхідної ободової кишка.

Ена Марина, Кузнецова Галина, Дзюбенко Наталия, Рыбальченко Владимир. Влияние производных пирролов на слизистую оболочку толстой кишки крыс по сравнению с глюкокортикоидными препаратами в условиях развития экспериментального колита. Исследовано состояние слизистой оболочки нисходящей ободочной кишки крыс в условиях действия производных пирола 1-(4-Сl-бензил)-3-Сl-4-(СFз-фениламино)- 1Н-пирол-2,5-диону (МИ-1) и 5-амино-4-(1,3-бензотиазол-2-ил)-1-(3-метоксифенил)-1,2-дигидро-3Н-пирол-3- ону (Д1), характеризующихся цитостатическим действием, противовоспалительными свойствами, отсутсвием повреждения толстого кишечника крыс, о чем свидетельствуют данные микроскопических исследований. Установлено, что МИ-1 при индуцированном экспериментальном колите проявляет максимальный противовоспалительный и защитный эффект в отношении слизистой оболочки нисходящей ободочной кишки, тогда как защитное действие Д1 и комбинации Д1 и МИ-1 значительно слабее. Совместное действие производных пиррола с традиционным противовоспалительным средством - преднизолоном относительно слизистой оболочки нисходящей ободочной кишки при применении в условиях колита является более слабым по сравнению как с преднизолоном, так и с исследуемыми производными пиррола отдельно. При этом в ряду предни- золон+МИ-1, преднизолон+Д 1, преднизолон+Д 1+МИ-1 противовоспалительная активность падает.

Ключевые слова: экспериментальный колит, преднизолон, производные пиррола, слизистая оболочка нисходящей ободочной кишки.

Yena Maryna, Kuznietsova Halyna, Dzybenko Natalija, Rybalchenko Volodumyr. Pyrrole Derivatives' Effects on rat Colon Mucosa Compared with Glucocorticoid Drugs Under Experimental Colitis. The influence of the pyrrole derivative 1-(4-Cl-benzyl)-3-Cl-4-(CF₃-phenylamino)-1H-pyrrol-2,5-dione (MI-1) and 5-amino-4-(1,3-benzothyazol-2- yl)-1-(3-methoxyphenyl)-1,2-dihydro-3Н-pyrrol-3-one (D1) on rat colon mucosa was investigated. Cytostatic effects, inflammatory properties and safety for rat large intestine, have been shown in previous experiments as evidenced by microscopic studies. MI-1 under induction of experimental colitis revealed the maximum inflammatory and protective effect on the descending colon mucosa whereas protective effects of D1 and D1 combination with MI-1 were much weaker.

Antiinflammatory effects of pyrrole derivatives' combinations with reference drug - prednisolone, were weaker compared to prednisolone, D1, MI-1 ones separately. Wherein antiinflammatory properties falled off due prendnisolone+MI-1, prednisolone+D1, prednisolone+D1+MI-1 sequence.

Key words: experimental colitis, prednisolone, pyrrole derivative, mucosa descending colon.

Постановка наукової проблеми та її значення

Запальні захворювання кишечнику (ЗЗК), до яких традиційно належить виразковий коліт (ВК), - одна з найбільш серйозних проблем сучасної гастроентерології, що обумовлено їх постійно зростаючою поширеністю у всьому світі, хронічним, неухильно прогресуючим перебігом та ризиком кишкових і позакишкових ускладнень [1, 2]. Незважаючи на численні дослідження, етіологія ВК достеменно невідома. Серед її причин називають спадковість, алергічні реакції, харчування, тривале застосування нестероїдних протизапальних засобів тощо [2, 3]. Наслідком хронічної форми ВК у більшості випадків може бути розвиток злоякісних новоутворень - колоректального раку [1; 4; 5].

Перспективним здобутком для лікування злоякісних новоутворень є таргетні препарати, що вибірково діють на молекулярні мішені - ключові молекули сигнальних шляхів, які відповідають за передачу проліферативного сигналу, процеси апоптозу, контроль клітинного циклу та ін. Сьогодні вже доведено, що вказані засоби характеризуються високою протипухлинною активністю й значно меншою токсичністю, порівняно з класичними цитостатиками, а також мають протизапальні властивості [4; 6; 7; 8].

