Пошук сайту зв'язування каліксаренів із кіназою легких ланцюгів міозину методом молекулярної динаміки

Размещено на http://allbest.ru

^{1Київський національний університет імені Тараса Шевченка}

²Інститут молекулярної біології і генетики НАН України

¹А. Заремба, студент

²М. Платонов, канд. біол. наук

Анотація

Порушення функціональної активності гладеньких м'язів людини пов'язують зі значною кількістю патологічних станів людського організму. Кіназа легких ланцюгів міозину є ключовим ферментом сигнального каскаду передачі нейрогуморальних сигналів у гладеньком'язових клітинах. Особливо важлива її роль у довготривалому тонічному скороченні. Порушення її кіназної активності здатне привести до послаблення міжклітинної взаємодії епі- та ендотеліоцитів, порушення роботи гладеньких м'язів кишківника та судин, ускладнення пологової діяльності. Нині проводиться пошук ефекторів цього ферменту. Проблема полягає у тому, що більшість ліків відсіюється на загальноорганізменому рівні у зв'язку з токсичним впливом на інші тканини (органи) або несприятливими хімічними та фізичними властивостями. Такі речовини потребують адаптерів (переносників), позбавлених цих недоліків та інертних invivo. Найбільш перспективними є каліксарени.

Значна кількість патологічних станів людського організму пов'язана із порушенням функціональної активності гладеньких м'язів [1]. Наприклад, її гіперфункція призводить до збільшення інвазивності мутованих клітин пухлинних утворень, викликаючи тим самим перехід доброякісної форми захворювання у злоякісну [2].

Якщо гіперфункція є важливим показником в патологічних умовах, то гіпофункція є маркером багатьох хвороб сама по собі, зокрема вона спостерігається при порушенні перистальтики кишечника, діабеті, дисфункції ендотеліальних бар'єрів і т.п. [3,4].

Окремого статусу із цього переліку заслуговують різні порушення роботи гладеньких м'язів, зокрема - дистоція (збірне поняття, яке означає будь-які ускладнення пологів).

Все частіше у молодих та відносно здорових жінок зустрічається дисфункція міометрію при пологах. При цьому об'єктивної причини таких ускладнень до цього часу визначити не вдалось [5].

Оскільки КЛЛМ (кіназа легких ланцюгів міозину) виконує важливу роль при скороченні ГМ (гладеньких м'язів), видається перспективним проведення досліджень по підбору речовин, здатних впливати на активність даної кінази [6].

Однак значна кількість речовин, що є потенційними лікарськими засобами, не здатні проникати в клітину або є занадто токсичними для їх безпосереднього введення в організм. Тому перспективним є використання допоміжних сполук-переносників, які в ідеальному випадку не мають власної активності та мають єдину функцію - покращення фармакологічних властивостей цільового лікарського засобу.

На даний момент найбільш перспективними платформами для розробки таких переносників є каліксарени. Вони здатні хелатувати лікарські препарати та, завдяки наявності чотирьох модифікованих бензольних кілець, проникати в клітину, переносячи цільові молекули [7].

Дане дослідження спрямоване на визначення сайтів взаємодії калікс [4] арентетрасульфату із КЛЛМ. Його метою є визначення локалізації та енергії взаємодії калікс [4] арентетрасульфату із кіназою легких ланцюгів.

Матеріали і методи дослідження

В даному дослідженні були використані три програми.

ICM - пакет, основним призначенням якого є докінг. Тут був проведений власне докінг каліксарену та вибраний комплекс із найбільшим енергетичним виграшем (використовувалась стандартна процедура).

Gromacs - пакет із великою кількістю утиліт та підпрограм, призначений для моделювання методом МД (молекулярної динаміки) та аналізу результатів. Є світовим стандартом для проведення молекулярно- динамічних досліджень. Основними його перевагами є безкоштовність, універсальність та новітність.