До препаратів цього класу відносять похідні піролу 1-(4-С1-бензил)-3-С1-4-(СР₃-фешламшо)-1Н- пірол-2,5 -діон (МІ-1) та 5-аміно-4-( 1,3-бензотіазол-2-іл)-1 -(3 -метоксифеніл)-1,2-дигідро-3Н-пірол-3 - он (Д1), синтезовані методом іп 8І1іео дизайну Науково-виробничим хіміко-біологічним центром Київського національного університету імені Тараса Шевченка [9], що мають виражену цитостатичну дію, показану на лініях трансформованих [10] і ракових клітин [11-14]. Також установлено, що ці сполуки сприяють зменшенню запалення, що супроводжує розвиток раку, та оксидативного стресу [15, 16]. Отже, дослідження впливу похідних піролу на розвиток експериментального коліту є перспективним із погляду можливості застосування цих сполук за умов передракових станів для попередження злоякісного переродження клітин слизової оболонки товстої кишки.

Мета дослідження - вивчення впливу похідних піролу на стан слизової оболонки низхідної ободової кишки щурів за умов експериментального коліту, порівняно з традиційним протизапальним препаратом на основі глюкокортикоїдів - преднізолоном.

Матеріали та методи дослідження. Дослідження проведено відповідно до загальноприйнятих біоетичних норм гуманного поводження з лабораторними тваринами згідно з національними та міжнародними положеннями стосовно проведення експериментальних робіт («Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для дослідних і наукових цілей» (Страсбург, 1986); «Загальних етичних принципів експериментів на тваринах», ухвалених Першим національним конгресом біоетики (Київ, 2001).

Експерименти проводили протягом двох тижнів на 60 білих лабораторних нелінійних щурах- самцях із початковою масою 213 г. Тварин утримували на стандартному раціоні віварію. Модель експериментального виразкового коліту відтворювали 2-кратним ректальним уведенням 1 мл 4 % розчину оцтової кислоти з інтервалом в один тиждень. Попередньо тваринам очищали товсту кишку за допомогою ректального уведення 2-3 мл фіз. розчину з наступним масажем нижньої частини черева для полегшення випорожнення за 10-15 хв до уведення оцтової кислоти. МІ-1 у дозі 2,7 мг/кг та Д1 у дозі 2,3 мг/кг уводили щоденно інтрагастрально, розчиненими в соняшниковій олії, що містить 15 % ДМСО (усього 0,1 мл). Преднізолон (ПрАТ «БІОФАРМА», Україна, розчин для ін'єкції) у дозі 0,7 мг/кг [17, 18] уводили щоденно внутрішньоочеревинно розведеним у фізіологічному розчині. Перше уведення сполук здійснювали через 2 год після першого уведення оцтової кислоти. Контрольні тварини отримували відповідні розчинники. Тварин розділено на дев'ять груп (n=7): I - контроль, II - експериментальний коліт, III - коліт +Д1, IV - коліт + МІ-1, V - коліт + Д1 + МІ-1, VI - коліт + Преднізолон, VII - коліт + Преднізолон + Д1, VIII - коліт + Преднізолон + МІ-1, IX - коліт + Преднізолон + Д1 + МІ-1. Щурів умертвляли через добу після останнього уведення речовин за допомогою інгаляції CO₂ та наступною цервікальною дислокацією.

На макроскопічному рівні оцінювали стан слизової оболонки низхідної ободової кишки за 10-бальною шкалою згідно з §ehirli та ін. (2009) [19]. Для гістологічних досліджень брали сегменти товстої кишки (низхідна ободова кишка), які фіксували в 10 % нейтральному сольовому формаліні, виготовляли парафінові зрізи та забарвлювали гематоксиліном-еозином за стандартною методикою [20].

Препарати аналізували на світлооптичному рівні за допомогою мікроскопа Olympus BX41 (Olympus Europe GmbH, Японія), кольорові мікрофотографії отримували за допомогою цифрової фотокамери Olympus C-5050 Zoom (Olympus Europe GmbH, Японія) та вказаного мікроскопа. Оцінювали загальний стан слизової оболонки низхідної ободової кишки, ступінь запального процесу оцінювали за 11-бальною шкалою згідно з Appleyard and Wallace, 1995 [21].

Морфометричні дослідження проводили за допомогою програми WCIF ImageJ. Вимірювали товщину слизової оболонки, глибину й ширину крипт, висоту колоноцитів, площу поперечного перетину келихоподібних клітин та ядер колоно- цитів. Підраховували відносну кількість біфуркаційних крипт, відносну кількість келихоподібних клітин і мітотичний індекс клітин у криптах.

Статистичну обробку експериментальних даних здійснювали методами варіаційної статистики [22] за допомогою пакета програм SPSS 16.0: дані перевіряли на нормальність розподілу за допомогою Z-тесту Колмогорова-Смирнова, міжгрупові порівняння виконували методом однофакторного дисперсійного аналізу (ANOVA) з використанням для апостеріорних множинних порівнянь F-кри- терію Фішера, а також за допомогою U-тесту Манна-Уїтні. Різниця між значеннями порівнюваних показників вважалася вірогідною при р<0,05.