Тут система моделювалась із явним розчинником та фізіологічною концентрацією NaCl протягом 50 нс. PyMol - програма-візуалізатор. Була використана для аналізу первинної, вторинної та третинної структури цільових молекул.

Як згадувалось раніше, метою нашого дослідження є визначення локалізації та енергії взаємодії калікс [4] арентетрасульфату із кіназою легких ланцюгів. Виходячи із цього був проведений докінг ліганду в каталітичну кишеню кдКЛЛМ (каталітичного домену кінази легких ланцюгів міозину). Найбільш енергетично виграшним виявилось положення каліксарену в каталітичній кишені.

В даному положенні він знаходиться в оточенні позитивно заряджених залишків лізину та аргініну з якими здатен вступати в кулонівські взаємодії. Також тут наявний і аспарагін, що дозволяє припустити утворення водневих зв'язків. В даному випадку донором буде аміногрупа аспарагіну, акцептором - один із атомів оксигену сульфатної групи. Крім того, каліксарен здатен взаємодіяти безпосередньо із атомами, що беруть участь в утворені пептидного зв'язку.

Основним інструментом для проведення та аналізу експериментальної частини був використаний пакет для досліджень методом МД - Gromacs. Особливістю даного програмного забезпечення є велика варіабельність параметрів моделювання, тому є доцільним достатньо детально описати процес підготовки та моделювання молекулярно-динамічної системи.

Після докінгу каліксарену в вибраний сайт зв'язування систему було розділено на два окремих файли. Структура кдКЛЛМ була конвертована в формат .pdb, а ліганд в ,mol2. Каліксарен - нетипова структура тому силами Gromacs генерувати його топологію неможливо. Для цього був використаний безкоштовний ресурс swissparam.sh. Натомість кіназа - це типова білкова молекула, тому утиліти "pdb2gmx" та силового поля CHARMM27 цілком достатньо для отримання її топології.

Після генерування необхідних даних щодо топології каліксарену та кінази, був власноруч створений файл комплексу протеїн-ліганд та відредаговано файл формату .top кдКЛЛМ, зокрема в тілі файлу було прописане посилання на топологію ліганду.

Для проведення моделювання був вибраний бокс октаедральної симетрії. Такі комірки є найбільш оптимізованими, оскільки мають найкраще співвідношення об'єм/ресурси. Розмір боксу був розрахований автоматично утилітою "editeonf" та є таким, що мінімальна відстань від білка до стінки складає 1нм. гладеньком'язовий кишківник кіназа міозин

Система була сольватована явним розчинникоміз використання однієї із найпоширеніших моделей води TIP3P, параметризовано'!' у силовому полі CHARMM27. Незважаючи на деяку "грубість" даної моделі, вона є достатньо реалістичною та найменш ресурсоємкою.

Далі підготовка системи була проведена за загальним алгоритмом, тому буде достатньо описати її загальні положення. Для нейтралізації зарядів білка та максимального наближення системи до природніх умов був доданий NaCl у фізіологічній концентрації (156 мМ).

Також щоб переконатись, що система не має занадто напружених ділянок (перекривань, жорстких стеричних обмежень, тощо), була проведена мінімізація енергії. Тут був використаний дуже поширений алгоритм найскорішого спуску. Перед процедурою врівноваження розчинника була добавлена група закріплення, до якої входили ліганд та білок. Саме врівноваження було проведено стандартно в дві фази. Спочатку система розглядалась як ізотермічно-ізохорична за температури в 300К. Далі як ізотермічно-ізобарична за тієї ж температури. Після усіх підготовчих етапів система була запущена в утиліті "mdrun" для моделювання на 50 нс з ітерацією в 2 фс.

Результати дослідження та їх обговорення

Оскільки найбільш далекодіючими є кулонівські взаємодії, доцільніше почати саме із їх аналізу, адже саме ці сили будуть орієнтувати ліганд відносно білка в реальному розчині. На графіку видно, що кулонівські сили є нестабільними в даному комплексі (рис. 1.,2).