Виклад основного матеріалу й обґрунтування отриманих результатів дослідження

У щурів контрольної групи слизова оболонка низхідної ободової кишки має типову гістологічну будову, що характерна для цього виду піддослідних тварин, без ознак патологічних процесів. Морфометричні дані представлено в табл. 2.

Вплив індукованого коліту на слизову оболонку низхідної ободової кишки щурів

За умов індукованого коліту виявлено незначні тріщини та виразкоутворення на поверхні слизової оболонки, також простежено ознаки запалення (гіперемія, міграція лейкоцитів), зміни судинного русла, (діапедезні крововиливи та кровостази), а також десквамацію поверхового епітелію (табл. 1). Порівняно з контролем, вірогідних змін морфометричних показників не виявлено (табл. 2; 3), що підтверджує відсутність атрофічних змін у клітинах слизової оболонки. Згідно з літературними даними, ці явища свідчать про розвиток коліту без атрофії [1, с. 23].

Вплив преднізолону на слизову оболонку низхідної кишки щурів при виразковому коліті

При макроскопічному огляді пошкоджень кишки тварин цієї групи не простежено, а при мікроспопічному зникала десквамація поверхового епітелію слизової оболонки, хоча помітні ознаки запалення у вигляді незначної інфільтрації лімфоцитами та спазму кишкової стінки (табл. 1). Порівняно з контролем, вірогідних змін морфометричних показників не виявлено, проте відносно групи коліту знижувалася кількість келихоподібних клітин на 13,8 %, що вказує на зниження кількості продукованого слизу (табл. 3).

Отриманні результати свідчать про зниження запального процесу та відновлення цілісності слизової оболонки товстої кишки.

Вплив МІ-1 на слизову оболонку низхідної кишки щурів при експериментальному коліті

На макроскопічному рівні пошкодження кишки не простежували. При гістологічному дослідженні зникали десквамація поверхового епітелію й ознаки спазму кишкової стінки (потовщення м'язового шару), зменшувалося запалення слизової оболонки, проте виявлено деякі порушення судинного русла (еритростаз, незначні діапедезні крововиливи) (табл. 1). Показники морфометрії після лікування МІ-1 наближалися до контрольної групи, а порівняно з групою коліт, зростала площа ядер колоноцитів на 18,9 %, що засвідчує посилення функціональної активності колоноцитів (табл. 2).

Згідно з отриманними даними, МІ-1 пригнічує запальний процес і цілісність слизової оболонки товстої кишки.

Вплив Д1 на слизову оболонку низхідної кишки щурів при експериментальному коліті

При макроскопічному огляді пошкодження кишки не простежено. На мікрорівні виявляли зникнення десквамації епітелію, відсутність спазму кишкової стінки, проте помітні зміни слизової оболонки у вигляді запального процесу, порушення мікроциркуляторного русла (гіперемія) та розростання лімфатичної тканини, тобто зміни, подібні до таких при МІ-1, але дещо більш виражені [1, с. 27] (табл. 1). Аналізуючи дані морфометрії, простежили вірогідне зростання товщини слизової оболонки на 31,8 % (табл. 2), порівняно з показниками контрольної групи, що може бути пов'язано з активацією захисних процесів у слизовій оболонці ободової кишки.

Отже, Д1 сприяв відновленню цілісності поверхового епітелію слизової оболонки товстої кишки та зменшенню рівня запалення.

Сумісна дія МІ-1+Д1 на слизову оболонку низхідної кишки щурів при експериментальному коліті

На макрорівні виявлено запальні зміни слизової оболонки в цій групі, проте на мікрорівні про- стежено ознаки запального процесу, дифузного злущення поверхового епітелію, гіперемії та стазу крові в капілярах, а також ознаки спазму кишкової стінки (табл. 1). Аналізуючи дані морфометрії, помітили вірогідне зростання товщини слизової оболонки на 34,4 %, що засвідчує активацію компенсаторних процесів і зменшення мітотичного індексу клітин крипт на 32,6 % (табл. 2; 3). Це означає пригнічення проліферативної активності клітин, зумовлене цитостатичними властивостями похідних піролу [9].

Отже, за умов сумісної дії Д1 та МІ-1 макроскопічні ознаки коліту зникають, проте порушення капілярного кровотоку зберігається.

Таблиця 1 Макро- та мікроскопічні зміни низхідної ободової кишки щурів при дії похідних піролу та преднізолону за умов виразкового коліту