Рис. 1. Графік зміни енергії кулонівських (2) та вандервальсових(І) взаємодій комплексу в часі

Рис. 2. Графік динаміки утворення водневих зв'язків між каліксареном та кіназою легких ланцюгів міозину

Спочатку енергія електростатичної взаємодії росте, проте згодом, на восьмій наносекунді, починає падати. Надалі прослідковується поступове посилення іонної взаємодії.

В певні періоди спостерігаються значні флуктуації, як в сторону посилення взаємодії, так і в сторону її послаблення.

Цілком можливо, що в даному комплексі електростатичні взаємодії є важливими на значних відстанях. Вони можуть виконувати орієнтувальну функцію, оскільки, хоч і мають значний ступінь свободи, характеризуються достатньо значною силою взаємодії, із середнім падінням вільної енергії в --122 кДж/моль.

Якщо на дальніх відстанях значний внесок мають іонні взаємодії, то на рівні кількох ангстрем великого значення набувають водневі та вандерваальсові взаємодії.

Як згадувалось раніше, значний внесок у взаємодію білок-ліганд даного комплексу можуть мати водневі зв'язки (рис. 2).

Тенденцію до такого типу взаємодії можна було спрогнозувати вже на рівні докінгу. Так і виявилось. Середнє значення кількості водневих зв'язків коливається на рівні 2-3, що є достатньо непоганим показником.

Враховуючи, що середнє значення енергії розриву водневого зв'язку коливається в межах 25 кДж/моль, на близьких відстанях загальна енергія системи ще сильніше падає і буде становити ~- 200кДж/моль.

Крім водневих зв'язків на близькій відстані великого значення набувають вандерваальсові взаємодії.

Незважаючи на незначну силу даного типу зв'язку, із графіку видно, що достатньо значна частина падіння загальної вільної енергії системи припадає саме на ці взаємодії.

Їх середня енергія дорівнює в даному випадку ~ -109кДж/моль. Що в сумі із попередніми типами взаємодій дає достатньо значну енергію зв'язування в ~ -300кДж/моль за фізіологічних умов.

Для підсумування попередніх результатів та створення більш наглядної картини, був використаний графік середньоквадратичного відхилення координат атомів ліганду (RMSD) (рис. 3).

Він дозволяє побачити як змінювалось положення ліганду відносно його початкового положення з часом.

Як видно з графіку, система достатньо швидко стабілізувалась і вже на третій наносекунді відхилення ліганду становили не більше 0,1 ангстрема, що є дуже гарним значенням для будь-якої стабільної структури, включаючи і протеїн-лігандні комплекси.

На сороковій наносекунді можна спостерігати достатньо значні аберації. За умови відсутності достатньо стабільної ділянки в 35нс можна було б сказати, що система дуже нестабільна, проте це твердження є хибним. У даному випадку утиліта "energy" розпізнала перехід ліганду через стінку боксу як аберацію. Про це свідчить і надзвичайно швидка стабілізація ліганду у вихідному положенні на 48мій наносекунді.

Висновки

З огляду на все вище сказане можна стверджувати, що утворення комплексу між калікс[4]арентетрасульфатом та КЛЛМ є достатньо ймовірним. Значна енергія далекодіючих кулонівських та близькодіючих вандерваальсових взаємодій, велика кількість водневих зв'язків і, як наслідок, висока стабільність комплексу наштовхують саме на таку думку.

Крім того, отримані результати свідчать про те, що ліганд зв'язується із КЛЛМ у каталітичній кишені, тому можна припустити вплив калікс [4] арентетрасульфату на її каталітичну активність. Зміна ферментативної активності кінази, в свою чергу, може впливати на фармакологічну картину цільового препарату. Тому можна стверджувати, що використання даного каліксарену як системи для доставки ліків є недоцільним.

Список використаних джерел:

1. Киназа легких цепей миозина mylk1: анатомия, взаимодействия, функции и механизмы регуляции / А. Хапчаев, В. Ширинский // Успехи биологической химии. - 2016. - Т. 56. - С. 211-258.

2. The ZEB1/miR-200c feedback loop regulates invasion via actin interacting proteins MYLK and TKS5 / V. Sundararajan, N. Gengenbacher, M.Stemmier et al. // Oncotarget. - 2015.- Vol. 6(29). - Р. 27083-27096.

3. Wenchao Н. Myosin Light Chain Kinase Is Involved in the Mechanism of Gastrointestinal Dysfunction in Diabetic Rats / H. Wenchao, F. Ping // Digestive Diseases and Sciences. - 2012. - Vol. 57(5). - Р. 1197-1202.

4. Caveolin-1-dependent occludin endocytosis is required for TNF-induced tight junction regulation in vivo / A. Marchiando, L. Shen, W. Graham et al. // J. Cell Biol. - 2010. - Vol. 189(1). -- Р. 111-126.

5. Wray S. Insights from physiology into myometrial function and dysfunction / S. Wray // Experimental physiology. - 2015. - Vol. 100(12). -Р.1468-1476.

6. Фосфорилирование миозина как основной путь регуляции сокращения гладких мышц / А. Воротников, О. Щербакова, Т. Кудряшова и др. // Российский физиологический журн. им. И.М.Сеченова. - 2009. - Т. 95(10). - С. 1058-1073.

7. Yue Z. Controlled drug delivery systems based on calixarenes /Z.Yue, L. Hui, Y. Ying-Wei // Chinese Chemical Letters. - 2015. - Vol.26(7). - Р.825-828.

Reference

1. Hapchaev A., Shirinskiy V.Myosin light chain kinase mylk1: anatomy, interactions, functions and regulatory mechanisms. Uspehi biologicheskoy himii. 2016; 56:211-258.

2. Sundararajan V., Gengenbacher N., Stemmler M., Kleemann J., Brabletz T., Brabletz S.The ZEB1/miR-200c feed back loop regulates invasion via actin interacting proteins MYLK and TKS5. Oncotarget.2015;6(29): 27083-27096.

3. Wenchao H., Ping F.Myosin Light Chain Kinase Is Involved in the Mechanism of Gastrointestinal Dysfunction in Diabetic Rats. Digestive Diseases and Sciences. 2012; 57(5): 1197-1202.

4. Marchiando A., Shen L., Graham W., Weber C., Schwarz B., Austin J., Raleigh D., Guan Y., Watson A., Montrose M., Turner J. Caveolin-1- dependent occludin endocytosis is required for TNF-induced tight junction regulation in vivo. J. Cell Biol.2010; 189(1): 111-126.

5. Wray S.Insights from physiology into myometrial function and dysfunction. Experimental physiology.2015; 100(12): 1468-1476.

6. Vorotnikov A., Scherbakova O., Kudryashova T., Tarasova O., Shirinskiy V., Pfittser G.,Tkachuk V. Myosin phosphorylationas the main pathway for there gulation of smooth muscle contraction. Rossiyskiy fiziolog- icheskiy zhurnal. I.M.Sechenova. 2009; 95(10): 1058-1073.

7. Yue Z., Hui L., Ying-Wei Y.Controlled drug delivery systems based on calixarenes. Chinese Chemical Letters.2015; 26(7): 825-828.

Аннотация

А. Заремба, студ. Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, Украина,

М. Платонов, канд. биол. наук. Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, Украина

Нарушение функциональной активности гладких мышц человека связывают с большим количеством патологических состояний человеческого организма. Киназа легких цепей миозина является ключевым ферментом сигнального каскада передачи нейрогуморальных сигналов в гладкомышечных клетках. Особенно важна ее роль в длительном тоническом сокращении. Нарушение её киназной активности способно привести к ослаблению межклеточного взаимодействия эпи- и эндотелиоцитов, нарушению работы гладких мышц кишечника и сосудов, осложнению родовой деятельности.

Такие вещества требуют адаптеров (переносчиков), лишенных этих недостатков и инертных invivo. Наиболее перспективными являются каликсарены.